חקר דינמיקת חלבונים באמצעות ספקטרוסקופיה של הד ספין נויטרונים

בדיקת דינמיקה של חומר רך עם נויטרונים
חקר התכונות הדינמיות של חלבונים ופפטידים הוא חלק מרכזי במחקר הביופיזי, ושיטות מפותחות רבות קיימות כיום כדי לגשת למגוון רחב של נופי אנרגיה¹. הקשר בין הדינמיקה הניסיונית של החלבונים לתפקודם הביולוגי היא משימה קשה הרבה יותר, הדורשת מודלים מתמטיים מורכבים וסימולציות דינמיקה בעזרת מחשב. החשיבות של ספקטרוסקופיית נויטרונים לניתוח תנועות חלבונים הודגשה במספר מחקרים שהתקבלו היטב ומוכרים באופן נרחב ^1,2,3,4,5. לפני שנחקור את נוף האנרגיה המגוון של דינמיקת חלבונים פנימית, נדרשת סקירה קצרה של התהליכים הדינמיים בחומר רך וכיצד נויטרונים יכולים לגשת אליהם.

הרגישות של נויטרונים לתצורה איזוטופית וסוג האינטראקציות שהם מציגים עם חומר רך הופכים את פיזור הנייטרונים לאחת מטכניקות החקירה הרב-תכליתיות ביותר⁶. יש ספקטרום רחב של קני מידה של אורך קורלציה וזמני מתאם שנייטרונים יכולים לגשת אליהם, החל מעירורים גרעיניים ותנודות אטומיות ועד לתנועות קולקטיביות ותהליכי הרפיה איטיים כמו סיבובים איזוטרופיים ותנועות דיפוזיביות. כאשר חוקרים את הנייטרונים המפוזרים לצורך העברת האנרגיה שלהם, ניתן להבחין בין שלוש אינטראקציות עיקריות: הפיזור האלסטי, שבו אין חילופי אנרגיה בין נויטרון נכנס לחלקיק בדגימה; הפיזור הלא אלסטי, עם חילופי אנרגיה גדולים הניתנים לכימות בין נויטרונים לחלקיקים; והמקרה המוזר של פיזור מעין אלסטי שמייעד העברת אנרגיה קטנה מאוד בהשוואה לאנרגיית הנייטרונים המקרית ^1,7. אינטראקציות אלה מספקות מידע מדויק על החומר הנחקר ומהוות את הבסיס התיאורטי למגוון רחב של טכניקות פיזור נויטרונים.

בפיזור אלסטי, הגלאי מתעד את כיווני הנייטרונים כדפוס עקיפה, המציג את מיקום אטומי הדגימה ביחס זה לזה. מידע על המתאמים של עמדות אטומיות נרכש (כלומר, עוצמה משולבת S(Q) לגבי העברת התנע Q, הנוגעת למידע מבני בלבד). עיקרון זה מהווה את הבסיס לעקירת הנייטרונים⁸.

המורכבות נוצרת כאשר העברת האנרגיה כבר אינה אפס עקב עירורים ותנודות פנימיות בחומר המדגם. זה מהווה את הבסיס לספקטרוסקופיית הנייטרונים, שבה הנייטרונים המפוזרים נחקרים כפונקציה הן של העברת האנרגיה E והן של העברת התנע Q. מתקבל מידע דינמי ומבני. ספקטרוסקופיית הנייטרונים מודדת את אותה עוצמה משולבת S(Q) להעברת אנרגיה (כלומר, שינוי מהירות של הנייטרונים עקב פיזור דגימות, S(Q,ω) = S(Q, E), המכונה גם גורם המבנה הדינמי)⁹.

לחישוב הפיזור מחומר, מתאים יותר להשתמש בפונקציית המתאם הזוגי ^7,10. במקרה של עקיפה, פונקציית המתאם הזוגי הסטטי G(r) נותנת את ההסתברות למצוא את מרכז החלקיק במרחק נתון r ממרכזו של חלקיק אחר. הספקטרוסקופיה מכלילה את פונקציית המתאם הזוגי הסטטי וכוללת אנרגיה/תדר/זמן במשוואת הפיזור. פונקציית המתאם הזוגי G(r) הופכת לפונקציה של זמן G(r, t), אשר ניתן לפרק אותה לפונקציית מתאם זוג אטומים מובחנת G_D(r, t), ולפונקציית מתאם עצמי G_S(r, t). אלה מתארים שני סוגים של קורלציות: תנועות מתואמות-זוגיות של אטומים השולטות בפיזור הקוהרנטי, ומתאם עצמי השולט בפיזור הלא קוהרנטי¹⁰.

פיזור קוהרנטי הוא הפיזור מ”הממוצע” ותלוי בפאזה היחסית של הגלים המפוזרים. במשטר הפיזור בזווית קטנה, גלי הנייטרונים המפוזרים ממרכזי פיזור שונים (אטומים שונים) מתערבים באופן קונסטרוקטיבי (בעלי פאזות דומות), והתנועה הקולקטיבית של האטומים נצפית בהגברת עוצמה חזקה. פיזור קוהרנטי מתאר למעשה פיזור של נויטרון יחיד מכל הגרעינים בדגימה¹⁰.

כאשר לא מתרחשת התאבכות קונסטרוקטיבית בין גלי הנייטרונים המפוזרים ממרכזים שונים, מתקיים אטום יחיד בזמן, ונצפה המתאם העצמי בין מיקום האטום בזמן t = 0 לבין אותו אטום בזמן t. לפיכך, המידע על מיקומם היחסי של האטומים הולך לאיבוד, וההתמקדות היא רק בתנודות מקומיות. פיזור מתנודות מקומיות שולט בפיזור לא קוהרנטי. פיזור לא קוהרנטי הוא איזוטרופי, תורם לאות הרקע ומפרק את האות לרעש^10,11.

בשילוב כל האמור לעיל, אנו מבחינים בארבעה תהליכי פיזור נויטרונים עיקריים¹⁰: (1) קוהרנטי אלסטי (מודד את המתאמים של מיקומי אטומים), (2) קוהרנטי לא אלסטי (מודד תנועות קולקטיביות של אטומים), (3) לא קוהרנטי אלסטי (תורם לרקע, מפחית את עוצמת הפיזור על ידי גורם דבי-וולר (DWF) ומודד גורם מבנה לא קוהרנטי אלסטי (EISF), המתאר את הגיאומטריה של תנועות דיפוזיביות בגאומטריה מוגבלת, ו-(4) אי-קוהרנטי לא-אלסטי (מודד דינמיקה של אטום יחיד ומתאם עצמי).

תהליכים דינמיים שנייטרונים יכולים לגשת אליהם בביולוגיה נעים בין דעיכה של תנודות אטומיות ומולקולריות בתדר נמוך, אינטראקציה של מולקולות ממס עם משטחים ביולוגיים, ותהליכי דיפוזיה בשכבת ההידרציה של מקרומולקולות וגיאומטריה מוגבלת, ועד לתנועות דיפוזיביות תרגומיות, סיבוביות ומטלטלות קצרות טווח, ותחומי חלבונים ותנועות אלוסטריות¹ . המגוון הרחב של שיטות ומכשירים של נויטרונים למדידת דינמיקה של חלבונים מבוסס על האופן שבו מושגת הכרומטיזציה של האירוע או קרן הנייטרונים היוצאת וכיצד מתבצע ניתוח האנרגיה של הנייטרונים המפוזרים. מ-triple-axis ל-time-of-flight,backscattering וספקטרומטרים של ספין-הד, ניתן לחקור תהליכים דינמיים עם זמנים אופייניים בין 1 x ^10-14 s ^{ו-1 x 10-6} s (femtoseconds למיקרו-שניות)¹².

המעבדה הלאומית אוק רידג’, עם שני מקורות הנייטרונים הנודעים שלה, מקור הנייטרונים של Spallation – SNS¹³ וכור השטף האיזוטופי הגבוה – HFIR¹⁴, כוללת את אחת החבילות הטובות ביותר של ספקטרומטרים לחקר דינמיקה בחומרים ביולוגיים. כמה מהדוגמאות הרהוטות ביותר כוללות את השימוש בספקטרומטר מסוק הנויטרונים הקר (CNCS) ב- SNS¹⁵ כדי לחקור את ההפרעה הדינמית של מי הידרציה סביב חלבון פלואורסצנטי ירוק בתמיסה¹⁶ או את התנודות הקולקטיביות של תת-פיקוז-שניות של מספר חלבונים¹⁷. בעיה חוזרת ונשנית של חקירות פיזור נויטרונים לא אלסטיות היא שחלק מהתהליכים הביולוגיים איטיים מכדי שניתן יהיה לצפות בהם. ללא הגדרות קיצוניות המובילות לאובדן עצום של עוצמת הנייטרונים, ספקטרומטרים של זמן טיסה מוגבלים לרזולוציה של אנרגיה של 10 μeV, המתאימה לסולם זמן מרבי של ~ 200 ps^10,11. זה לא מספיק כדי לצפות בתנועות בקנה מידה גדול בחלבונים. לכן, מכשירים עם רזולוציית אנרגיה גבוהה יותר כמו הספקטרומטרים האחוריים נדרשים לעתים קרובות. השילוב של טכניקות זמן הטיסה וההתרסקות האחורית הוכיח את עצמו כבעל עוצמה לחקר השינוי בדינמיקה הפנימית של ציטוכרום P450cam (CYP101), אנזים המזרז את קמפור ההידרוקסילציה¹⁸.

דיפוזיה מיקרוסקופית שנמדדה על ידי הספקטרומטר האחורי ב-SNS-BASIS¹⁹ הוגדרה היטב באופן מפתיע וניתן היה להפריד אותה לפיזור המים (הידרציה, ציטופלסמית ומים דמויי תפזורת) ולפיזור המרכיבים התאיים בתולעים שטוחות פלנריות, החיה החיה הראשונה שנחקרו על ידי פיזור נויטרונים²⁰ . Backscattering היא טכניקה ספקטרוסקופית ברזולוציה גבוהה, אך היא מוגבלת גם למספר μeV = מספר ננו-שניות, בעוד שהדינמיקה האיטית בביו-חומרים מתבטאת גם בזמן ההישרדות של המתאם בין מיקום אטומי או כיווני ספין (למשל, תהליכי הרפיה, המתרחשים באופן קבוע בטווח הזמן של עשר עד מאות ננו-שניות).

ספקטרוסקופיה של הד ספין נויטרונים (NSE) היא טכניקת פיזור הנייטרונים היחידה שהגיעה לרזולוציה כה גבוהה. שלא כמו טכניקות נויטרונים אחרות, NSE אינו דורש אכרומטיזציה של הקרן מכיוון שהוא משתמש בפאזה המכנית הקוונטית של הנייטרונים, שהיא המומנטים המגנטיים שלהם. המניפולציה של מומנטים מגנטיים מאפשרת שימוש בהתפלגות רחבה של אורכי גל של קרן נויטרונים, בעוד שהטכניקה רגישה לשינויים קטנים מאוד במהירות הנייטרונים בסדר גודל של 1 x ^10-4. NSE שימש בהצלחה כדי לחקור את הדינמיקה האיטית של חלבונים בתמיסה עבור חלבונים רבים. בין המחקרים החלוצים הרבים הללו, אנו מכירים בחקר הגמישות המגזרית של אימונוגלובולין חזיר²¹; תנועות התחום המצומדות בטאק פולימראז²²; תנועות התחום בטטרמר של אלכוהול שמרים דהידרוגנאז²³; שינוי הקונפורמציה בפוספוגליצראט קינאז על המצע המחייב³; הפעלת תנועות תחום וההתפשטות הדינמית של אותות אלוסטריים בחלבון ^4,24,25; הדינמיקה של מצב קומפקטי של יון כספית רדוקטאז²⁶; והפצת המוגלובין בתאי דם אדומים²⁷. שני מחקרים עדכניים יותר בדינמיקה של חלבונים חשפו את הגמישות של הנוגדן האנושי אימונוגלובולין G (IgG) כמעיין אנטרופי²⁸ ואת המאפיינים של תרומת הממסים לדינמיקה של חלבון בסיסי מיאלין (MBP)⁵ בעל הפרעה פנימית.

המאמר הנוכחי מסביר את העקרונות הבסיסיים של NSE, את שיטות ההכנה המרובות המומלצות לחקירה יסודית של דינמיקת חלבונים, כמו גם את המתודולוגיה ואת הפרוטוקול הניסיוני לרכישת נתוני NSE בספקטרומטר NSE ב- SNS, SNS-NSE. הפרוטוקול מאפיין שני חלבונים: IgG, חלבון נוגדן אנושי רגיל, וחלבון MBP בעל הפרעה פנימית. ההשלכות הביופיזיות, הרלוונטיות המחקרית של הדוגמאות ומגבלות הטכניקה נדונים בקצרה.

ספקטרוסקופיה של NSE, השיטה למדידות דינמיקה איטית
NSE היא טכניקה מקוטבת המשתמשת בזמן טיסה של נויטרונים כדי למדוד את חילופי האנרגיה (אובדן הקיטוב) עקב האינטראקציה המעין-אלסטית בין נויטרונים ואטומים בדגימה. בליבת הספקטרוסקופיה של NSE מסתתרים שני עקרונות בסיסיים: (1) יכולתו של ספין הנייטרונים להקדים בשדה המגנטי בתדר פרופורציונלי לעוצמה מגנטית , כלומר תדר לרמור²⁹, ו-(ב) הספין-הד או הד האן, המייצגים את המניפולציה וההתמקדות מחדש של אות הקיטוב בעת הפעלת סדרה של פולסים בתדרי רדיו³⁰.

ניתן לסכם את היסודות של תהליך NSE בכמה שלבים פשוטים ^6,11 באמצעות איור 1. (1) קרן הנייטרונים המיוצרת על ידי המקור (מיקום 1) מקוטבת (מיקום 2), מונחית ומובלת (מיקום 3), ומגיעה לכניסה לספקטרומטר NSE, שם היא מסתובבת ב-90° על ידי סנפיר ה-pi-half הראשון (מיקום 4). (2) הקרן המקוטבת (למשל, מומנטים מגנטיים של נויטרונים) הופכת בניצב לקווי השדה המגנטי של המגנט הראשון (אזור הקדם הראשון, מיקום 5) ומתחילה להקדים. (3) בקצה המגנט, ספיני נויטרונים צוברים זווית קדימה מסוימת ביחס לחוזק השדה המגנטי ולזמן הטיסה המושקע בתוכו (בעצם ביחס הפוך למהירות הנייטרונים). מהירויות הנייטרונים האינדיבידואליות מקודדות בזווית הקדימה שלהן בסוף אזור הקדימה הראשון. (4) קרוב למיקום המדגם, ה-pi-flipper (מיקום 6) הופך את כיוון הספין ב-180°, ומשנה את הסימן של זווית הקדם-זווית. (5) הנייטרונים מתקשרים עם המולקולות של הדגימה (מיקום 7) ומתפזרים. (6) הנייטרונים המפוזרים נכנסים ומקודמים לאזור הקדימה השני (מיקום 8) אך הופכים להיות בעלי אוריינטציה הפוכה. (7) סנפיר פי-חצי נוסף (מיקום 9) משמש לסיבוב כיוון הספין מהניצב לכיוון האופקי. פעולה זו תעצור את הקדימה, ותתרגם את זווית הקדם-φ לקיטוב פרופורציונלי ל-cos(φ). (8) המנתח (עמדה 10) בוחר את הנייטרונים על סמך כיוון אחד. אם האינטראקציה עם הדגימה היא אלסטית, מהירות הנייטרונים לא תשתנה. הנייטרונים יבלו פרק זמן זהה בטיסה באזורי הקדם הראשון והשני, וזוויות הקדימה המצטברות יתאוששו במלואן. הקיטוב המלא משוחזר על הגלאי (מיקום 11) כהד לקיטוב המקורי (כלומר, ספין-הד). (9) עם זאת, ב-NSE, הפיזור הוא מעין אלסטי, ולכן חילופי אנרגיה קטנים בין נויטרונים למולקולות דגימה מובילים למהירויות נויטרונים שונות לאחר פיזור על ידי הדגימה. בשל המהירויות השונות, הנייטרונים יבלו זמן נוסף בטיסה דרך אזור הקדם השני ולא יתאוששו כראוי מזווית הקדימה שלהם. קיטוב חלקי נשלף על הגלאי, ואובדן הקיטוב עקב הרפיית הספין פרופורציונלי להתמרת קוס-פורייה של הפונקציה הספקטרלית S(Q, ω), פונקציית פיזור הביניים F(Q, t). (10) פרמטר הזמן של הפונקציה F(Q, t) פרופורציונלי לחוזק השדה המגנטי של הקדם-קדם-חזה. סריקת אובדן הקיטוב כפונקציה של עוצמת השדה המגנטי מניבה, אם כן, פונקציית הרפיה התלויה בתהליכים הדינמיים בתוך המדגם.

איור 1: תצלום של הספקטרומטר NSE ב-SNS (SNS-NSE) ושל סכמת נתיב זבוב הנייטרונים עם הרכיבים הפונקציונליים החשובים ביותר. מימין לשמאל: 1 = מקור נויטרונים; 2 = מסוקים-בנדר-מקטב-מערכת תריסים משנית; 3 = מדריכי הובלת קרן; 4 = סנפיר pi/2 לסיבוב-סיבוב ספין 90° ראשון; 5 = אזור הקדם הראשון; 6 = סנפיר pi עבור סיבוב ספין 180°; 7 = אזור המדגם וסביבת הדגימה (כאן מוצג תנור הקריו); 8 = אזור הקדם השני; 9 = סנפיר pi/2 עבור סיבוב ספין 90° שני; 10 = מנתח; 11 = גלאי. (שימו לב שחלקים של 3, כמו גם 2 ו-1, ממוקמים מאחורי הקיר הכחול בתוך המיגון; המסוקים מוחלפים בבורר מהירות עבור NSE מבוסס כור). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.