DNAを用いた細胞のシンプル、手頃な価格、モジュール式パターニング

このプロトコルは、高精度で、カスタム試薬や高価なクリーンルーム機器を使用せずに、2Dと3Dのパターンセルを可能にします。 図 1 は、プロトコルの概要を示しています。まず、DNA機能化スライドはフォトリソグラフィを用いたものです。次に、セルに CMO のラベルが付けられます。その後、細胞はスライド上に流れ、そこでスライドのDNA機能領域にのみ接続します。余分な細胞が洗い流された後、細胞の所望のパターンが明らかにされる。これらの細胞は、スライド上で培養するか、DNaseを含むヒドロゲルに埋め込んで、3D細胞培養のためにスライドから転送することができる。 CMOを使用した細胞のラベリングにより、DNAパターンスライドへの付着が可能になります(図2)。まず、コレステロール修飾ユニバーサルアンカーストランドは、アダプタストランドと事前ハイブリダイズされます。次に、ユニバーサルアンカー+アダプタソリューションをセルサスペンションと1:1混合します。ユニバーサルアンカー+アダプタ複合体のコレステロールは、細胞膜に挿入します。ユニバーサルアンカーストランドとハイブリダイズするコレステロール修飾ユニバーサルコアンカーストランドの添加は、複合体26のネット疎水性を高めることによって細胞膜中のCMO複合体の安定性を向上させる。細胞懸濁液から余分なDNAを洗浄した後、細胞はスライド上に流される。アダプター・ストランドと表面DNAストランドのハイブリダイゼーションにより、スライドのDNAパターン領域に細胞が付着します。 細胞のパターンは、アルデヒド修飾ガラススライド29 の特定領域へのアミン修飾DNAオリゴの付着を制限するフォトリソグラフィ法を用いて作成される(図3A)。正のフォトレジストは、アルデヒド機能化スライド上にスピンコートされる。透明フォトマスクがスライドの上に配置され、スライドが UV ライトに露出します。開発後、UV光にさらされたスライドの領域は、もはやフォトレジストでコーティングされず、アルデヒド基を露出している。アミン修飾DNAオリゴの20 μM溶液をスライドに落とし、パターン化された領域をカバーするために広げます。ベーキングに続いて還元的アミノ化は、アミン修飾DNAとスライド間の共有結合をもたらす。驚くべきことに、このプロセスは、以前にパターン化されたオリゴの機能性を損なうことなく、複数のオリゴをパターン化するために繰り返すことができます(図3B)。しかし、パターンの重複を避けるために注意が必要です, それは減少濃度で両方のオリゴの存在になります (補足図 3).複数のセルの集団は、モジュールドメイン(3’の端に最も近い20のベース)で異なるアダプタストランドを使用して、順番にパターン化することができます。 このフォトパターニングプロトコルは、クリーンルームの文脈でシャイドラーらによって開発されましたが、化学発煙フード内に簡単に収まる安価な「自家製」フォトリソグラフィーセットアップで同様の結果を達成することが可能であることを実証しました。セットアップには、DCモーター、デジタルコントローラ、CDケーキボックスで作られた400ドルのスピンコーターと、個々のコンポーネントから組み立てられ、転用されたシャープコンテナに収納されたUVランプが含まれています(補足図1)。自家醸造フォトリソグラフィーのセットアップの主な利点は、単一セルサイズの機能を作成しながら、非常に手頃な価格(すべての機器に対して< $1000)であることです。しかし、安価な機器の使用には限界があります – 例えば、マスクアライナーを使用せずに複数のDNAオリゴをパターン化するために受託者マーカーを正確に整列させることはより困難です。クリーンルームに便利にアクセスできないラボや、大きな投資をせずにこの方法を試してみたいラボでは、この安価なフォトリソグラフィーのセットアップをお勧めします。 DNAプログラムによる細胞接着の最適条件を特定するために、細胞表面上のDNA鎖の濃度を系統的に変化させ、DNA修飾ガラス表面への細胞接着効率を測定した。標識液におけるユニバーサルアンカー+アダプタストランドおよびユニバーサル共同アンカーの濃度は、数桁(図4A,B)にまたがって変化し、1細胞当たり104~106個のDNA複合体が得られた(補足図4)。細胞接着は用量依存性であり、細胞が0.05μM以下の濃度でCMOで標識されたときのDNAパターンへの接着は最小限で、濃度は2.5μM以上で高い占有率であった。そのため、ユニバーサルアンカー+アダプタストランドの2μMソリューションとユニバーサル共同アンカーの2μMソリューションを使用しました。ガラス表面に使用されるDNAの量が29減少した場合、またはアダプタストランドと表面ストランドの間の不一致が増加した場合、細胞接着も減少すると予想されます。アダプタ ストランド シーケンス設計の詳細については、「補足ファイル 2」を参照してください。CpG反復を伴わないアダプタストランドを用いたCMO標識は、マウスTLR9を発現するHEK細胞においてTLR9を刺激しなかった(補足図5)。 改訂されたプロトコルが再現可能で効率的なDNAプログラム細胞接着を提供するいくつかのデモンストレーションを行います。例えば、MMOで標識されたヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)は、DNAパターンに高効率で付着した。CMO ラベル付きの HUVEC と LMO ラベル付き HUVEC が付着しています (図 5A)。 CMO-DPACを使用してパターン化された細胞は、その生存率と機能性を保持した。CMOで標識された細胞は、生存率を評価するためにカルセインAMおよびエチジウムホモジマーによって染色された(補足図6)。非標識対照細胞と比較して生存率の差は小さかった(94%対97%)。CMO-DPACを介してパターン化され、Matrigelに移された単一のMDCKは、培養5日後に増殖し、正しく偏光することができました(図5B)。DPAC はまた、セルのパターンを第 3 次元に詳細化する手段も提供します (図 5C)。たとえば、多層的な多細胞集合体は、相補的なCMOで標識された細胞の層を交互に作成することができる(図5C)。これらの実験は、プロトコルが再現可能であり、細胞の生存率や機能性に悪影響を及ぼさず、3D ECMの単一のイメージングプレーン内で正常に培養できる細胞パターンを生み出す。 直交DNA配列を提供して細胞接着を指示することで、DPACは単一の表面上で複数の細胞タイプをパターニングする手段を提供します。DPACのこの特徴を実現するには、フォトリソグラフィによって生成されたDNAパターンを互いに整列させる必要があります。スライド上に堆積した金属受託マーカーは、複数のフォトマスクの整列を可能にし、したがって、複数の細胞タイプのパターニングを一度に可能にする。異なるユニークな染料で染色されたMCF10Asは、直交CMOでラベル付けされ、UCバークレーとUCSFのロゴの視覚化を作成するためにパターン化されました(図6)。この実験は、複数のユニークな細胞集団を高精度で、クロスコンタミネーションなしでパターン化できることを実証した。 CMO-DPACを用いた細胞のパターニングに成功するには、高品質のフォトリソグラフィ、細胞表面上のオリゴの十分な濃度、パターン上の細胞の高密度、および十分な洗浄が必要です。これらのいずれかのステップの失敗は、最終結果に影響を与えます。 補足図2 は、正しいフォトリソグラフィーと誤ったフォトリソグラフィーの画像例(補足的な図2A)、完全に占めるパターンを作成するためのパターン上の望ましい細胞密度(補足図2B)、DPACの後続のステップ中に過度に活発なピペット形成によるパターン化細胞の喪失(補足図2C)、および細胞の望ましくない束(補足図2D)を含む。 表 1 に、一般的な障害ポイントと推奨されるトラブルシューティングの一覧を示します。蛍光相補オリゴの使用は、スライド上のパターン化されたDNAの存在とフローサイトメトリーによる細胞表面上のCMOの存在を確認するためのトラブルシューティング用のツールとして推奨されます(プロトコルのステップ8を参照)。 図1: CMO-DPAC プロトコルの概要 まず、アルデヒド機能化ガラススライドに正のフォトレジストを塗布し、透明マスクで所望のパターンで覆い、UV光に曝すことで、DNAパターン化されたスライドを作成します。UV露光フォトレジストは現像者と一緒に洗い流され、アルデヒドスライドの露出領域を残し、アミン機能化されたDNAの表面への結合を可能にする。その後、セルにCMOのラベルが付き、サーフェス上を流れます。細胞膜上のDNAは表面のDNAにハイブリダイズし、接着を生じる。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図2:ステップワイズプロセスでセルにCMOのラベルが付いています。 まず、コレステロール修飾ユニバーサルアンカーストランドは、アダプタストランドと事前ハイブリダイズされます。次に、ユニバーサルアンカー+アダプタソリューションをセルサスペンションと混合します。ユニバーサルアンカー+アダプタ複合体のコレステロールは、細胞膜に挿入します。インキュベーション後、コレステロール修飾ユニバーサル共同アンカーストランドを細胞懸濁液に加え、ユニバーサルアンカーストランドとハイブリダイズし、細胞膜に挿入します。第2コレステロール分子の添加は、DNA複合体のネット疎水性を増大させ、膜26内で安定化させる。過剰なDNAを洗浄した後、細胞を濃縮し、パターン化された表面の上にPDMSフローセルに添加する。アダプター・ストランドの3’末端は、ガラススライド上の表面DNAストランドとハイブリダイズし、相補DNAで機能する領域でスライドに特異的に接着します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図3:細胞の配置を最終的に指示するDNAパターンスライドを作成するためにフォトリソグラフィを使用する。 (A) フォトリソグラフィプロセスの概要アルデヒド機能化スライドは、正のフォトレジストでスピンコートされています。UV光は、透明な透明なフォトマスクを通してスライドに光を当てます。スライドが開発された後、以前にUV光にさらされていた領域は、現在、アルデヒド基を露出しています。アミン機能化されたDNAオリゴの20 μM溶液をスライドに落とし、パターン化された領域に広げます。スライドは、次いで、アミンとアルデヒド基との間にシフ結合(C=N)の形成を誘導するために焼成され、可逆的な共有結合29である。その後、PBS中の0.25%のホウ水素ナトリウムを用いた還元的アミノ化は、還元的アミノ化によってシッフ塩基を二次アミンに変換し、DNAとスライド間の不可逆的結合をもたらす。残りのフォトレジストは、アセトンでリンスすることにより除去することができる。(B)このプロセスを繰り返して、複数成分DNAパターンを作成し、複数の細胞集団を用いて実験を行うことができる。(i)最初のオリゴがパターン化された後、スライドは再びフォトレジストでコーティングされ、プロトコルは以前のように進行する。複数のDNA鎖をパターニングするには、受託者マーカーを用いたフォトマスクのアライメントが必要である。(ii) パターン化される各セルタイプは、アダプタストランドの20ベースモジュラードメインで異なります。補体オリゴの直交セットを使用することにより、複数の細胞タイプを交差接着なしでパターン化することができます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図4:標識時のCMO濃度の関数として、CMO標識細胞のDNAパターンへの接着性が高まる。この実験では、ユニバーサルアンカー+アダプタストランド(プレハイブリダイズ)とユニバーサル共同アンカーを等濃度で使用しました。濃度は、細胞のCMO標識中の細胞懸濁液中のCMOの濃度をいう。(A)CMO標識MCF10A細胞が細胞標識中にCMO濃度の関数として占めていた直径15μmのDNAスポットの割合を定量化する。3つの実験から標準偏差±平均として表されるデータ。(B)CMOの異なる濃度でDNAパターン(マゼンタ)およびMCF10As(シアン)を接着した代表的な画像。スケールバー= 100 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図5:CMO-DPACを使用して、培養用の3次元ヒドロゲルに埋め込んだり、層構造を作成したりできる2次元細胞パターンを作成できます。(A)CMO標識ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)とLMO標識HUVECとの直接比較が、線形DNAパターンに付着した。細胞標識の両方の方法は、DNAパターンのほぼ100%の占有率をもたらす。(B)H2B-RFPを発現する単一のマダン・ダービー・カイン・イングネル細胞(MDCK)を、直径15μmのスポットに200μm離してパターン化し、その後マトリゲルに埋め込んだ。120時間の培養後、得られた上皮嚢胞を固定し、Eカドヘリン、アクチン、およびコラーゲンIVについて染色した。白いボックスの回転楕円体を詳細に示します。スケールバー= 50 μm(C) 多層セル構造は、相補的なアダプタストランドを使用して個別のセル集団にラベルを付け、セルの新しい追加がそれ以前のセル層に付着するようにシーケンシャルにパターニングすることによって作成できます。(i) 多層構造を作成するための細胞集団のシーケンシャルなパターン化の概略。(ii)MCF10Asの3層細胞集合体(色素を用いて可視化)を、このプロセスを用いて作成した。スケールバー= 50 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図6:複数の細胞タイプは、交差汚染や接着性の喪失なしにパターン化することができます。 複数のアミン修飾DNAオリゴをアルデヒドスライドに順番にパターン化し、金属受託マーカーを使用して整列させた。MCF10A(シアン、マゼンタ、イエロー)の3つの集団は、相補的なCMOでラベル付けされたユニークな染料で染色され、スライドにパターン化され、UCバークレーとUCSFのロゴの画像が得られました。スケールバー 1 mm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 補足図1:ベンチトップフォトリソグラフィの設定例(A)スピンコーティングの前に、正のフォトレジストで覆われたスピンコーターのスライド。(B) 透明フォトマスクの画像。(C)露光時にフォトマスクはフォトレジストコーティングスライドとガラスディスクの間に挟まれ、UVランプ用ハウジングは、再利用されたシャープ容器から作られた。(E) 開発者向けソリューションに浸漬されたスライド。(F)スライドを開発。(G)アミン修飾DNA溶液がスライドのパターン化された領域に広がる。(H) スライドのパターン化された領域の上に配置された PDMS フロー セル。  このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足図 2: このプロトコルの一般的な障害の例。 (A) (i) 露光後の UV 露光または過剰開発機能の前に焼き小さい焼き上げは、エッジがギザギザで、サイズが不規則なフィーチャになる可能性があります。(ii) フィーチャの周囲にエッジがクリーンで、均一なフィーチャ サイズ、パターンに明らかな亀裂がない、正しいフォトパターンスライドの例。スケールバー= 50 μm(B)細胞密度はパターニング効率にとって重要です。顕微鏡下でパターンの上の細胞を観察する場合、左側の例の画像で証明されるように、細胞間に隙間はほとんど存在しないはずです。スケールバー = 50 μm(C) パターン化された細胞は、過度に激しいピペット処理から生じる流体力に敏感であり、パターン化された細胞を損傷して取り除くことができます。多層セル集合体は、最下部の 1 つのセルが複数のセルの構造をサポートしているので、特に脆弱です。(i) マトリゲルに正常に埋め込まれたセル集合体の配列。(ii) 粘性マトリゲルを激しくピペット化した結果として外れた細胞凝集体のグリッド。(D) 細胞の凝集は、特に上皮細胞で起こり得る。これらの塊は通常、均質であるが、細胞が特に粘着性である場合、異質であり得る(既に異なるタイプのパターン化された細胞に付着した細胞)。画像は、MCF10Aの3つの異なる集団を、3つの異なる単細胞サイズのDNAスポット(15μm)で構成されるアレイにパターン化したことを示しています。ほとんどのDNAスポットには2〜4個の細胞が付着しています。凝集は、EDTA処理によって、またはパターン化する前に束をフィルタリングすることによって解決することができる。スケールバー= 100 μm  このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足図3:重なり合うフォトパターンは、濃度が低下した場合に両方のオリゴの存在を生じる。 2つの直交アミン修飾オリゴを連続してフォトパターン化し、最初に垂直線(ストランド1)、それに重なる水平線(ストランド2)を続けた。オリゴを蛍光相補オリゴとのハイブリダイゼーションにより可視化した。(A)ストランド1の蛍光画像。(B)重なり合う100μm垂直線上のストランド1の蛍光プロファイルの定量化。(C)ストランド2の蛍光画像。(D)重なり合う100μm水平線上のストランド2の蛍光プロファイルの定量化。スケールバー= 50 μm  このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足図4:CMO標識濃度の関数としての細胞表面上のDNA複合体の定量化。 ハベックスは、異なる濃度のCMO溶液で標識し、洗浄し、次いで蛍光相補鎖でインキュベートした。MESF(等価可溶性フルオロクロムの分子)ミクロスフェアキットを使用して、定量的フローサイトメトリーを行い、標識中のCMO濃度の関数として細胞表面上のDNA複合体の数を推定しました。  このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足図5:CMO標識はTLR9応答を刺激しない。 CMO標識がTLR9のDNA検出メカニズムを引き起こすかどうか、そしてこれがアダプタストランド配列のCpGの影響を受けるかどうかを調べる実験を行った。マウスTLR9を発現するHEK細胞は、ODN 1826(CpG含有TLR9アゴニスト)、CMOユニバーサルアンカー+ユニバーサルコアンカー+アダプタストランド(ODN 1826(CMO-CpG)、またはCMOユニバーサルアンカー+ユニバーサルアンカー+ユニバーサルコアンカー+アダプタストランドの0.2 μMで一晩インキュベートしました。TLR9刺激はSEAP(分泌された胚性アルカリホスファターゼ)の産生をもたらすであろう。SEAP分泌は、色測定アッセイ(吸光度)によって定量した。治療条件は、PBSのみで処理した安静細胞と比較した。CMO-GPCによるインキュベーションはTLR9発現を刺激しなかった。CMO-CpGによるインキュベーションは、静止細胞よりもわずかに高いが、ODN-1826よりもはるかに低かった。  このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足図6:CMO標識処理後の細胞の生存率プロトコルが生存率にどのような影響を与えるかを評価するために、HUVECは4つの集団に分かれました:1つは氷の上に1時間残り、1つはPBSで模擬標識されましたが、それ以外のすべての遠心分離機と洗浄ステップを通して撮影され、1つはCMOでラベル付けされ、1つはCMOでラベル付けされ、40 μmのフィルターを通して塊を除去しました。次に、カルセインAMおよびエチジウムホモジマーで細胞を染色し、生細胞および死細胞の数を評価した。すべての治療は氷の制御(Tukeyポストホック分析を用いた一方のANOVA)よりも有意に生存率を低下させたが、CMO標識(フィルタリングの有無にかかわらず)の生存率の中央値は約94%であった。3つの独立した実験から収集されたデータ。* = p < 0.05.= p < 0.0001   このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 結果 考えられる原因 推奨される修正 フォトリソグラフィー – 特徴がひび割れている 一貫性のない、または不十分なソフトベーク ソフトベークの時間を3分まで増やします。ホットプレートの実際の温度を確認し、必要に応じて温度を上昇させる フォトリソグラフィ – 特徴は鋭くないか、それらの中に残っているフォトレジストを持っています 開発不足 スライドが開発者ソリューションに費やす時間を増やします。穏やかな攪拌を組み込む フォトリソグラフィー – スライド全体で一貫性のない機能 UVライトが中心になっていないか、適切に焦点を合わせていない可能性があります UVライトの設定を調整して、均一な強度のコリメート光を確保 細胞は高効率のパターン化された斑点に付着しない 表面に十分なDNAがない 蛍光相補オリゴでスライドをハイブリダイズし、顕微鏡でイメージングすることにより、DNAが表面に存在することを確認します。 細胞はCMOで不十分に標識される 細胞懸濁液に蛍光相補オリゴを加え、フローサイトメトリーを介して蛍光を確認する パターンの上に十分なセルがありません PDMSフローセル、遠心分離機から洗浄して細胞を回収し、より低い体積で再中断して細胞を濃縮する 細胞懸濁液に残り過ぎるCMO、スライド上のDNAとのハイブリダイズ 別の洗浄ステップを追加します。洗い物ごとにできるだけ多くの上清を取り除くようにしてください。 時間と温度によるCMOの内部化が多すぎる CMO でセルにラベルを付けた後、すばやく作業します。細胞を保持し、氷の上にスライドし、氷冷試薬を使用する 細胞の束 トリプシン化中に細胞が十分に分離されなかった 細胞のすすがみで PBS + 0.04% EDTA を使用します。最終洗浄前に35 μmフィルターを通過するセル懸濁液 細胞は非特異的に付着する 特定の領域に – スライドの傷、PDMSフローセルのずれ、またはパターン領域外のDNAの流出が原因である可能性がある場合 傷を避け、PDMSフローセルをパターン領域に合わせるのに注意してください 細胞がどこにでも付着している場合 – 不十分なブロッキングまたは洗浄 細胞をパターン化した後、より多くのするしを追加します。洗浄中に、より精力的にピペット;細胞のパターニングを開始する前に、より長い1%BSAでブロックします。シラナイズスライド(オプションのステップ3)または水滴の接触角を測定することによって、シラナイゼーションが成功したことを確認 フローセル内の泡フォーム ピペット化誤差、プラズマ酸化中に生み出される不均一な親水性表面 気泡が小さい場合は、フローセルの入口にPBSを加え、洗浄してもよい。気泡が大きい場合は、PDMSフローセルに穏やかな圧力をかけ、入口または出口に向かって気泡を引き寄せます。 細胞は最初はパターンに付着するが、他の細胞タイプのパターニング、またはヒドロゲル前駆体の追加中に除去される あまりにも激しくピペットからのせん断力は、細胞が表面から剥離する可能性があります その後の打ち上げ、細胞のパターニングのラウンド、またはヒドロゲル前駆体の追加中に、より穏やかにピペット。ヒドロゲル前駆体は粘性があるため、パターンが外れる可能性が高いため、特に注意してください。多層構造は、トップヘビーになる傾向があり、外れやすくなります。 3D転送中の組織変形 ハイドロゲルはスライドに固執する 接触角度測定を用いたスライドの疎水性の確認 かみそりブレードを使用してPDMSを両エッジに完全に持ち上げ、PBSが組織の下に浮かべるようにする これは純粋なコラーゲンヒドロゲルで起こり得る – ヒドロゲルのタンパク質濃度または組成を調整することを検討してください 細胞はヒドロゲルと一緒に移動しないし、スライドに残る ターボDNAse濃度を増加させるか、インキュベーション時間を増加させる ヒドロゲルは十分に固い 問題のヒドロゲルのインキュベーション時間および/またはゲル化機構を増加させる(例えば、コラーゲンの場合、pHが正しいことを確認してください) PDMSを取り除く時のヒドロゲルの涙 実験を開始する前に、実験を開始する前に、PDMSフローセルを親水性にして、メディアを添加する際に容易に取り外されるようにします。PDMS を取り外すには、フォースを非常に穏やかに使用してください。 表 1: このプロトコルから発生する可能性のある障害を特定し、解決するためのトラブルシューティング ガイド。 特に、パターンに対する細胞の接着性が悪いと、多くの根本原因が考えられる可能性があり、このガイドは、これらの問題の特定と解決に役立つはずです。 補足ファイル 1.このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足ファイル 2.  このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足ファイル 3.このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足ファイル 4.このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。