JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Bioquímica

Derivatização de Cristais de Proteína com I3C usando Triagem de Matriz Microseada Aleatória

Published: January 16, 2021
doi:
10.3791/61894
, , ,
1School of Biological Sciences,The University of Adelaide, 2Institute of Photonics and Advanced Sensing (IPAS), School of Biological Sciences,The University of Adelaide

Summary

Este artigo apresenta um método para gerar cristais proteicos derivados com I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic ácido) utilizando microseeding para gerar novas condições de cristalização em telas de matriz esparsas. As bandejas podem ser configuradas usando robôs de distribuição de líquidos ou à mão.

Abstract

A elucidação da estrutura proteica usando cristalografia de raios-X requer cristais difusores de alta qualidade e solução computacional do problema da fase de difração. Novas estruturas que não possuem um modelo de homologia adequado são frequentemente derivadas com átomos pesados para fornecer informações de fase experimental. O protocolo apresentado gera eficientemente cristais de proteína derivatizadas, combinando triagem de matriz de microseedação aleatória com derivatização com uma molécula atômica pesada I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid). Ao incorporar i3C na rede de cristal, o problema da fase de difusão pode ser resolvido eficientemente usando uma dispersão anômada de comprimento de onda único (SAD). O arranjo do triângulo equilátero dos átomos de iodo em I3C permite a validação rápida de uma subestrutura anômala correta. Este protocolo será útil para biólogos estruturais que resolvem estruturas macromoleculares usando técnicas baseadas em cristalografia com interesse em fase experimental.

Introduction

No campo da biologia estrutural, a cristalografia de raios-X é considerada a técnica padrão-ouro para determinar as estruturas de resolução atômica das macromoléculas. Tem sido amplamente utilizado para compreender a base molecular das doenças, orientar projetos racionais de desenho de drogas e elucidar o mecanismo catalítico das enzimas1,2. Embora os dados estruturais forneçam uma riqueza de conhecimento, o processo de expressão e purificação de proteínas, cristalização e determinação da estrutura podem ser extremamente trabalhosos. Vários gargalos são comumente encontrados que dificultam o andamento desses projetos e isso deve ser enfrentado para agilizar eficientemente o gasoduto de determinação da estrutura cristalina.

Após a expressão recombinante e purificação, devem ser identificadas condições preliminares propícias à cristalização, o que muitas vezes é um aspecto árduo e demorado da cristalografia de raios-X. Telas de matriz esparsas comerciais que consolidam condições conhecidas e publicadas foram desenvolvidas para aliviar esse gargalo3,4. No entanto, é comum gerar poucos hits a partir dessas telas iniciais, apesar de usar amostras de proteínas altamente puras e concentradas. Observar gotas claras indica que a proteína pode não estar atingindo os níveis de supersaturação necessários para nuclear um cristal. Para incentivar a nucleação e o crescimento cristalinos, as sementes produzidas a partir de cristais pré-existentes podem ser adicionadas às condições e isso permite maior amostragem do espaço de cristalização. Ireton e Stoddard introduziram pela primeira vez o método de triagem de matriz microseed5. Cristais de má qualidade foram esmagados para fazer um estoque de sementes e, em seguida, adicionados sistematicamente às condições de cristalização contendo diferentes sais para gerar novos cristais de qualidade de difração que não teriam se formado de outra forma. Esta técnica foi ainda melhorada por D’Arcy et al. que desenvolveram triagem de matriz microseed aleatória (rMMS) na qual as sementes foram introduzidas em uma tela de cristalização de matriz sobressalente6,7. Isso melhorou a qualidade dos cristais e aumentou o número de acertos de cristalização em média em um fator de 7.

Depois que os cristais são produzidos com sucesso e um padrão de difração de raios-X é obtido, outro gargalo na forma de resolver o ‘problema de fase’ é encontrado. Durante o processo de aquisição de dados, a intensidade da difração (proporcional ao quadrado da amplitude) é registrada, mas as informações de fase são perdidas, dando origem ao problema de fase que interrompe a determinação imediata da estrutura8. Se a proteína alvo compartilhar a identidade de alta sequência a uma proteína com uma estrutura previamente determinada, a substituição molecular pode ser usada para estimar as informações de fase9,10,11,12. Embora este método seja rápido e barato, as estruturas do modelo podem não estar disponíveis ou adequadas. O sucesso do método de substituição molecular baseado em modelo de homologia cai significativamente à medida que a identidade sequencial fica abaixo de 35%13. Na ausência de um modelo de ecologia adequado, podem ser testados métodos ab initio, como ARCIMBOLDO14,15 e AMPLE16. Esses métodos usam modelos ou fragmentos previstos computacionalmente como pontos de partida para substituição molecular. A AMPLE, que usa modelos de isca previstos como pontos de partida, luta para resolver estruturas de grandes proteínas (>100 resíduos) e proteínas que contêm predominantemente β-folhas. ARCIMBOLDO, que tenta encaixar pequenos fragmentos para se estender a uma estrutura maior, limita-se a dados de alta resolução (≤2 Å) e pela capacidade dos algoritmos de expandir os fragmentos em uma estrutura completa.

Se os métodos de substituição molecular falharem, devem ser utilizados métodos diretos como substituição isomorfo17,18 e dispersão anômal por um único comprimento de onda (SAD19) ou múltiplos comprimentos de onda (MAD20). Este é frequentemente o caso de estruturas verdadeiramente novas, onde o cristal deve ser formado ou derivado com um átomo pesado. Isso pode ser conseguido por imersão ou co-cristalização com um composto átomo pesado, modificação química (como incorporação de 5 bromouracil no RNA) ou expressão proteica rotulada (como incorporar aminoácidos de selenomethionina ou selenocisteína na estrutura primária)21,22. Isso complica ainda mais o processo de cristalização e requer triagem e otimização adicionais.

Uma nova classe de compostos de corte, incluindo i3C (5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid) e B3C (5-amino-2,4,6-tribromoisophthalic acid), oferecem vantagens emocionantes sobre compostos pré-existentes23,24,25. Tanto o I3C quanto o B3C apresentam um andaime aro aromático com um arranjo alternado de dispersões anômalas necessárias para métodos de eliminação direta e grupos funcionais amino ou carboxilato que interagem especificamente com a proteína e fornecem especificidade do local de ligação. O arranjo triangular equilateral subsequente de grupos de metais pesados permite validação simplificada da subestrutura de eliminação. No momento da redação, existem 26 estruturas vinculadas ao I3C no Banco de Dados de Proteínas (PDB), das quais 20 foram resolvidas utilizando o CED26.

Este protocolo melhora a eficácia do pipeline de determinação da estrutura, combinando os métodos de derivatização de metais pesados e triagem rMMS para aumentar simultaneamente o número de hits de cristalização e simplificar o processo de derivatização de cristal. Demonstramos que este método foi extremamente eficaz com a lise branca de ovo de galinha e um domínio de uma nova proteína de lise de bacteriófago P6827. A solução de estrutura usando o altamente automatizado pipeline de determinação da estrutura auto-riquixá é descrita, especificamente adaptada para o composto de eliminação I3C. Existem outros dutos automatizados que podem ser usados como AutoSol28,ELVES29 e CRANK230. Pacotes não totalmente automatizados, como SHELXC/D/E, também podem ser usados31,32,33. Este método é particularmente benéfico para pesquisadores que estão estudando proteínas sem modelos homólogos no PDB, reduzindo significativamente o número de etapas de triagem e otimização. Um pré-requisito para este método são cristais proteicos ou um precipitado cristalino da proteína alvo, obtido a partir de ensaios de cristalização anteriores.

Protocol

1. Planejamento experimental e considerações Use cristais pré-existentes da proteína de interesse, preferencialmente gerados através da cristalização de difusão de vapor. Para um protocolo generalizado de cristalização de difusão de vapor, consulte Benvenuti e Mangani34. Outros métodos de cristalização, como microbatch sob óleo e difusão de interface livre, exigirão a colheita dos cristais antes do esmagamento para gerar microseeds. Na preparação de um estoque de sementes, use os cristais da mais alta qualidade que podem ser sacrificados. O cristal de maior qualidade pode ser julgado visualmente com base na morfologia ou no melhor cristal diffracting pode ser selecionado, se esses dados estão disponíveis. É muito provável que cristais de melhor qualidade sejam obtidos após a otimização através da semeadura. No caso de não haver cristais disponíveis, precipitados cristalinos como esferulitos e agulhas podem ser usados. Identifique cristais de sal. Cristais de sal podem crescer em telas de cristalização e podem parecer cristais de proteína. O uso de cristais de sal na RMMS não trará nenhum benefício e desperdiçará amostras preciosas, por isso é importante eliminar os falsos positivos do sal. Cristais de sal são barulhentos quando são esmagados. Os cristais devem ser esmagados para gerar um estoque de sementes, por isso essa estratégia é particularmente relevante. Se um som de crack audível for ouvido ao esmagar os cristais, é provável que o cristal seja sal. Se a proteína contiver resíduos de triptofano e tyrosina, use microscopia de fluorescência ultravioleta para identificar cristais proteicos que fluorescem sob essas condições de iluminação. Use corante Izit (azul metileno) para manchar cristais proteicos para diferenciá-los a cristais de sal que permanecem relativamente inalaturados. No entanto, este procedimento é mais destrutivo e só é recomendado se alguém tiver cristais de sobra de réplicas da mesma gota.NOTA: Embora os testes acima mencionados possam dar resultados promissores, os cristais de sal ainda podem ser confundidos com cristais proteicos. Neste caso, experimentos de difração podem ser usados para discernir definitivamente entre uma proteína e um cristal de sal. 2. Preparação do estoque de lítio I3C Meça 120 mg de I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid) em um tubo de microcentrifutura de 1,5 mL. Dissolver I3C em 200 μL de hidróxido de lítio de 2 M. A solução pode ser suavemente aquecida usando um bloco de calor a 40-60 °C para incentivar a dissolução. A solução I3C de lítio resultante deve ser marrom e tem uma concentração de 1 M.ATENÇÃO: O hidróxido de lítio é corrosivo. Óculos de segurança, luvas e um jaleco devem ser usados. Meça o pH da solução. Se necessário, adicione pequenas quantidades de ácido clorídrico de 1 M ou hidróxido de lítio de 2 M para ajustar o pH entre 7 e 8. Adicione água miliQ para fazer o volume final da solução para 400 μL. A concentração da solução de estoque I3C é de 0,5 M.NOTA: O passo 2.3 é opcional. O pH da solução deve estar entre pH 7-8 antes de qualquer ajuste de pH. Este passo deve ser realizado se a proteína de interesse for fortemente afetada pelo pH. O protocolo pode ser pausado aqui. O lítio I3C pode ser mantido no escuro a 4 °C por pelo menos duas semanas35. 3. Adição de I3C ao estoque de proteínas Método 1 Adicione o caldo de lítio I3C a uma alíquota de 150 μL da proteína alvo. A concentração final deve ser entre 5-40 mM de lítio I3C. Método 2 (método mais suave) Prepare um tampão de diluição proteica que corresponda ao tampão da proteína alvo. Para este tampão de diluição, adicione o estoque de lítio I3C para dar uma concentração de lítio I3C entre 10-80 mM. Diluir a proteína 1:1 com tampão de diluição proteica para dar uma concentração final de lítio I3C entre 5-40 mM.NOTA: Algumas proteínas precipitarão ao entrar em contato com altas concentrações de lítio I3C no método 1, enquanto outras proteínas podem tolerá-lo. O método 2 reduz a probabilidade de precipitação. No entanto, este método reduz pela metade a concentração proteica. Para proteínas que não possuem um protocolo de cristalização estabelecido, uma concentração proteica de 10 mg/mL é geralmente recomendada para a triagem inicial de cristalização. Recomenda-se uma relação molar inicial de I3C para proteína de 8. A concentração de proteínas e a razão molar de I3C para proteína podem ser otimizadas após a tela inicial. 4. Fazer um estoque de sementes Faça uma sonda arredondada para esmagar cristais. Com um bico bunsen na chama azul, aqueça uma pipeta Pasteur em direção ao seu meio. Usando uma pinça, puxe a extremidade da pipeta Pasteur para desenhá-la em um diâmetro fino de menos de 0,3 mm. Uma vez que a seção média esteja fina o suficiente, segure esse segmento na chama para separar a pipeta neste ponto e contornar a extremidade da pipeta para terminar a sonda de vidro.NOTA: Trituradores de cristal de sonda arredondada são vendidos por fornecedores de terceiros. Estas são uma alternativa para fazer sondas arredondadas. Coloque cinco tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL no gelo. Sob um microscópio leve, examine a bandeja de cristalização para uma condição adequada para gerar microcristais. Idealmente, bons cristais de morfologia são selecionados. No entanto, essa técnica também funciona com cristais de morfologia pobres, agulhas, placas, microcristais e esferulitos. Abra bem a bandeja de cristalização. Para 96 bandejas de cristalização bem seladas com plástico, use um bisturi para cortar o plástico selando o poço. Para pendurar bandejas de gota seladas com graxa, o deslizamento de tampa pode ser removido usando pinças e invertido em uma superfície uniforme. Transfira 70 μL de solução de reservatório para um tubo de microcentrífuga e esfrie-o no gelo. Aos outros tubos de microcentrifuuge, adicione 90 μL de solução de reservatório e retorne ao gelo para esfriar.NOTA: Se o reservatório não tiver volume suficiente ou não existir (no caso de microbatch sob óleo), crie reservatório de cristalização misturando os reagentes apropriados. Agitar o cristal na gota usando a sonda de cristal para esmagá-lo completamente. O cristal precisa ser completamente esmagado, que pode ser monitorado sob o microscópio. Retire todo o líquido da gota e transfira-o para o tubo de microcentrifutura com a solução do reservatório. Misture e, posteriormente, pegue 2 μL de mistura do tubo de microcentrífuga e adicione-o de volta ao poço. Enxágüe o poço com a solução e transfira-o para o tubo de microcentrifutura. Repita este passo de enxágüe mais uma vez. A partir deste ponto, mantenha o tubo de microcentrifuuge frio para evitar derreter as microseeds na mistura. Vórtice o tubo a velocidade máxima a 4 °C por 3 minutos, parando regularmente para esfriar o tubo no gelo para evitar superaquecimento.NOTA: Alguns protocolos de microseeding adicionam uma semente de politetrafluoroetileno ao tubo de microcentrifuge para ajudar a trituração de cristal7,36. Nós empregamos a técnica sem o uso de uma semente com sucesso, mas não vemos problemas em usar uma conta de adoz para esmagar cristais. Faça uma diluição de 1 em 10 seriais do estoque de sementes transferindo sequencialmente 10 μL entre as soluções de reservatório refrigerado. Armazenar estoques de sementes que não serão usados imediatamente a -80 °C. 5. Configuração de uma tela rMMS Configuração de uma placa de triagem de poços 96 usando um robô de distribuição de líquidos. Na ausência de um robô, uma pipeta multicanal também pode ser usada. Transfira 75 μL de um bloco de poços profundos para uma bandeja de cristalização de 96 poços. Adicione 1 μL à queda de cristalização e 74 μL ao reservatório. Transfira 1 μL de proteína suplementada com lítio I3C, feita na etapa 2, para a queda de cristalização. Transfira 0,1 μL de estoque de sementes para a queda de cristalização. Sele a placa com fita de vedação clara e incuba a placa a uma temperatura constante para permitir o crescimento do cristal. Configurando uma tela suspensa Unte as bordas dos poços de gota suspensa (as bandejas de cristalização de gota suspensa podem ser encontradas em 24 e 48 formatos de poço). Transfira a solução de cristalização de 500 μL para o reservatório. Perto do centro de um slide de tampa de vidro, coloque uma gota de 1 μL de proteína suplementada com lítio I3C, feita na etapa 2. Adicione 1 μL da solução de cristalização à queda. Transfira 0,1 μL de estoque de sementes para a queda de cristalização. Inverta o slide da tampa e sele bem a cristalização empurrando a tampa deslizar para dentro da graxa. Incubar a placa a uma temperatura constante para permitir o crescimento do cristal.NOTA: Com estoques de sementes novos e não testados, recomenda-se usar o estoque de sementes mais concentrado para maximizar as chances de obter acertos de cristalização. As condições subsequentes podem ser configuradas com concentração reduzida de sementes para otimizar o número de cristais. Inspecione bandejas de cristal sob um microscópio regularmente para o crescimento de cristais. Se os cristais tiverem qualidade suficiente, podem ser colhidos para coleta de dados. Cristais também podem ser usados para gerar novos estoques de sementes e novas telas rMMS para permitir a otimização iterativa. 6. Coleta de dados Colher cristais usando crioloops, crioproteto os cristais e resfriá-los em nitrogênio líquido. Para obter informações adicionais sobre cristais de resfriamento flash, consulte Teng37 e Garman e Mitchell38. Durante a fase de crioproteção, se o cristal for passado por uma nova solução aquosa, o I3C pode ser perdido do cristal devido à sualagem na solução de crioproteção. Use lítio I3C na solução de crioproteção em uma concentração que corresponda à condição de cristalização para mitigar isso. Cristais cultivados usando este protocolo foram crioprotegidos com sucesso usando o Crioprotetor à base de óleo Parabar 10312 (Hampton Research).NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui enquanto os cristais são armazenados em nitrogênio líquido.ATENÇÃO: O nitrogênio líquido pode causar queimaduras frias. O nitrogênio líquido também pode causar asfixia se usado em espaços fechados. Monte o cristal no goniômetro da fonte de raios-X e colete dados de difração usando o protocolo específico para a fonte de raios-X. Esta técnica se baseia em sinal anômroo de átomos de iodo em I3C. Assim, selecione a energia do raio-X para maximizar este sinal. Defina fontes de raios-X síncrotrons com energias o mais baixas possível. Para muitas linhas de cristalografia macromolecular, a menor energia configurável é de 8000 a 8500 eV. Fontes de raios-X do ânodo rotativo não podem ser sintonizadas. Fontes de ânodo comumente utilizadas com cobre têm a borda Kα a 8046 eV, o que fornece um bom sinal anômo para iodo (f” = 6,9 e). As fontes de ânodo com cromo têm uma borda Kα a 5415 eV, que fornece um grande sinal anômo para iodo (f” = 12,6 e). O dano por radiação é um problema significativo durante a coleta de dados, pois irá degradar o sinal anômeo39. Selecione o tempo de exposição e atenuação do feixe para obter a melhor difração, minimizando a dose de radiação.NOTA: Em um composto similar com os átomos de iodo substituídos por átomos de bromo, os danos causados pela radiação causam a radiolise da ligação bromo de carbono e uma redução na ocupação dos átomos de bromo24. Use a coleta de dados SAD do feixe inverso como estratégia de coleta. Os dados são coletados em cunhas, com cunhas opostas coletadas umas depois da outra. Isso permite que os pares friedel sejam coletados com uma dose equivalente, resultando em uma melhor medição do sinal anômo menos afetado por danos causados pela radiação. Por exemplo, uma estratégia de oito cunhas para coletar 360° envolveria a coleta dos dados na ordem da cunha 1 (0°-45°), cunha 2 (180°-225°), cunha 3 (46°-90°), cunha 4 (225°°-270°), cunha 5 (90°-135°), cunha 6 (270°-315°), cunha 7 (135°-180°) e cunha 8 (315°-360°).NOTA: A rotação contínua é uma estratégia alternativa de coleta à coleta de dados de feixe inverso. Para uma comparação recente das estratégias de coleta, consulte Garcie-Bonte & Katona40. 7. Solução de processamento e estrutura de dados Realize a redução de dados nos dados de difração usando o XDS41,com o objetivo de maximizar o sinal anômroo. Os parâmetros de entrada de redução de dados são específicos do conjunto de dados e podem exigir alguma tentativa e erro. Aqui estão algumas recomendações para começar. Definir a lei de Friedel=FALSO. Execute CORRETO duas vezes, definindo STRICT_ABSORPTION_CORRECT = TRUE e STRICT_ABSORPTION_CORRECT = FALSO. Uma corrida pode ter um sinal anômroo maior que o outro. Compare os sinais anômalos entre as corridas usando as disciplinas ‘Anomal Corr’ e ‘SigAno’ na saída. Isso fornece um indicador de qualidade dos dados. Execute SHELXC no XDS_ASCII. Arquivo HKL para uma indicação mais precisa de sinal anômroo. A disciplina ‘Ranom’ dará uma indicação do sinal anômroo em diferentes resoluções. Execute POINTLESS42 e AIMLESS43 para dimensionar os dados. Em SEM RUMO, coloque o parâmetro anômeo ligado. Se a GUI for usada, selecione a opção Separar pares anômalos para rejeição outlier e estatísticas de fusão. Testar diferentes cortes de resolução pode ser necessário para maximizar o sinal anômroo. Resolva a estrutura proteica utilizando o pipeline de determinação automatizada da estrutura de cristal Auto-Rickshaw44. Auto-Rickshaw tentará resolver o problema de fase e construir a estrutura cristalina da proteína automaticamente com modelagem de proteínas e software de refinamento. Para proteínas sem modelo de esmologia, execute o protocolo SAD de Auto-Rickshaw em Modo Avançado. Digite os parâmetros necessários. Selecione PROTEIN como o tipo de molécula. Digite o comprimento de onda de coleta de dados em angstroms (Å). Selecione “I” como elemento de subestrutura para indicar que foram usados átomos de iodo. Selecione “i3c” como tipo de subestrutura para indicar que I3C foi a molécula de eliminação. Selecione “sub_direct” como o método de determinação da subestrutura. Este método emprega SHELXD32 para procurar a subestrutura. Selecione “3” como o número de subestrutura esperada por monômero. Digite “1” como o corte de resolução da pesquisa de subestrutura. Isso permite que o Auto-Rickshaw determine automaticamente um corte de resolução adequado. Digite o número de resíduos em um único monômero, grupo espacial do conjunto de dados e número de moléculas na unidade assimétrica com base no coeficiente matthews. Selecione o nível de disseminação adequado dos dados de raios-X que se adequam às necessidades. A seleção de “desenvolvedores do AutoRickshaw” permitirá que os desenvolvedores do Auto-Rickshaw solucionem problemas na execução se surgirem problemas. Insira os dados anômalos como um arquivo mtz. Insira a sequência de proteínas como um arquivo seq, pir ou txt. Um arquivo seq pode ser gerado em um editor de texto (como Notepad++9 no Windows ou nano no Linux). Crie um novo arquivo, digite a sequência primária da proteína como uma linha longa ou separada por quebras de linha. Salve o arquivo com a extensão de arquivo .seq. Digite um endereço de e-mail institucional. Os resultados são entregues através de um link web enviado para o endereço de e-mail fornecido.NOTA: AutoRickshaw é um pipeline automatizado que invoca vários pacotes de software de cristalografia para resolver uma estrutura de cristal de raios-X32,33,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58. Se a execução auto-riquixá não resolver a estrutura, outras configurações de Auto-Rickshaw podem ser testadas. O método de determinação da estrutura pode ser alterado para “sub_phassade” para usar o Phaser59 em vez do SHELXD32. O número de subestrutura esperada por monômero também pode ser aumentado ou diminuído. Durante o ajuste experimental da estrutura cristalina, o Auto-Rickshaw tentará posicionar átomos pesados na célula unitária, criando uma subestrutura. O arranjo do triângulo equilátero dos átomos de iodo em I3C apresenta uma maneira eficiente de validar a subestrutura. Se a etapa 6.3 falhar, a validação da subestrutura pode ajudar na solução da estrutura de solução de problemas. Baixe a lista de sites de átomos pesados da página de resultados do Auto-Rickshaw. É um hiperlink chamado “locais átomos pesados”. Isso irá baixar um arquivo de texto com os sites de átomos pesados. Altere a extensão do arquivo de .txt para .pdb. Abra o arquivo PDB em Coot60. Ligue a simetria para ver outros átomos pesados de unidades assimétricas vizinhas. Meça as distâncias entre os átomos pesados, inclusive através de unidades assimétricas. I3C aparecerá como um triângulo equilátero com um comprimento lateral de 6 angstroms. A presença de um triângulo com essas dimensões indica que as colocações desses átomos pesados estão corretas.

Representative Results

Incorporar I3C em rMMS pode gerar novas condições de suporte ao crescimento de cristal derivatizadoA eficácia da triagem simultânea de rMMS e da derivatização I3C foi demonstrada em duas proteínas, a lisesozyme branco de galinha (HEWL, obtida como pó liofilizado) e o domínio putativo orf11 lysin N-terminal (Orf11 NTD) do bacteriophage P68. Cada proteína foi rastreada contra PEG/ION HT em quatro condições diferentes, incluindo: não semeada, semeada, semeada com I3C e semeada com I3C(Figura 1). Para ambas as proteínas, a única adição de I3C não aumentou o número de condições propícias à cristalização. No caso do Orf11 NTD, apenas uma condição adequada foi identificada com e sem I3C (Figura 1B). Quando o I3C foi adicionado às telas HEWL, o número de acessos foi reduzido de 31 para 26, destacando as complexidades adicionais de cristalização ao introduzir compostos de eliminação(Figura 1A). Consistente com outros estudos, a adição de sementes a telas de matriz esparsas comerciais para gerar uma tela rMMS aumentou significativamente o número de possíveis condições de cristalização para ambas as proteínas, resultando em um aumento de 2,1 e 6 vezes para HEWL e Orf11 NTD,respectivamente 6,61 ( Figura1). Mais importante, a adição simultânea de I3C e sementes aumentou o número de acessos em relação a uma tela não semeada, demonstrando um aumento de 2,3 e 7 vezes para HEWL e Orf11 NTD, respectivamente. Muitos dos cristais da RMMS na presença do I3C apresentam excelente morfologia cristalina(Figura 2). Semeadura permite controle cuidadoso do número de cristal em telas I3C rMMSEm experimentos de microseedização, o número de sementes introduzidas em um ensaio de cristalização pode ser controlado pela diluição do estoque de sementes e isso permite o controle preciso da nucleação na queda7,36. Isso muitas vezes permite que cristais maiores se formem, uma vez que há redução da concorrência de moléculas de proteínas em locais de nucleação. Essa vantagem também se estende ao método I3C-rMMS e foi demonstrada com sucesso tanto no HEWL quanto no Orf11 NTD. A recriação de uma condição de cristalização identificada a partir da tela I3C-rMMS com um estoque de sementes diluída rendeu menos cristais, mas maiores(Figura 3). O enfagem SAD pode ser usado para resolver as estruturas de cristais derivados da tela rMMS I3COs cristais cultivados utilizando o estoque de sementes diluídos mostrados na Figura 3 foram utilizados para resolver a estrutura das proteínas utilizando o enchimento SAD utilizando dados de difração de um único cristal(Figura 4). Os dados foram coletados na linha de feixe Síncrotron Australiano MX162. Detalhes detalhados da coleta e da solução da estrutura são descritos em outros lugares27. Figura 1 – rMMS foi utilizado para gerar novas condições para o crescimento de cristais na presença de I3C para duas proteínas de teste. 96 telas de cristalização de difusão de vapor foram realizadas utilizando-se telas de matriz esparsas comerciais. (A) A lise de ovo de galinha foi testada com a tela Index HT. As bandejas foram semeadas com cristais HEWL cultivados em 0,2 M de tartarato de amônio dibásico pH 7.0, 20% (w/v) polietileno glicol 3350. (B) Orf11 NTD do bacteriófago P68 foi testado com a tela PEG/ION. As bandejas NTD Orf11 foram semeadas a partir de cristais da condição G12 da tela não semeada, mostrada em azul. As condições que suportam o crescimento do cristal são mostradas em vermelho. rMMS semeando na presença e ausência de I3C ambos deram significativamente mais golpes de cristal do que bandejas não semeadas. Figura adaptada de Truong et al.27. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2 – Imagens representativas de cristais cultivados a partir dos ensaios de difusão de vapor mostrados na Figura 1 (a) e (b). Figura adaptada de Truong et al.27. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3 – A diluição do estoque de sementes é uma maneira eficaz de reduzir a nucleação em uma condição de cristalização encontrada utilizando o método I3C-rMMS, para controlar o número de cristais que formam. Reduzir a nucleação dentro de uma queda muitas vezes resulta em cristais crescendo para dimensões maiores. Figura adaptada de Truong et al.27. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4 – Orf11 NTD (PDB ID 6O43) e HEWL (PDB ID 6PBB) foram cristalizados usando o método I3C-rMMS e resolvidos usando o esfinge SAD auto-riquixá. (A) Estruturas de fita de HEWL e Orf11 NTD resolvidas através de eliminação experimental. (B) Molécula I3C ligada a HEWL e Orf11 NTD. (C) Átomos de iodo anômeos em I3C estão dispostos em um triângulo equilátero de 6 Å. Assim, a presença deste triângulo na subestrutura de eliminação indica que há uma molécula I3C nessa posição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

A determinação da estrutura de uma nova proteína na ausência de um modelo de homologia adequado para substituição molecular requer um ajuste experimental. Esses métodos requerem a incorporação de átomos pesados no cristal proteico que adiciona um nível de complexidade ao pipeline de determinação da estrutura e pode introduzir inúmeros obstáculos que devem ser enfrentados. Átomos pesados podem ser incorporados diretamente à proteína através da expressão rotulada usando selenomethionina e selenocisteína. Como este método é caro, trabalhoso e pode resultar em menores rendimentos proteicos, a proteína rotulada é frequentemente expressa após condições de cristalização ter sido encontrada e otimizada com proteína sem rótulo. Alternativamente, os cristais podem ser derivados por imersão em uma solução contendo átomos pesados22,63,64. Este método muitas vezes usa cristais de alta qualidade e, portanto, é realizado após um método robusto de cristalização já ter sido desenvolvido. A obtenção com sucesso de um cristal derivatizado usando este método requer maior otimização dos procedimentos de imersão e triagem de diferentes compostos de eliminação, adicionando assim mais tempo a um processo já trabalhoso.

A co-cristalização da proteína com o átomo pesado pode ser realizada na fase de triagem, simplificando assim o processo e reduzindo as etapas de manipulação de cristais que podem causar danos. No entanto, ainda existe o cenário potencial de obtenção de poucos golpes iniciais de cristalização e o problema de escolher um composto átomo pesado compatível. Muitos compostos de eliminação disponíveis atualmente são incompatíveis com precipitantes, buffers e aditivos comumente encontrados em condições de cristalização. Eles podem ser insolúveis em tampões de sulfato e fosfato, quelato para citar e acetato, reagir desfavoravelmente com buffers HEPES e Tris ou ser sequestrado por DTT e β-mercaptoethanol21. Como o composto de eliminação I3C não sofre dessas incompatibilidades, é um composto robusto que pode ser favorável a muitas condições diferentes.

Neste estudo, é apresentado um método simplificado de produção de cristais derivativos prontos para a eliminação da SAD através da co-cristalização simultânea do composto de eliminação I3C e da RMMS. A combinação de ambas as técnicas aumenta o número de acertos de cristalização, com muitas das condições com características de morfologia e difração melhoradas. Em ambos os casos de teste Orf11 NTD e HEWL, foram identificadas novas condições na tela I3C-rMMS que estavam ausentes quando o I3C não estava presente. Potencialmente, o I3C pode se ligar favoravelmente à proteína, facilitando a formação e estabilização dos contatos cristais27. Por sua vez, isso pode induzir a cristalização e possivelmente melhorar as características de difração. Além de ser um composto compatível com telas de matriz esparsas, o I3C também é um composto atraente devido às suas propriedades intrínsecas. Os grupos funcionais que alternam com iodo no andaime aromático do anel aromático permitem a ligação específica às proteínas. Isso leva a uma maior ocupação e potencialmente reduz o sinal de fundo23. Além disso, o arranjo de dispersores anômalos em um triângulo equilátero é óbvio na subestrutura e pode ser usado para validar rapidamente a ligação de I3C (Figura 4B e 4C). Finalmente, pode produzir um sinal anômeo com radiação síncrotron tunable, bem como fontes de raios-X de cromo e cobre rotativos. Assim, pode ser aplicado a muitos fluxos de trabalho diferentes. Como o I3C está amplamente disponível e barato de compra, essa abordagem está ao alcance da maioria dos laboratórios de biologia estrutural.

Existem várias considerações experimentais que devem ser abordadas ao utilizar o método I3C-rMMS. Este método não pode ser aplicado se o material cristalino inicial da proteína não puder ser obtido. Em casos difíceis, material cristalino de uma proteína homólogo também pode ser usado para gerar sementes. Esta abordagem de cross-semeamento para rMMS mostrou alguns resultados promissores7. Otimizar o número de cristal através da diluição do estoque de sementes é um passo crucial, que não deve ser negligenciado, para maximizar a chance de produzir cristais grandes de alta qualidade e adquirir dados adequados de difração. Se houver poucos locais I3C identificados na unidade assimétrica, as condições propícias à cristalização devem ser ainda mais otimizadas com uma concentração aumentada de I3C. Isso pode aumentar a ocupação do I3C para maximizar o sinal anômroo e ajudar a derivatização do cristal.

Pode haver casos em que essa técnica pode não ser o método ideal para derivatizar cristais proteicos. À medida que o tamanho de uma proteína ou complexo proteico aumenta, o número limitado de locais I3C na superfície da proteína pode não fornecer poder de corte suficiente para resolver a estrutura. Nestes cenários em que se suspeita que o tamanho da proteína esteja impedindo a eliminação, a rotulagem selenomethionina da proteína pode ser uma abordagem mais viável para a eliminação da proteína. Se a proteína tiver um número adequado de resíduos de metionina na proteína (recomendado ter pelo menos uma metionina por 100 resíduos65) e a incorporação de selenomethionina de alta eficiência em uma proteína pode ser alcançada (como nos sistemas de expressão bacteriana66),múltiplos átomos de selênio de alta ocupação estarão presentes nos cristais para fase da estrutura.

Além disso, algumas proteínas podem ser inerentemente inadequadas para a derivatização com I3C. Os locais de ligação I3C em proteínas dependem da estrutura proteica. Pode haver proteínas que naturalmente têm poucas manchas expostas compatíveis com a ligação I3C. Assim, não é imprevisível que possa haver dificuldades em co-cristalizar algumas proteínas-alvo com I3C.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi realizada na linha de vigas MX1 no Síncrotron Australiano, parte da ANSTO. Os autores gostariam de reconhecer os membros dos laboratórios Shearwin e Bruning para discussões sobre este trabalho. Os autores também gostariam de reconhecer o Dr. Santosh Panjikar e a Dra.

O seguinte financiamento é reconhecido: Australian Research Council (grant Nos. DP150103009 e DP160101450 para Keith E. Shearwin); Universidade de Adelaide (Bolsa de Estudos do Programa de Pesquisa do Governo Australiano para Jia Quyen Truong e Stephanie Nguyen).

Materials

10 mL disposable luer lock syringes Adelab Scientific T3SS10LAT Used for dispensing vacuum grease for hanging drop crystal tray wells
24 well tissue culture plate Sigma Aldrich CLS3527 Used for hanging drop crystal tray
3 inch wide Crystal Clear Sealing Tape Hampton Research HR4-506 For 96 well crystallization screens set up by robot
5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid Alfa Aesar B22178 Commonly referred to as I3C in the article
Art Robbins Intelli-Plate 96-2 Original Hampton Research HR3-297 For 96 well crystallization screens set up by robot
Coverslips  Thermo Fisher Scientific 18X18-2 Coverslips for hanging drop crystal tray wells
Dow Corning vacuum grease Hampton Research HR3-510 Used for sealing hanging drop crystal tray wells
Eppendorf Pipette 0.1 μL-2.5 μL Eppendorf 3120000011
Gilson Pipette 2 μL-20 μL John Morris Group 1153247
Gilson Pipette 20 μL-200 μL John Morris Group 1152006
Glass pasteur pipettes Adelab Scientific HIR92601.01
Hen Egg White Lysozyme Sigma-Aldrich L6876 Approximately 95% pure
IndexHT screen Hampton Research HR2-134
Microscope illuminator Meiji Techno FT192/230 Light source to illuminate crystallography experiments
PEG/ION HT screen Hampton Research HR2-139
Phoenix Liquid Dispenser Art Robbins Instruments 602-0001-10
Scalpel with scalpel blade no. 15 Adelab Scientific LV-SMSCPO15
Seed bead kit Hampton Research HR2-320 Kit contains a glass probe for crushing crystals. A PTFE seed bead, designed for crushing crystals, is also part of the kit but not used in this protocol.
Stereo microscope  Meiji Techno EMZ-5TR Microscope for visualising crystallography experiments
Tweezers Sigma-Aldrich T5415
Vortex mixer Adelab Scientific RAVM1
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Zheng, H., Hou, J., Zimmerman, M. D., Wlodawer, A., Minor, W. The future of crystallography in drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 9 (2), 125-137 (2014).
  2. Oakley, A. J., Wilce, M. C. J. Macromolecular crystallography as a tool for investigating drug, enzyme and receptor interactions. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 27 (3), 145-151 (2000).
  3. Jancarik, J., Kim, S. H. Sparse matrix sampling. A screening method for crystallization of proteins. Journal of Applied Crystallography. 24, 409-411 (1991).
  4. Newman, J., et al. Towards rationalization of crystallization screening for small- To medium-sized academic laboratories: The PACT/JCSG+ strategy. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 61 (10), 1426-1431 (2005).
  5. Ireton, G. C., Stoddard, B. L. Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 60 (3), 601-605 (2004).
  6. D’Arcy, A., Villard, F., Marsh, M. An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 63 (4), 550-554 (2007).
  7. D’Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: What have we learned. Acta Crystallographica Section:F Structural Biology Communications. 70 (9), 1117-1126 (2014).
  8. Taylor, G. The phase problem. Acta Crystallographica – Section D Biological Crystallography. 59 (11), 1881-1890 (2003).
  9. Rossmann, M. G. The molecular replacement method. Acta Crystallographica Section A. 46 (2), 73-82 (1990).
  10. McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674 (2007).
  11. Millán, C., Jiménez, E., Schuster, A., Diederichs, K., Usón, I. ALIXE: a phase-combination tool for fragment-based molecular replacement. Acta Crystallographica Section D. 76 (3), 209-220 (2020).
  12. Liebschner, D., et al. Macromolecular structure determination using X-rays, neutrons and electrons: Recent developments in Phenix. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75, 861-877 (2019).
  13. Abergel, C. Molecular replacement: Tricks and treats. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 69 (11), 2167-2173 (2013).
  14. Pröpper, K., et al. Structure solution of DNA-binding proteins and complexes with ARCIMBOLDO libraries. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 70 (6), 1743-1757 (2014).
  15. Rodríguez, D. D., et al. Crystallographic ab initio protein structure solution below atomic resolution. Nature Methods. 6 (9), 651-653 (2009).
  16. Bibby, J., Keegan, R. M., Mayans, O., Winn, M. D., Rigden, D. J. AMPLE: A cluster-and-truncate approach to solve the crystal structures of small proteins using rapidly computed ab initio models. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (12), 1622-1631 (2012).
  17. Green, D. W., Ingram, V. M., Perutz, M. F. The structure of haemoglobin – IV. Sign determination by the isomorphous replacement method. Proceedings of the Royal Society of London. Series A. Mathematical and Physical Sciences. 225 (1162), 287-307 (1954).
  18. Blow, D. M., Rossmann, M. G. The single isomorphous replacement method. Acta Crystallographica. 14 (11), 1195-1202 (1961).
  19. Wang, B. C. Resolution of phase ambiguity in macromolecular crystallography. Methods in Enzymology. 115, 90-112 (1985).
  20. Hendrickson, W. A. Determination of macromolecular structures from anomalous diffraction of synchrotron radiation. Science. 254 (5028), 51-58 (1991).
  21. Pike, A. C. W., Garman, E. F., Krojer, T., Von Delft, F., Carpenter, E. P. An overview of heavy-atom derivatization of protein crystals. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (3), 303-318 (2016).
  22. Dauter, Z., Dauter, M., Rajashankar, K. R. Novel approach to phasing proteins: Derivatization by short cryo-soaking with halides. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 56 (2), 232-237 (2000).
  23. Beck, T., Krasauskas, A., Gruene, T., Sheldrick, G. M. A magic triangle for experimental phasing of macromolecules. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 64 (11), 1179-1182 (2008).
  24. Beck, T., Gruene, T., Sheldrick, G. M. The magic triangle goes MAD: Experimental phasing with a bromine derivative. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (4), 374-380 (2010).
  25. Beck, T., Da Cunha, C. E., Sheldrick, G. M. How to get the magic triangle and the MAD triangle into your protein crystal. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 65 (10), 1068-1070 (2009).
  26. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. , (2000).
  27. Truong, J. Q., Panjikar, S., Shearwin-Whyatt, L., Bruning, J. B., Shearwin, K. E. Combining random microseed matrix screening and the magic triangle for the efficient structure solution of a potential lysin from bacteriophage P68. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75 (7), 670-681 (2019).
  28. Terwilliger, T. C., et al. Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: The PHENIX AutoSol wizard. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 65 (6), 582-601 (2009).
  29. Holton, J., Alber, T. Automated protein crystal structure determination using ELVES. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (6), 1537-1542 (2004).
  30. Skubák, P., Pannu, N. S. Automatic protein structure solution from weak X-ray data. Nature Communications. 4, (2013).
  31. Sheldrick, G. M. Crystal structure refinement with SHELXL. Acta Crystallographica Section C: Structural Chemistry. 71, 3-8 (2015).
  32. Schneider, T. R., Sheldrick, G. M. Substructure solution with SHELXD. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 58 (10), 1772-1779 (2002).
  33. Sheldrick, G. M. Macromolecular phasing with SHELXE. Zeitschrift fur Kristallographie. 217 (12), 644-650 (2002).
  34. Benvenuti, M., Mangani, S. Crystallization of soluble proteins in vapor diffusion for x-ray crystallography. Nature Protocols. , (2007).
  35. Beck, T. . Sticky triangles New tools for experimental phasing of biological macromolecules. , (2010).
  36. Luft, J. R., DeTitta, G. T. A method to produce microseed stock for use in the crystallization of biological macromolecules. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 55 (5), 988-993 (1999).
  37. Teng, T. -. Y. Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a free-standing thin film. Journal of Applied Crystallography. 23 (5), 387-391 (1990).
  38. Garman, E. F., Mitchell, E. P. Glycerol concentrations required for cryoprotection of 50 typical protein crystallization solutions. Journal of Applied Crystallography. 29, 584-587 (1996).
  39. Garman, E. F., Weik, M. X-ray radiation damage to biological samples: recent progress. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (4), 907-911 (2019).
  40. Garcia-Bonete, M. J., Katona, G. Bayesian machine learning improves single-wavelength anomalous diffraction phasing. Acta Crystallographica Section A: Foundations and Advances. 75, 851-860 (2019).
  41. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  42. Evans, P. Scaling and assessment of data quality. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 62 (1), 72-82 (2006).
  43. Evans, P. R., Murshudov, G. N. How good are my data and what is the resolution. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 69 (7), 1204-1214 (2013).
  44. Panjikar, S., Parthasarathy, V., Lamzin, V. S., Weiss, M. S., Tucker, P. A. Auto-Rickshaw: An automated crystal structure determination platform as an efficient tool for the validation of an X-ray diffraction experiment. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 61 (4), 449-457 (2005).
  45. Jones, T. A., Thirup, S. Using known substructures in protein model building and crystallography. The EMBO journal. 5 (4), 819-822 (1986).
  46. Kleywegt, G. J., Jones, T. A. Template convolution to enhance or detect structural features in macromolecular electron-density maps. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 53 (2), 179-185 (1997).
  47. Perrakis, A., Morris, R., Lamzin, V. S. Automated protein model building combined with iterative structure refinement. Nature Structural Biology. 6 (5), 458-463 (1999).
  48. Morris, R. J., et al. Breaking good resolutions with ARP/wARP. Journal of Synchrotron Radiation. 11 (1), 56-59 (2004).
  49. Yao, D. Q., et al. SAD phasing by OASIS-2004: Case studies of dual-space fragment extension. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 62 (8), 883-890 (2006).
  50. Hao, Q. ABS: A program to determine absolute configuration and evaluate anomalous scatterer substructure. Journal of Applied Crystallography. 37 (3), 498-499 (2004).
  51. Collaborative Computational Project Number 4. The CCP4 suite: Programs for protein crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 50 (5), 760-763 (1994).
  52. Sheldrick, G. M., Hauptman, H. A., Weeks, C. M., Miller, R., Usón, I. Ab initio phasing. International Tables for Crystallography. , 333-345 (2006).
  53. Smith, G. D. Matching selenium-atom peak positions with a different hand or origin. Journal of Applied Crystallography. 35 (3), 368-370 (2002).
  54. Pannu, N. S., McCoy, A. J., Read, R. J. Application of the complex multivariate normal distribution to crystallographic methods with insights into multiple isomorphous replacement phasing. Acta Crystallographica – Section D Biological Crystallography. 59 (10), 1801-1808 (2003).
  55. Pannu, N. S., Read, R. J. The application of multivariate statistical techniques improves single-wavelength anomalous diffraction phasing. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 60 (1), 22-27 (2004).
  56. De La Fortelle, E., Bricogne, G. Maximum-likelihood heavy-atom parameter refinement for multiple isomorphous replacement and multiwavelength anomalous diffraction methods. Methods in Enzymology. 276, 472-494 (1997).
  57. Cowtan, K. Joint CCP4 and ESF-EACBM Newsletter on Protein. Crystallography. 31, 34-38 (1994).
  58. Terwilliger, T. C. Maximum-likelihood density modification. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 56 (8), 965-972 (2000).
  59. Read, R. J., McCoy, A. J. Maximum-likelihood determination of anomalous substructures. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. , (2018).
  60. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (4), 486-501 (2010).
  61. Till, M., et al. Improving the success rate of protein crystallization by random microseed matrix screening. Journal of visualized experiments JoVE. (78), e50548 (2013).
  62. McPhillips, T. M., et al. Blu-Ice and the distributed control system: Software for data acquisition and instrument control at macromolecular crystallography beamlines. Journal of Synchrotron Radiation. 9 (6), 401-406 (2002).
  63. Nagem, R. A. P., Polikarpov, I., Dauter, Z. Phasing on Rapidly Soaked Ions. Methods in Enzymology. 374, 120-137 (2003).
  64. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (4), 325-338 (2010).
  65. Hendrickson, W. A., Ogata, C. M. Phase determination from multiwavelength anomalous diffraction measurements. Methods in Enzymology. 276, 494-523 (1997).
  66. Doublié, S. Production of Selenomethionyl Proteins in Prokaryotic and Eukaryotic Expression Systems. Macromolecular Crystallography Protocols. Methods in Molecular Biology. , 91-108 (2007).

Tags

Protein CrystalDerivatizationI3CRandom Microseed Matrix ScreeningX-ray CrystallographyPhasing MoleculeAnomalous SignalSingle Wavelength Anomalous Discussion PhasingLithium I3CProtein CrystallizationStructure Solution

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Truong, J. Q., Nguyen, S., Bruning, J. B., Shearwin, K. E. Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening. J. Vis. Exp. (167), e61894, doi:10.3791/61894 (2021).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image