على المدى الطويل، زراعة خالية من المصل من النباتات الشبكية الماوس Organotypic مع ظهارة صبغة الشبكية سليمة
Summary
يصف البروتوكول النباتات العضوية منشبكية العين العصبيةالماوس , المزروعة جنبا إلى جنب مع ظهارة صبغة الشبكية (RPE), في R16 المتوسطة المحددة, خالية من المصل والمضادات الحيوية. هذه الطريقة بسيطة نسبيا لأداء، وأقل تكلفة، وتستغرق وقتا طويلا بالمقارنة مع التجارب في الجسم الحي، ويمكن تكييفها مع العديد من التطبيقات التجريبية.
Abstract
في أبحاث العيون ، هناك حاجة قوية للنماذج المختبرية للعصبية. هنا، نقدم بروتوكول مفصل لزراعة الأورغنوتيبيكمن شبكية العين العصبيةالماوس مع ظهارة الصباغ الشبكية سليمة (RPE). اعتمادا على السؤال البحثي، يمكن عزل شبكية العين من الحيوانات البرية أو من نماذج المرض، لدراسة، على سبيل المثال، اعتلال الشبكية السكري أو انحطاط الشبكية الوراثي. عيون من وقت مبكر بعد الولادة اليوم 2-9 يتم تلقيح الحيوانات في ظل ظروف مطهرة. يتم هضمها جزئيا في البروتين K للسماح مفرزة من المشيمي من RPE. تحت المجسمة، يتم إجراء شق صغير في القرنية خلق اثنين من حواف من حيث يمكن تقشير المشيمي والشق بلطف قبالة من RPE و neuroretina. ثم تتم إزالة العدسة ، ويتم قطع العدسة في أربع نقاط لإعطائها شكلا رباعيا يشبه ورقة البرسيم. يتم نقل الأنسجة أخيرا في قطرة معلقة في إدراج ثقافة الخلية عقد غشاء زراعة البولي. ثم يتم الحفاظ على الثقافات في R16 المتوسطة، دون مصل أو المضادات الحيوية، في ظل ظروف محددة تماما، مع تغيير متوسط كل يوم الثاني.
الإجراء الموصوف يتيح عزل شبكية العين والحفاظ على سياقها الفسيولوجي الطبيعي والهسطي لفترات زراعة لا تقل عن أسبوعين. هذه الميزات تجعل الثقافات الضمور الشبكية organotypic نموذجا ممتازا مع قيمة تنبؤية عالية، للدراسات في تطور الشبكية، وآليات المرض، والفيزيولوجيا الكهربية، في حين تمكين أيضا الفحص الدوائي.
Introduction
في البحوث العيون, مجموعة متنوعة من النماذج المتاحة لدراسة شبكية العين, بما في ذلك ثقافات خلايا الشبكية الأولية, خطوط الخلايا المشتقة من شبكية العين, organoids الشبكية, وفي نماذج حيوانية في الجسم الحي 1,2,3,4,5. ومع ذلك، كل من هذه النماذج يعاني من عيوب. على سبيل المثال، تنمو الخلايا في عزلة بينما شبكية العين هي شبكة معقدة مع العديد من التفاعلات بين الخلايا. وبالتالي ، فإن سلوك ثقافات الخلايا المعزولة من المرجح أن يكون مصطنعا مقارنة بتلك التي لوحظت في نسيج كامل. ويمكن علاج هذه المشكلة جزئيا باستخدام في المختبر الأجهزة الشبكية المتمايزة، والتي يمكن استخدامها لدراسة التنمية والبيولوجيا الأساسية6. ومع ذلك ، اعتبارا من اليوم ، لا يزال توليد الجهاز الشبكي يستغرق وقتا طويلا ، وكثيف العمالة ، ويعاني من مشكلات في الاستنساخ ، مما يتطلب المزيد من أعمال التطوير الكبيرة قبل أن يمكن استخدام الأعضاء لأبحاث الشبكية الترجمية. وأخيرا، ترتبط الدراسات على الحيوانات الحية، في حين يمكن القول إن النموذج الأقرب إلى متطلبات أبحاث العيون، بمخاوف أخلاقية قوية. حل وسط جيد بين كفاءة نظم زراعة الخلايا والوضع الواقعي للنماذج الحيوانية في الجسم الحي هي الثقافات الزرع الشبكية organotypic. كما تقلل هذه الثقافات من معاناة الحيوانات حيث لا يتم إجراء تدخلات في الجسم الحي.
وقد وصفت عدة طرق لزراعة النباتات الشبكية من أنواع مختلفة5,7,8. يصف بروتوكولنا تقنية لعزل العصب الفأري جنبا إلى جنب مع ظهارة صبغة الشبكية (RPE). هذه التقنية ستكون مناسبة أيضا لثقافات الشبكية الفئران9. ثقافة neuroretina جنبا إلى جنب مع RPE لها أهمية كبيرة للنجاح. يقوم RPE بوظائف أساسية للشبكية: نقل العناصر الغذائية والأيونات والماء وامتصاص الضوء والحماية من الأكسدة الضوئية وإعادة تسمية جميع أنحاء الشبكية إلى 11-cis-retinal ، وهو أمر حاسم للدورة البصرية ، وداء البلعومية لأغشية المستقبل الضوئي السقيفة ، وإفراز العوامل الأساسية لسلامة الشبكيةالهيكلية 10. الحفاظ على RPE يسمح بتطوير ناجح للشرائح الخارجية والداخلية مستقبلات ضوئية، والحفاظ على شبكية العين قابلة للحياة لفترة أطول11. الإجراء الموصوف أدناه يحافظ على الخصائص الهستوتيبيك والفسيولوجية للشبكية لمدة أسبوعين على الأقل12. وعلاوة على ذلك، فإن زراعة النباتات الشبكية العضوية في وسط خال من المصل والمضادات الحيوية يتجنب وجود مواد غير معروفة ويمكن من تفسير مباشر للنتائج12.
كانت الثقافات الزرع الشبكية Organotypic ضرورية لتحسين معرفتنا على نمو الشبكية وانحطاط7،13،14. نظهر هنا أنها أيضا أداة مفيدة للفحص الدوائي وأنه يمكن استخدامها لنمذجة مجموعة متنوعة من أمراض الشبكية، بما في ذلك اعتلال الشبكية السكري.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف البروتوكول المقدم الثقافات التحسسية العضوية لشبكية العين الماوس مع RPE سليمة في متوسط R16 محددة، خالية من المصل والمضادات الحيوية. وقد وضعت هذا البروتوكول أصلا ابتداء من أواخر 1980s7،28 ومنذ ذلك الحين تم صقلها باستمرار6،11،12. وتشمل التطبيقات البارزة دراسات في آليات انحطاط الشبكية الوراثية وتحديد الأدوية الشبكية23،29،30.
11- ومن أجل تجربة ناجحة، ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار بعض الاعتبارات الهامة. فيما يلي بعض نقاط استكشاف الأخطاء وإصلاحها الهامة للمساعدة في تحسين جودة الثقافات. أولا، قد تظهر ثقافات الشبكية الإفراط في طي و / أو تشكيلالوردية 31. يمكن أن يحدث هذا عن طريق لمس الشبكية مع ملقط أثناء إجراء الزرع. وعلاوة على ذلك، يجب إزالة الجسم ciliary تماما من explant، لأن هذا يمكن أن تزيد من طي الشبكية أثناء الثقافة. ثانيا، أثناء نقل الشبكية إلى لوحة البئر في قطرة معلقة، إذا كانت شبكية العين تواجه الغشاء الجانب الخطأ إلى أسفل، يبقيه في قطرة تتدلى من طرف ماصة ودفع بلطف جدا المتوسطة داخل وخارج الطرف (دون فصل قطرة معلقة) لقلب شبكية العين حولها. وأخيرا، إذا كان RPE لا تزال تعلق على تصلب ويفصل من شبكية العين، فمن المرجح أن يكون سببها عدم كفاية عسر الهضم من تصلب. ويمكن أن تكون هذه المشكلة مهمة بشكل خاص عند العمل مع عيون الحيوانات القديمة أو الأنواع غير القوارض (مثل الخنازير) ويمكن حلها عن طريق زيادة تركيز البروتين K.
إجراء ثقافات ال جربت الشبكية الجهازية هو إجراء معقد يتطلب التدريب الكافي والخبرة. نقص التدريب يمكن أن يؤدي إلى تباين في نوعية النباتات الشبكية. ولهذه الأسباب، من المهم رصد التحقق من الجدوى وقابلية التكاثر، مع وصف معدل موت الخلايا على سبيل المثال باستخدام المقايسة TUNEL. استخدام وسيلة خالية من المضادات الحيوية يجعل النباتات الشبكية عرضة للتلوث من البكتيريا والفطريات. لتقليل هذا الخطر، نوصي بأن يتم توخي الحذر بشكل خاص للعمل في ظل ظروف مطهرة حقا. وهناك قيد آخر لزراعة الشبكية في المختبر هي الاختلافات في البيئة الفيزيائية الكيميائية بالمقارنة مع شبكية العين الحية (على سبيل المثال، إمدادات الدم المشيمية والشبكية، ومستويات الأكسجين والجلوكوز، والضغط داخل العين، وتكوين الجسم الزجاجي). نظام التشوه المستمر، ربما جزءا لا يتجزأ من مفاعل حيوي مخصص32 يمكن أن تجعل هذا النموذج أقرب إلى حالة في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، فإن استئصال الاكستوم العصب البصري أثناء تشريح الشبكية يؤدي إلى موت الخلايا العقدية، التي يمكن أن تحفز استجابات الإجهاد8. لذلك ، يوصى بأن يترك الإكسبلانت للتكيف مع ظروف الزرع لمدة يومين على الأقل في المختبر قبل أن يتعرض لتلاعب أو علاج محدد.
عادة ما يتم تنفيذ الطريقة الموصوفة على أنسجة الشبكية غير الناضجة ، والتي قد تبقى على قيد الحياة بشكل جيد لمدة 4 أسابيع في المختبر7،33. ومع ذلك، فإن الإجراء قابل للتكييف مع مجموعة متنوعة من التطبيقات، بما في ذلك زراعة شبكية العين للبالغين. على الرغم من أن النهج المختلفة المنشورة تصف عزل شبكية العين البالغة دون RPE34،35، فإن الحضانة بمحلول الباباين لمدة تصل إلى 1 ساعة عند 37 درجة مئوية قبل التشريح تسمح ل RPE بالبقاء ملتصقة بشبكية العين حتى عندما تكون مشتقة من فأر بالغ36.
وتوفر الوسيلة الخالية من المصل والبيئة المختبرية المحددة كيميائيا تلاعبا محددا تماما وقابلا للاستنساخ للظروف التجريبية. لذلك، فإن ثقافات استئصال الشبكية العضوية هي أدوات قيمة في مجال طب العيون وعلم الأعصاب، وقد استخدمت لدراسة أمراض الشبكية37،وتطور الشبكية38،39، والعلاج بالخلايا الجذعية الشبكية40، والتعديلات الوراثية41، والفحص الدوائي. كمثال محدد لاختبار المخدرات، وهنا استخدمنا الثقافات explant الشبكية لاختبار التماثلية cGMP (CN003)، والمعروف للحد من موت الخلايا مستقبلات ضوئية في النماذج الحيوانية لمرض الشبكيةالموروثة 23 (الشكل 3B). ويرد وصف آخر تطبيق ممكن لهذه التقنية في الشكل 3C، والذي يوضح كيف يمكن استغلال السيطرة الدقيقة على بيئة الأنسجة لمحاكاة حالات السكري24. بسبب الحفاظ على هندسة الأنسجة على مدى فترة زراعة الأنسجة بأكملها ، فإن ثقافات إزالة الشبكية العضوية مناسبة أيضا للدراسات الكهربية. وقد تم التحقيق في وظائف الخلايا العصبية على النباتات الشبكية باستخدام التصحيح المشبك تسجيل42 ومتعددة القطب صفيف (MEA) تسجيل33,43. هذا الأخير يسمح بتسجيل النشاط الكهربائي للسكان الخلايا العصبية في نفس الوقت، وقد تم استغلالها لتوصيف مستقبلات ضوئية ووظائف الخلية العقدة في ظروف الثقافة. من منظور أوسع ، يمكن أيضا تطبيق أنظمة زراعة المنظار العضوي في الأبحاث ما قبل السريرية ، حيث تم استخدام الثقافات الإكسبلانت لاختبار الفعالية العلاجية لانخفاض حرارة الجسم44.
تقنية زراعة الحشرات الإكسبتية العضوية بسيطة نسبيا في الأداء ، وعند مقارنتها بتجارب الجسم الحي المقابلة ، فهي أقل تكلفة وتستغرق وقتا طويلا ، وتتجنب المخاوف الأخلاقية المتعلقة بالدراسات الحيوانية الحية. إن التحكم الدقيق في الظروف التجريبية والحفاظ على RPE وتعقيد الأنسجة يجعل من هذه الطريقة أداة قيمة لتحسين معرفتنا بعلم وظائف الأعضاء الشبكية والفيزيولوجيا المرضية وتمكين العديد من التطبيقات التجريبية.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تلقى هذا العمل البحثي الدعم المالي من الاتحاد الأوروبي (transMed; H2020-MSCA-765441)، مجلس البحوث الألماني (DFG; PA1751/8-1، 10-1) ومجلس المنح الدراسية في الصين.
Materials
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| (+/-)-α-LipoicAcid (=Thiotic acid) | Sigma | T1395 | |
| BSA | Sigma | B4639 | |
| CDP-Choline-Na | Sigma | 30290 | |
| Corticosterone | Sigma | C2505 | |
| CuSO4 × 5H2O | Sigma | C8027 | |
| DL-Tocopherol | Sigma | T1539 | |
| Ethanolamine | Sigma | E0135 | |
| FCS | Sigma | F7524 | |
| Filtropur BT100, 1L, 0.2µm | SARSTEDT | 83.3942.101 | for Basal Medium |
| Forceps | F.S.T | 15003-08 | |
| Glutamine | Sigma | G8540 | |
| Glutathione | Sigma | G6013 | |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| L-CysteineHCl | Sigma | C7477 | |
| Linoleic Acid | Sigma | L1012 | |
| Linolenic Acid | Sigma | L2376 | |
| MnCl2 x 4H2O | Sigma | M5005 | |
| Na-pyruvate | Sigma | P3662 | |
| NaSeO3 x 5H2O | Sigma | S5261 | |
| Ophthalmic microscope scaping spoon | F.S.T. | 10360-13 | |
| Progesteron | Sigma | P8783 | |
| Proteinase K | MP Biomedicals | 21935025 | 44 mAnson U/mg |
| R16 | Gibco | 07491252A | |
| Retinol | Sigma | R7632 | |
| Retinyl acetate | Sigma | R7882 | |
| Scissors | F.S.T | 15004-08 | |
| Sterile filter 0.22µm | MILLEX GP | SLGP033RS | for supplements |
| T3 | Sigma | T6397 | |
| Tocopherylacetate | Sigma | T1157 | |
| Transferrin | Sigma | T1283 | |
| Transwell permeable supports | Corning | 3412 | |
| Vitamin B1 | Sigma | T1270 | |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | |
| Vitamin C | Sigma | A4034 |
Referencias
- Fletcher, E. L., et al. Animal models of retinal disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 100, 211-286 (2011).
- Llonch, S., Carido, M., Ader, M. Organoid technology for retinal repair. Biología del desarrollo. 433 (2), 132-143 (2018).
- Mencl, S., Trifunović, D., Zrenner, E., Paquet-Durand, F. PKG-dependent cell death in 661W cone photoreceptor-like cell cultures (experimental study). Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 511-517 (2018).
- Sanges, D., Comitato, A., Tammaro, R., Marigo, V. Apoptosis in retinal degeneration involves cross-talk between apoptosis-inducing factor (AIF) and caspase-12 and is blocked by calpain inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17366-17371 (2006).
- Schnichels, S., et al. Retina in a dish: cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. , 100880 (2020).
- Paquet-Durand, F., Hauck, S. M., van Veen, T., Ueffing, M., Ekström, P. PKG activity causes photoreceptor cell death in two retinitis pigmentosa models. Journal of Neurochemistry. 108 (3), 796-810 (2009).
- Caffe, A. R., Visser, H., Jansen, H. G., Sanyal, S. Histotypic differentiation of neonatal mouse retina in organ culture. Current Eye Research. 8 (10), 1083-1092 (1989).
- Murali, A., Ramlogan-Steel, C. A., Andrzejewski, S., Steel, J. C., Layton, C. J. Retinal explant culture: A platform to investigate human neuro-retina. Clinical and Experimental Ophthalmology. 47 (2), 274-285 (2019).
- Arango-Gonzalez, B., et al. In vivo and in vitro development of S- and M-cones in rat retina. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 51 (10), 5320-5327 (2010).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Söderpalm, A., Szél, A., Caffé, A. R., van Veen, T. Selective development of one cone photoreceptor type in retinal organ culture. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 35 (11), 3910-3921 (1994).
- Caffe, A. R., et al. Mouse retina explants after long-term culture in serum free medium. Journal of Chemical Neuroanatomy. 22 (4), 263-273 (2001).
- Caffe, A. R., Soderpalm, A. K., Holmqvist, I., van Veen, T. A combination of CNTF and BDNF rescues rd photoreceptors but changes rod differentiation in the presence of RPE in retinal explants. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 42 (1), 275-282 (2001).
- Ogilvie, J. M., Speck, J. D., Lett, J. M., Fleming, T. T. A reliable method for organ culture of neonatal mouse retina with long-term survival. Journal of Neuroscience Methods. 87 (1), 57-65 (1999).
- Keeler, C. E. The inheritance of a retinal abnormality in white mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (7), 329-333 (1924).
- Romijn, H. J. Development and advantages of serum-free, chemically defined nutrient media for culturing of nerve tissue. Biology of the Cell. 63 (3), 263-268 (1988).
- Caffe, A. R., et al. Mouse retina explants after long-term culture in serum free medium. Journal of Chemical Neuroanatomy. 22 (4), 263-273 (2001).
- Alarautalahti, V., et al. Viability of Mouse Retinal Explant Cultures Assessed by Preservation of Functionality and Morphology. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (6), 1914-1927 (2019).
- Caffe, A. R., Visser, H., Jansen, H. G., Sanyal, S. Histotypic differentiation of neonatal mouse retina in organ culture. Current Eye Research. 8 (10), 1083-1092 (1989).
- Farber, D. B., Lolley, R. N. Cyclic guanosine monophosphate: elevation in degenerating photoreceptor cells of the C3H mouse retina. Science. 186 (4162), 449-451 (1974).
- Arango-Gonzalez, B., et al. Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration. PloS One. 9 (11), 112142 (2014).
- Loo, D. T. In situ detection of apoptosis by the TUNEL assay: an overview of techniques. Methods in Molecular Biology. 682, 3-13 (2011).
- Vighi, E., et al. Combination of cGMP analogue and drug delivery system provides functional protection in hereditary retinal degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (13), 2997-3006 (2018).
- Valdés, J., et al. Organotypic retinal explant cultures as in vitro alternative for diabetic retinopathy studies. Altex. 33 (4), 459-464 (2016).
- Pajak, B., et al. 2-Deoxy-d-Glucose and its analogs: from diagnostic to therapeutic agents. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), (2019).
- Slepak, V. Z., Hurley, J. B. Mechanism of light-induced translocation of arrestin and transducin in photoreceptors: interaction-restricted diffusion. IUBMB Life. 60 (1), 2-9 (2008).
- Paquet-Durand, F., et al. A retinal model of cerebral malaria. Scientific Reports. 9 (1), 3470 (2019).
- Romijn, H. J., de Jong, B. M., Ruijter, J. M. A procedure for culturing rat neocortex explants in a serum-free nutrient medium. Journal of Neuroscience Methods. 23 (1), 75-83 (1988).
- Azadi, S., et al. CNTF+BDNF treatment and neuroprotective pathways in the rd1 mouse retina. Brain Research. 1129 (1), 116-129 (2007).
- Kaur, J., et al. Calpain and PARP activation during photoreceptor cell death in P23H and S334ter rhodopsin mutant rats. PloS One. 6 (7), 22181 (2011).
- Samardzija, M., et al. A mouse model for studying cone photoreceptor pathologies. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (8), 5304-5313 (2014).
- Achberger, K., et al. Merging organoid and organ-on-a-chip technology to generate complex multi-layer tissue models in a human retina-on-a-chip platform. eLife. 8, (2019).
- Alarautalahti, V., et al. Viability of Mouse Retinal Explant Cultures Assessed by Preservation of Functionality and Morphology. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (6), 1914-1927 (2019).
- Ferrer-Martín, R. M., et al. Microglial cells in organotypic cultures of developing and adult mouse retina and their relationship with cell death. Experimental Eye Research. 121, 42-57 (2014).
- Müller, B. Organotypic culture of adult mouse retina. Methods in Molecular Biology. 1940, 181-191 (2019).
- Heller, J. P., Kwok, J. C., Vecino, E., Martin, K. R., Fawcett, J. W. A method for the isolation and culture of adult rat Retinal Pigment Epithelial (RPE) cells to study retinal diseases. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 449 (2015).
- Sahaboglu, A., et al. Retinitis pigmentosa: rapid neurodegeneration is governed by slow cell death mechanisms. Cell Death & Disease. 4 (2), 488 (2013).
- Arai, E., et al. Ablation of Kcnj10 expression in retinal explants revealed pivotal roles for Kcnj10 in the proliferation and development of Müller glia. Molecular Vision. 21, 148-159 (2015).
- Demas, J., Eglen, S. J., Wong, R. O. Developmental loss of synchronous spontaneous activity in the mouse retina is independent of visual experience. Journal of Neuroscience. 23 (7), 2851-2860 (2003).
- Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).
- Hatakeyama, J., Kageyama, R. Retrovirus-mediated gene transfer to retinal explants. Methods. 28 (4), 387-395 (2002).
- Moritoh, S., Tanaka, K. F., Jouhou, H., Ikenaka, K., Koizumi, A. organotypic tissue culture of adult rodent retina followed by particle-mediated acute gene transfer in vitro. PloS One. 5 (9), 12917 (2010).
- Reinhard, K., et al. Step-by-step instructions for retina recordings with perforated multi electrode arrays. PloS One. 9 (8), 106148 (2014).
- Klemm, P., et al. Hypothermia protects retinal ganglion cells against hypoxia-induced cell death in a retina organ culture model. Clinical and Experimental Ophthalmology. 47 (8), 1043-1054 (2019).
