Detta manuskript beskriver en metod för riktad leverans till en enda njure via en kateter placerad i den infrarenala buken aortan i musen.
Det finns ett behov av riktade injektioner för att möjliggöra ökad och specifik njurexponering för effektiv utvärdering av läkemedelsmålen inom njurforskningsområdet. Ackumulering av läkemedel i vissa organ kan ge upphov till negativa och oönskade effekter, beroende på injiceras natur. För att minimera spridning och/eller ackumulering i andra vävnader leder den häribeskrivna metoden formuleringen i njurartärens blodomlopp genom att föra in en kateter i den infra njuraorta, strax under där den förgrenar sig i njurartären, vilket resulterar i njuren som först nått organ och distribution av formulering i hela njuren.
Detta manuskript ger en detaljerad beskrivning av metoden, liksom dess utmaningar och svårigheter. Den vägleder experimenteraren att bli skicklig med denna typ av mikrokirurgi som kräver noggrannhet under sterila förhållanden. Hastighet är avgörande för att minimera ischemin och att öva förfarandet kommer att öka risken för framgångsrika injektioner utan negativa effekter. Genom att modulera tiden mellan injektion och reperfusion samt den injicerade volymen minskar risken för spridning till andra organ.
Observera att den här tekniken är lämplig för strategier för enkel dosering.
Inom det prekliniska forskningsområdet inom läkemedelsindustrin är modell- och metodutveckling en del av det dagliga arbetet. Det finns ett ökande intresse för förmågan att rikta läkemedel till specifika organ, eller till och med separata avdelningar i ett organ, utan större spridning/ infällning, via blodomloppet, i andra vävnader. Detta för att möjliggöra ökad och specifik exponering för effektiv utvärdering av läkemedelsmål i modeller av olika sjukdomsområden 1,2,3,4.
Ett vanligt sätt att leverera ämnen är genom systemiska vägar (t.ex. via svansvenen) eftersom det är mindre invasivt än den metod som beskrivs i detta manuskript. Systemisk administrering ökar dock risken för ökad metabolism eller ackumulering av föreningen i andravävnaderän det avsedda målorganet, när man passerar genom filtreringsorgan som lungan, levern och mjälten 2,3,5. Bortsett från att inte nå den avsedda vävnaden kan detta potentiellt ge upphov till negativa och/eller oönskade effekter, beroende på injiceras natur. Endast mycket små molekyler passerar kapillärerna i filtreringsorgan och därför är riktad leverans särskilt viktig om man arbetar med större molekyler 6.
För att minimera spillover och/eller ackumulering av injicerad formulering, i andra vävnader, leder den härin beskrivna metoden formuleringen in i njurartärens blodomlopp genom en kateter som sätts in i bukaortan strax under där den förgrenar sig i njurartären, vilket resulterar i njuren som först nått organ. En annan fördel med denna guidade administrering är att en lägre dos/volym kan användas för att uppnå samma exponeringsnivå som uppnås genom systemisk administrering 3.
Andra administreringsvägar har undersökts, till exempel injektioner via en kateter direkt i njurartären. I våra händer konstaterades detta utgöra en högre risk för underlåtenhet att återställa cirkulationen till njuren. Njurartärens mycket lilla diameter (ca 0,35-0,55 mm i diameter) gör snittet relativt stort och utgör en risk för obstruktion och/eller emboli vid stängning av ingångshålet. Enligt vår erfarenhet inträffade ofta skandinaviska skador på njuren när vi använde denna metod, och vi utvecklade därför detta nya sätt att framgångsrikt rikta in njuren genom att injicera ämnen genom snitt av den större stora aortan för att rikta in njuren.
Det finns liknande tekniker som utvecklas hos råttor som också manifesterar utmaningarna och risken för stenos / trombos som arbetar med injektioner direkt i njurartären 5. Detta stöder våra resultat eftersom kärlen hos möss är ännu mindre.
Detta manuskript och video beskriver i detalj hur injektioner kan riktas in i njurartären hos möss genom en kateter som sätts in i den infrarenala aortan, samt vägledning i hur man kan övervinna vanliga svårigheter i förfarandet, att arbeta på säkrast möjliga sätt och därmed öka reproducerbarheten.
Denna metod har lyckats leverera formuleringar till njuren utan att orsaka njurskador. Det kan användas för leverans av alla typer av formuleringar (t.ex. små molekyler, stam-/stamceller eller mikrovesicles). Metoden kan tillämpas på friska djur eller i njursjukdomsmodeller.
I figur 2 och figur 3presenteras histologin. Figur 2 visar histologi 180 minuter efter perfusion medan figur 3 visar historien 7 dagar efter infusionen. Anledningen till detta är att experimenten med njurartären bara var 180 minuter långa. För att vara säker på att vi inte hade några kroniska skador med denna nya metod väntade vi avsiktligt 7 dagar för att utvärdera dem. N-numret är litet men det här är bara ett exempel.
Observera att denna nyutvecklade metod för aorta administrering för att rikta njuren är en invasiv metod med relativt låg genomströmning och är lämplig för enstaka dosering strategier endast. Upprepad dosering är inte möjlig med denna metod.
Med mindre justeringar av ligaturplaceringarna kan denna metod eventuellt användas för att ingjuta båda njurarna simultaniously5,7. Med den ökade risken för spridning genom aorta förgrening bestämde vi oss för att hålla den ocklusion ligaturen så nära njuren som möjligt, vilket leder injektionen till vänster njure endast. Det kan också användas utöver andra modeller eller tekniker som uninephrectomy eller kanske även samtidig njurlymfknutor ischemi reperfusion skada (IRI). Enligt vår mening, att göra injektionen bara 24 timmar efter IRI3 kirurgi är för hård och kommer att påverka djurets återhämtning avsevärt.
När man använder nya stammar av möss bör man alltid utföra ett pilotförsök på vissa djur från den stammen för att säkerställa att metoden inte behöver justeras på något sätt. I vissa stammar kan till exempel kärlets förgrening från aortan placeras lite annorlunda. Ligaturens position kan ändras något för att säkerställa att formuleringen hamnar på rätt plats.
Uttorkning
Att öppna bukhålan utgör en stor risk för uttorkning. Det är därför absolut nödvändigt att tillsätta vätskor (cirka 37 °C) både under och efter operationen för att säkerställa god grund för återhämtning efter operativt. Vi brukar ge 1 ml/möss s.c. efter operationen.
Ischemi
Förlängd operationstid eller om du inte når full recirkulation kommer det att resultera i ischemi. Det är viktigt att registrera den faktiska ischemitiden och se till att cirkulationen till njuren (och bakbenen) återställs. Ständig träning och uppfräschning av färdigheter är, som alltid, viktigt. Att utföra proceduren snabbare minskar den tid njuren utsätts för ischemi. Att hålla ischemitiden (ligering av aortan) till cirka 5 min (10 min max) har visat sig inte skada njuren.
Spridningseffekter
Med tanke på risken för spridning till andra organ när den injicerade formuleringen åter kommer in i cirkulationen genom njurvenen, bör den injicerade volymen hållas till ett minimum. Vi rekommenderar en maximal volym på 50 μL. Dosering har också visat sig, av andra, vara en kritisk faktor för effektivitet3.
Biverkningar (trombos och förlamning)
Inledningsvis när vi satte upp modellen upplevde vi icke-konsekventa problem med förlamning i bakbenen. Efter relevant dos av antikoagulantia (10 IE heparin i svans ven) preoperatively, minskade denna negativa effekt avsevärt. Efter att ha konsulterat experter inom området började vi också vara ännu mer försiktiga med att arbeta med atraumatisk kirurgi, vilket innebär att vi inte klämer i några vävnader och rör vid så lite områden som möjligt. Dessa åtgärder tillsammans minskade frekvensen av förlamning från cirka 50% till praktiskt taget ingen.
Ursprungligen under metodutveckling applicerade vi antikoagulantia vävnad på njurartären för att stänga snitthålet. Detta var inte möjligt när man gjorde injektioner i aortan eftersom trycket är så mycket högre i aortan. Antikoagulantia ökar också risken för trombos om det kommer in i kärlets lumen.
Se till att inte ha adventitia exponerad i aortans lumen när du suturing eftersom adventitia är mycket thrombogenic. Undvik också inverterande sårkanter eller förträngning av aortan genom att suturing till lår.
Vi har nu en etablerad metod för att leverera formuleringar direkt till njuren.
The authors have nothing to disclose.
Tack till René Remie på RRSSC för att ha hjälpt mig att finjustera tekniken och Instech-labben för samarbete med att producera en specialdesignad kateter. Ett stort tack också till alla kollegor på AstraZeneca FoU för produktiva diskussioner med tips och tricks samt Xerox för att slutföra videon med ljud.
Blunt hook 5mm 8/pack | Cooper surgical | 3316-8G | |
ETHILON Nylon Suture 11/0 | Ethicon | W2881 | For vessel |
Microsurgery forceps curved | Karo Pharma | FRC-15 RM-8 | |
Microsurgery forceps straight | Karo Pharma | FRS-15 RM-8 | |
Mouse renal artery cannula, 3mm 32ga stainless steel, 10cm 2Fr PU, fits 25ga | Instech | C07SS-MRA1813 | |
Vicryl, 6-0, BV-1 needle | Angthos | W9575 | For abdominal cavity |