Automated Gait Analysis to Assess Functional Recovery in Rodents with Peripheral Nerve or Spinal Cord Contusion Injury

Johannes Heinzel; Nicole Swiadek; Mohamed Ashmwe; Alexander R&#252;hrn&#246;&#223;l; Viola Oberhauser; Jonas Kolbenschlag; David Hercher

doi:10.3791/61852

JoVE Journal > Neuroscience

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Neurociencias

تحليل مشية الآلي لتقييم الانتعاش الوظيفي في القوارض مع الأعصاب الطرفية أو إصابة كدمة الحبل الشوكي

Published: October 06, 2020

doi:

10.3791/61852

Johannes Heinzel^1,2,3, Nicole Swiadek^2,3, Mohamed Ashmwe^2,3, Alexander Rührnößl^2,3, Viola Oberhauser^2,3, Jonas Kolbenschlag¹, David Hercher^2,3

¹Department of Hand-, Plastic, Reconstructive and Burn Surgery, BG Trauma Center Tubingen,Eberhard Karls University, ²Ludwig Boltzmann Institute for Experimental and Clinical Traumatology, ³Austrian Cluster for Tissue Regeneration

Summary

تحليل المشي الآلي هو أداة مجدية لتقييم الانتعاش الوظيفي في نماذج القوارض من إصابة الأعصاب الطرفية وإصابة كدمة الحبل الشوكي. في حين أنه يتطلب إعداد واحد فقط لتقييم وظيفة الحركي في مختلف النماذج التجريبية، دقيق من الصعب لينة وير التكيف وتدريب الحيوانات أمر بالغ الأهمية.

Abstract

تتم دراسة إصابات الأعصاب الطرفية والمركزية في الغالب في القوارض ، وخاصة الفئران ، نظرًا لحقيقة أن هذه النماذج الحيوانية فعالة من حيث التكلفة وقد تم نشر الكثير من البيانات المقارنة في المؤلفات. وهذا يشمل العديد من أساليب التقييم لدراسة الانتعاش الوظيفي بعد إصابة الأعصاب وإصلاح. بالإضافة إلى تقييم تجديد الأعصاب عن طريق علم الأنسجة ، الفيزيولوجيا الكهربائية ، وغيرها في تقنيات التقييم في الجسم الحي وفي المختبر ، فإن الانتعاش الوظيفي هو المعيار الأكثر أهمية لتحديد درجة التجدد العصبي. يسمح تحليل المشي الآلي بتسجيل كمية هائلة من المعلمات ذات الصلة بالمشي مثل منطقة باو للطباعة وسرعة باو سوينغ بالإضافة إلى مقاييس التنسيق بين الأطراف. بالإضافة إلى ذلك، توفر هذه الطريقة بيانات رقمية عن كفوف الفئران بعد تلف الخلايا العصبية وأثناء تجديد الأعصاب، مما يضيف إلى فهمنا لكيفية تأثير الإصابات العصبية الطرفية والمركزية على سلوكهم الحركي. إلى جانب نموذج إصابة العصب الوركي المستخدم في الغالب ، يمكن دراسة نماذج أخرى من إصابة الأعصاب الطرفية مثل العصب الفخذي عن طريق هذه الطريقة. بالإضافة إلى إصابات الجهاز العصبي المحيطي ، يمكن تقييم آفات الجهاز العصبي المركزي ، على سبيل المثال ، كدمة الحبل الشوكي. يعتمد تقييم البيانات الصالح والقابل لإعادة الإنتاج بشكل قوي على الضبط الدقيق لإعدادات الثابت والبرمجيات قبل الحصول على البيانات. بالإضافة إلى ذلك، التدريب المناسب للحيوانات التجريبية هو من الأهمية الحاسمة. يهدف هذا العمل إلى توضيح استخدام التحليل الآلي المحوسب ل المشية لتقييم التعافي الوظيفي في نماذج حيوانية مختلفة من إصابة الأعصاب الطرفية وكذلك إصابة كدمة الحبل الشوكي. كما يؤكد على القيود التي تفرضها الطريقة، مثل تقييم تجديد الأعصاب في الفئران المصابة بتشلس الأعصاب الوركي بسبب محدودية الانتعاش الوظيفي. لذلك ، يعتقد أن هذا البروتوكول يساعد الباحثين المهتمين بالإصابات العصبية الطرفية والمركزية على تقييم الانتعاش الوظيفي في نماذج القوارض.

Introduction

وغالبا ما تدرس إصابات الجهاز العصبي المحيطي والمركزي في القوارض، مما أدى إلى كمية كبيرة من البيانات المقارنة بشأن مسار إصابة الأعصاب، وإصلاح، أو العصبية لمواجهة المزيد من الإصابات الثانوية وتجديد¹^و²^،³. يمكن تقييم نتائج استراتيجيات العلاج التجريبية في نماذج القوارض من خلال مجموعة متنوعة من التقنيات مثل الأنسجة ، والكيمياء المناعية ، والفيزيولوجيا الكهربائية ، وتقنيات التصوير مثل الأشعة السينية microtomography (μCT) بمسح ، ولكن المعيار الأكثر أهمية لتحديد نجاح العلاج هو – مثل في المرضى الإنسان — درجة الانتعاش الوظيفي⁴^،⁵. الدراسات الأولى التي تحقق الأداء الحركي في القوارض يعود تاريخها إلى 1940s⁶^,⁷^,⁸. الفئران والجرذان كانت تخضع لكمية كبيرة من الدراسات التي تحقق في سلوكها الحركي في العقود التالية⁹^,¹⁰^,¹¹. في الوقت الحاضر ، مجموعة واسعة من تقنيات التقييم لنماذج القوارض من إصابات الأعصاب الطرفية والمركزية موجودة ، تتراوح بين تحليل مسار المشي بالحبر والورق¹²^،¹³^،¹⁴ على الكاحل والمشية¹⁵^،¹⁶^،¹⁷ إلى أساليب التعلم الآلي المعززة ، والتي تسمح بتقدير معقد من المشية ، والأطراف ، والمسارات المشتركة¹⁸^،¹⁹.

يستخدم التحليل الآلي لـ Gait (AGA) المحوسب لتقييم وظيفة الحركيين في أعقاب الإصابات العصبية الطرفية والمركزية والعلاج التجريبي المحتمل لمثل هذه الإصابات. يتكون الجهاز بشكل رئيسي من ممر زجاجي ومصدر ضوء يضيء مطبوعات مخلب القوارض ارتباطًا بالضغط الذي يتجاوزه. ثم يتم حوسبة هذه البيانات لحساب مجموعة واسعة من المعلمات الثابتة والديناميكية. وفقا ل Deumens ، يمكن تقسيم هذه المعلمات إلى فئات من المعلمات العامة ، والمعلمات المتعلقة بالألم ، وكذلك المعلمات ذات الصلة بالتنسيق من مشية²⁰ (الجدول 1). وقد ثبت جدوى AGA للكشف عن التغيرات في سلوك المشية في نماذج الحيوانات المختلفة من إصابة العصب المحيطي (PNI)²¹، مثل العصب الوركي²⁰، العصب الفخذي²²، والعصب المتوسط²³^،²⁴. كما أنها تستخدم بشكل روتيني لتقييم وظيفة الحركي في الفئران مع إصابات عصبية مركزية، على سبيل المثال، السكتة الدماغية²⁵ أو كدمة الحبل الشوكي²⁶. تكمن تقدم الأسلوب في الكم الكبير من البيانات القابلة للمقارنة وإمكانية تسجيل عدد كبير من المعلمات المتعلقة بالمشي²⁷. تهدف هذه الورقة إلى تزويد الباحثين المهتمين بالنماذج الحيوانية لـ PNI وإصابة الحبل الشوكي (SCI) بمبدأ توجيهي مفصل وعملي لتقييم وظيفة الحركي في مثل هذه النماذج.

الفئه	المعلمه	وصف
معلمات عامّة مشية	منطقة الطباعة (وحدة المسافة)	مساحة من مخلب الطباعة
	طول الطباعة (وحدة المسافة)	طول طباعة مخلب
	قاعدة الدعم (وحدة المسافة)	المسافة بين الكفوف الخلفية أو الأمامية
	طول المدى (وحدة المسافة)	المسافة بين اثنين من المواضع المتتالية من مخلب
المعلمات المتعلقة بالألم من المشية	وقت التأرجح (ق)	مدة مرحلة التأرجح
	وقت الوقوف (ق)	مدة مرحلة الموقف
	متوسط كثافة طباعة مخلب (وحدة تعسفية)	يعني iIntensity من مخلب الطباعة خلال مرحلة الموقف
التنسيق ذات الصلة معلمات مشية	أنماط تسلسل الخطوات العادية (NSSP)	تسلسلات محددة من مواضع مخلب خلال دورة خطوة
	تشتت المرحلة (%)	الاختلافات الزمنية بين دورات الخطوة من اثنين من الكفوف محددة
	مؤشر الانتظام (نسبة مئوية)	القياس الكمي للتنسيق بين ااإلتشابه من خلال تقسيم كمية من لا تشوبه شائبة NSSP مرات 4 على العدد الإجمالي لوضع مخلب خلال دورة خطوة واحدة

الجدول 1: معلمات المشية التي يمكن تقييمها مع تحليل المشي الآلي. ويتم اختيار الفئات التي تصنف فيها المعلمات وفقا لـ Deumens et^{al. 20}.

Protocol

وقد وافق مسبقا على البروتوكول التجريبي لجميع التجارب من قبل مجلس استعراض بروتوكول الحيوان لحكومة مدينة فيينا. وقد نفذت جميع الإجراءات وفقاً تماماً لإعلان هلسنكي بشأن حقوق الحيوان ودليل رعاية الحيوانات المختبرية واستخدامها التابعين للمعاهد الوطنية للصحة. 1- إسكان الحيوانات البيت الذكور الفئران (لويس أو Sprague داولي) وزنها 250-300 غرام تحت 12 ساعة دورة خفيفة / داكنة مع الإعلان libitum الوصول إلى الغذاء والماء. التحكم في درجة حرارة الغرفة (التي يتم الحفاظ عليها عند 20-22 درجة مئوية) والرطوبة (45٪ -65 ٪ ) من أجل السكن الملائم للحيوانات. لهذا العمل، تم استخدام الفئران لويس الذكور (PNIs) وSprague داولي (SCI). توفير قفص جديد ونظيف مرتين في الأسبوع. فئران المنزل في مجموعات من اثنين أو ثلاثة ومراقبة عن كثب سلوكهم الاجتماعي والتفاعل. السماح للفئران فترة تأقلم لمدة أسبوع على الأقل قبل أي إجراء جراحي أو اختبار وظيفي.ملاحظة: الجرذان تتطلب ما لا يقل عن 5 أيام من التدريب اليومي على جهاز تحليل المشية قبل الجراحة، وذلك حساب ما لا يقل عن 2 أسابيع بين وصول الفئران إلى منشأة والبيانات المقررة للجراحة التجريبية28. 2. تحريض إصابة الأعصاب ملاحظة: ارتدي معدات الحماية الشخصية مثل ثوب جراحي وقفازات وقناع. في حالة عدم توفر ثوب جراحي معقمة ، فإن معطف المختبر النظيف المغسول كافٍ أيضًا. ما لم يصبح ملوثا، لا يحتاج الثوب أو المعطف إلى تغيير بين الحيوانات ولكن بين جلسات الجراحة. ينصح باستخدام القفازات الجراحية المعقمة. في حالة عدم توفر هذه القفازات، يمكن أيضا أن تستخدم قفازات الفحص ولكن ينبغي غسلها قبل الجراحة باستخدام مطهر الجراحية. يجب تغيير القفازات بين الحيوانات. في يوم الجراحة ، حاول تقليل أي قدر من الإجهاد للحيوانات لأن هذا قد يتعارض مع التخدير ، على سبيل المثال ، ستحتاج الحيوانات إلى جرعات أعلى من التخدير. في يوم الجراحة, حقن 0.05 ملغ بوبرينورفين / كجم وزن الجسم في التعليق مع 100-200 ميكرولتر 0.9% دون الجلد ناكل باستخدام 25 G كانولا 1 ح قبل الجراحة لتوفير ما قبل و التشغيل المتداخل المسكنات. إذا لم يتم الإشارة إلى خلاف ذلك، الجناح الجرذ هو الموقع المفضل للحقن. تخدير الفئران عن طريق وضعها في غرفة تحريض التخدير متصلة بمرذاذ سيفوفلوران وحاوية الطباشير النشطة لامتصاص CO2. تخدير الجرذ عن طريق إغراق صندوق التخدير بـ 4% –5% من خليط سيفوفلوران والأكسجين لمدة 5 دقائق تقريباً باستخدام تدفق أكسجين 1.5 لتر/دقيقة (مرحلة البدء). قم بتوصيل مقطع قياس أكسدة النبض بأحد الكفوف لمراقبة تشبع الأكسجين في دم القوارض. الحفاظ على حالة التخدير العام مع 2.5٪ – 4.5٪ sevoflurane-oxygen خليط.ملاحظة: بالنسبة للجراحة التجريبية، يكون التخدير العام إلزاميًا. تأكيد التخدير العام عن طريق التحقق من عدم وجود استجابة لقرصة التحفيز من الذيل أو الكفوف. عندما دخل الجرذ التخدير العام، حلق المساحة ذات الصلة التي سيتم تشغيلها وتعقيم المنطقة عن طريق تمريرها بالتناوب مع الكحول ومطهر الجلد. وينبغي أن يتم تنفيذ الضرب النهائي مع مطهر الجلد. وضعه على وسادة التدفئة قابل للتعديل في الموقف المطلوب (سوبين لنموذج العصب الفخذي, عرضة لنموذج الوركي و SCI). أدخل مسبار ميزان الحرارة المرن في المستقيم للجرذ لمراقبة درجة حرارة الحيوان والحفاظ عليه عند حوالي 37 درجة مئوية أثناء الجراحة. أثناء التخدير، وحماية عيون الفئران من جفاف باستخدام مرهم العين 3. الحث الجراحي للإصابة العصبية عند إجراء العمليات الجراحية، الالتزام الصارم بالمبادئ السبعة لـ Halsted29 على النحو التالي: التعامل دائما الأنسجة بلطف عند العمل معهم. تجنب تمزيق أو سحق الأنسجة.ملاحظة: نظمالحفّاظ 30 أو المتوفرة تجاريًا مفيدة للحفاظ على العضلات والسفن خارج مجال التشغيل. الحفاظ بعناية على الهيمفاسين باستخدام الهيموستات الكهربائية لتكويد السفن أو الأربطة لضمان hemostasis دقيق. الحفاظ دائما على إمدادات الدم إلى الأنسجة عن طريق تشريح لهم بعناية والتعامل معها بدقة. الحفاظ على asepsis صارمة من خلال ارتداء قناع، ثوب، والقفازات العقيمة. تجنب التوتر على الأنسجة عن طريق تطبيق الغرز التي ليست ضيقة جدا ولا فضفاضة جدا. appose بدقة الأنسجة من خلال الجمع بين حواف كل منها معا دون أي تداخل.ملاحظة: هذا مهم بشكل خاص في حالة الورهاض العصبي الأذيني أو الأذيني. تنفيذ جميع الإجراءات الجراحية الدقيقة تحت التكبير 6x-16x باستخدام مجهر التشغيل. من الناحية المثالية ، يوفر المجهر زوجين من العينين للسماح بمراقبة العملية من قبل مساعد. تجنب إنشاء مساحات ميتة عن طريق خياطة طبقات الأنسجة المختلفة بعناية. تحريض العصب الوركي العصبي من hindlimb الحق كشف العصب الوركي الأيمن في المستوى المتوسط من خلال إجراء شق طوله 5 سم على الجانب الظهري من الطرف الخلفي مع شفرة مشرط #10 متصلة بمقبض مشرط #3 وعن طريق تشريح العضلات والأنسجة الرخوة. وضع الداحف داخل الجرح للحفاظ على العضلات تشريح والجلد من الموقع. برفق كشف العصب عن طريق إزالة الأنسجة المحيطة باستخدام مقص microsurgical المنحني. إزالة 8 مم شريحة العصب طويلة من العصب الوركي 1-2 ملم قريبة إلى trifurcation مع مقص مصغ جراحي مستقيم. قم بتدوير الجزء العصبي 180 درجة، وضعه بين الجذع القريب والهرج من العصب الوركي المقطع، و قم بإجراء rrhaphy عصبي الظهارية في كل موقع مع اثنين من خياطة توقف 10-0 وحامل إبرة مجهرية. تحريض العصب الفخذي على hindlimb الأيمن قم بإجراء شق في الفخذ طولي 3-4 سم مع شفرة مشرط #10 متصلة بمقبض مشرط #3 من أجل الكشف عن الحزمة العصبية الوعائية الفدائية الفورية الصحيحة. استخدم المقص الجراحي لتشريح حاد حتى يتم الكشف عن تشعب العصب الفخذي. وضع الداحف داخل الجرح للحفاظ على العضلات تشريح والجلد من الموقع. تحويل السيارات المكشوفة والأغصان الحسية إلى تشعب واستئصال 6 ملم جزء العصب الطويل من كل فرع، على التوالي، وذلك باستخدام مقص الجراحية الدقيقة على التوالي. تدوير كلا من قطاعات الأعصاب 180 درجة، ووضعها بين جذع قريب وهرج من فروع العصب الفخذي مقطّعة وتنفيذ الrrhaphy العصبية الظهارية في كل موقع مع اثنين من خياطة توقف 11-0 وحامل إبرة مجهرية.ملاحظة: تنفيذ الكسب غير المتماثل للأعصاب الذاتي عن طريق تطعيم الكسب غير المشروع في المحرك إلى فرع المحرك الأصلي والكسب غير المشروع الحسي إلى الفرع الحسي الأصلي. بدلا من ذلك، تنفيذ الكسب غير الآلي للأعصاب الذاتية عن طريق تطعيم الكسب غير المشروع المحرك إلى الفرع الحسي الأصلي والعكس بالعكس. تحريض إصابة كدمة الحبل الشوكي الصدري قم بإجراء شق جلدي عبر العمود الفقري الصدري مع شفرة مشرط #10 متصلة بمقبض مشرط #3 متبوعة بشقين عضليين متوازيين مع العمليات العرضية لتسهيل تراجع العضلات. وضع الداحف داخل الجرح للحفاظ على العضلات تشريح والجلد من الموقع. تحديد 11th فقرة صدرية (Th) وفضح الصفيحة من قوس الفقرات عن طريق إزالة الأنسجة فوقية فضلا عن عملية الانسة باستخدام rongeur. إجراء عملية استئصال لامينك باستخدام حفر الدقيقة والبور المناسبة لحفر حفرة صغيرة في لامينا, أكبر قليلا من غيض من الأثر. لمنع تلف الحبل الشوكي، فقط رقيقة خارج لامينا أثناء فتح وتوسيع الثقب باستخدام rongeur. إذا كان الغشاء ما زال سليماً، قم بإزالته بعناية باستخدام مسبار حاد من دون إتلاف ماطر الجافية. بعد ضمان إجراء ثقب كبير بما فيه الكفاية دون زعزعة استقرار الصفيحة ، عقد العمود الفقري للحيوان في مكان عن طريق لقطه rostrally وcaudally إلى Th11 مع ملقط تثبيت الارتطام. باستخدام عجلات اليد في الجبهة والجانب، ضع قضيب الصلب 3-5 مم فوق ثقب استئصال لاميني. وأخيرا، إخضاع جميع الحيوانات لتأثير مع قوة محددة من 150 كيلو ا االحث على درجة خفيفة إلى معتدلة من إصابة كدمة الحبل الشوكي4. قم بإجراء إغلاق الجروح في الطبقات التشريحية باستخدام البوليجلات 4-0 أو 5-0 خياطة متقطعة وحامل إبرة جراحية. تنظيف الجرح جيدا عن طريق مسح بلطف مع وسادة الشاش غارقة في 0.9٪ 1999. بعد الجراحة، إعادة الحيوانات إلى قفصها المنزلي وإيواءهم من التعرض للضوء والصوت. مراقبة سلوك الحيوانات عن كثب حتى اليوم بعد الجراحة (DPO) 7 وضمان كمية كافية من الغذاء والماء. إذا لزم الأمر، وتوفير السوائل إضافية عن طريق الحقن تحت الجلد (على سبيل المثال، 10 مل 0.9٪). توفير مسكن ما بعد الجراحة لمدة لا تقل عن يومين عن طريق، على سبيل المثال، المواد الأفيونية (0.05 ملغ/كغم وزن الجسم Buprenorphine تحت الجلد (s.c.)) و / أو مضادات الخافتات (4 ملغ/كغم Carprofen s.c). إذا لزم الأمر، وفي حالة نموذج SCI، كما توفر العلاج بالمضادات الحيوية بعد العملية الجراحية (7.5 ملغ/كغ وزن الجسم Enrofloxacin في نظام التشغيل (p.o.)). في حالة إصابة الحبل الشوكي ، إفراغ مثانة الفئران يدويًا حتى يعود التبول التلقائي. 4. التعافي من التدخلات الجراحية قبل تحليل المشية ملاحظة: الفئران مع إصابة العصب الوركي تظهر الميل إلى نخر على الكفوف الخلفية بسبب بداية الاعتلال العصبي المؤلم بعد إصابة الأعصاب. هذا الشكل من التبدل التلقائي يمكن أن يؤدي إلى autoamputation أصابع أو أجزاء من مخلب الخلفية المعنية. تفضل الفئران لويس على غيرها من سلالات الفئران في حالة عند استخدام نموذج إصابة العصب الوركي، كما يظهر هذا سلالة الفئران ميل أصغر ل التلقائي31. تظهر الفئران المصابة بإصابة العصب الوركي أيضًا الميل إلى تطوير انكماشات الطرف الذي يتم تشغيله ، مما قد يؤدي إلى استبعادها من الدراسة بسبب التدخل في الحصول على البيانات. تحدث مثل هذه الأحداث الضائرة أقل شيوعًا في الفئران المصابة بإصابة الفخذ. فحص الحيوانات التي تعمل يوميا بعد الجراحة مع إيلاء اهتمام خاص لحالة أطرافهم والكفوف، على التوالي.ملاحظة: في الفئران مع SCI، في ذروة Th11، قد يحدث هبوط القضيب أو المستقيم بسبب ضعف القدرة الطبيعية للحيوانات على التبول والتبرز. وتعرف هذه الأحداث عادة على أنها نقاط نهاية بشرية للدراسة وتنطوي على استبعاد فوري للحيوان المصاب من الدراسة. استمر في المسكنات بعد الجراحة حتى تتوقف الفئران عن عرض أي أعراض مرتبطة بالألم. في حالة الألم المستمر، وإعطاء gabapentin (30-120 ملغ / كجم وزن الجسم) p.o. لعلاج الألم العصبي. 5. التحضير قبل إجراء تحليل المشي الآلي ملاحظة: تعتمد منهجية نظام تحليل المشية على تسجيل الحيوانات من الأسفل أثناء عبور لوحة زجاجية ، والتي تضيء بضوء LED أخضر. عندما تتصل كفوف الحيوانات بالأرض، يتم إضاءة منطقة بصمة الكفوف وتسجيلها بواسطة كاميرا فيديو عالية السرعة. ثم يتم إرسال هذه البيانات عبر كابل إيثرنت إلى جهاز كمبيوتر يعمل على برنامج تحليل المشية. في حين يمكن تصنيف آثار أقدام فردية يدويًا من قبل المجرب ، فإن أحدث إصدار برمجي يتميز أيضًا بتصنيف البصمة التلقائي. تنفيذ جميع إجراءات الاختبار في الظلام وفي غياب الضوضاء المزعجة. منذ الفئران قادرة على إدراك الترددات الأسرع من الصوت، والتحقق أيضا من أن أي مصادر تنبعث منها مثل هذه الأصوات.ملاحظة: إجراء تحليل مشية إما أسبوعية أو كل أسبوعين، ولكن لا اختبار الفئران في كثير من الأحيان وخاصة الفئران لويس تميل إلى فقدان الاهتمام في المشاركة في الإجراء مع مرور الوقت عندما يتعرضون لممارسة معينة في كثير من الأحيان. ومع ذلك، مطلوب لتدريب الفئران يوميا لمدة 5 أيام قبل الجراحة لتأقلمها مع بيئة الاختبار والإجراءات. أثناء جلسات التدريب وفي يوم الاختبار، قم بإعداد غرفة الاختبار السلوكي عن طريق إيقاف جميع مصادر الضوء، والتي يمكن أن تتداخل مع كاميرا جهاز تحليل المشي الآلي. ضع شاشة الكمبيوتر الضرورية للحصول على البيانات بعيدًا عن الكاميرا لمنع ضوائها من التداخل مع الكاميرا. تأكد من تثبيت الجهاز في وضع مستقر وبطريقة تمنع أي شكل من أشكال الاهتزاز، لأن هذا سيتداخل بشكل خطير مع إجراء الحصول على البيانات. جلب الفئران إلى غرفة الاختبار السلوكي وتأقلمها في قفص المنزل لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاختبار.ملاحظة: عند التعامل مع الحيوانات، ارتدي معدات الحماية الشخصية مثل ثوب جراحي أو معطف مختبر وقفازات وقناع. 6. إجراء تحليل مشية الآلي الدورات التدريبيةملاحظة: خلال التدريب، سوف تخضع الحيوانات لمنحنى التعلم، لذلك فمن المستحسن تعديل جدول التدريب تدريجيا. استخدم مكافآت الطعام (على سبيل المثال، 1-2 قطعة من حبوب الإفطار) لمكافأة الحيوانات بعد الانتهاء بنجاح من كل دورة تدريبية. في اليوم الأول من التدريب، ارفع الحيوان بلطف من خلال حمله تحت جذعه وحمله بلطف إلى مدخل الممشى. وضع الحيوان في منطقة المدخل والسماح لها استكشاف فتح الممر دون أي تدخل من الشخص الذي يقوم بإجراء الاختبار.ملاحظة: لا تصرخ، صافرة، ضربة في أو كزة الحيوان في محاولة لتحفيزه لعبور الممشى. كل هذا السلوك سوف يشدد بشدة على الحيوان ويزيد من تعقيد إجراءات الحصول على البيانات. الانتظار حتى الحيوان يعبر طوعا الممشى للوصول إلى قفص منزله. في بعض الأحيان ، وخاصة في الحيوانات غير المدربة ، وهذا يمكن أن يستغرق ما يصل الى عدة دقائق. في يوم التدريب الأول ، لا يتوقع الحيوان ولا يطلب منه إجراء أشواط دون انقطاع بسرعة مشي موحدة. بدلا من ذلك ينبغي أن تتأقلم مع جهاز الاختبار والإجراءات. في اليوم الثاني من التدريب، اعتادت الحيوانات على دخول الممشى دون تردد، وأيضا للعودة إلى قفص هم المنزل دون تردد. ربما تكون بعض الحيوانات قد تعلمت بالفعل عبور الممشى دون انقطاع ، ولكن هذا لا يزال غير مطلوب في نهاية اليوم الثاني. في اليوم الثالث من التدريب، تأكد من تعلم الحيوانات عبور الممشى دون تردد، أو استنشاق، أو حركات استكشافية. تأكد من أنها تمشي بسرعة موحدة. في اليومين الرابع والخامس من التدريب، كرر التمرين السابق لتوحيد إجراء الاختبار.ملاحظة: في حالة عدم اكتساب الحيوان المهارة اللازمة لعبور الممشى بشكل صحيح بحلول نهاية فترة التدريب لمدة 5 أيام، أضف يومين إضافيين من التدريب (مثل عطلة نهاية الأسبوع). أيضا، النظر في أداء ما يصل إلى 3 دورات تدريبية في اليوم، مفصولة على الأقل 2 ساعة من الراحة بين دورة فردية. في 95٪ من الحالات، سيكون الحيوان قد اكتسب الخبرة التدريبية المطلوبة بحلول نهاية فترة التدريب الممتدة هذه. في حالة نادرة الحيوان لم تكتسب بعد هذه المهارة بعد 7 أيام من التدريب، فمن المستحسن تأجيل دورة الجراحة التجريبية المخطط لها لمدة 1 أسبوع على الأقل، وتكرار نظام التدريب المذكورة أعلاه. 7 – الحصول على البيانات ملاحظة: نظام تحليل مشية يتصور كل مخلب الطباعة بينما الحيوان هو المشي ويحلل تلقائيا معلمات مشية مختلفة مثل منطقة مخلب الطباعة، مخلب كثافة الطباعة، باو سوينغ تايم، و باو سوينغ سبيد(الجدول 1). كما نظام تحليل مشية سجلات جميع البيانات على أساس كثافة ولدتها الحيوانات ‘مخلب يطبع، تأكد من ضبط إعدادات الكاميرا وفقا لوزن الفئران وحجمها. بالإضافة إلى ذلك، تأكد من أن الممشى جاف ونظيف قبل تسجيل البيانات لمنع أي تأثير على الحصول على البيانات. قبل الحصول على أي بيانات، تنظيف الممشى باستخدام منظف الزجاج التجاري وممسحة. رش لوحة الزجاج عدة مرات ثم مسحها مع ممسحة لإزالة أي جزيئات من سطحها. أيضا، تنظيف تحت. تأكد من إزالة أي سائل من نهايات الممشى لأن الحيوانات يمكن أن تخطو عليه ، مما سيؤثر على البيانات المسجلة. كرر إجراء التنظيف كلما لزم الأمر ، على سبيل المثال ، تلوث الممشى وقبل تسجيل بيانات الجرذ من قفص مختلف. ويعتقد أن هذا لمنع الحيوان من أن يصرف من قبل رائحة conspecifics بهم. قبل الحصول على البيانات الأولى، ضبط إعدادات الكاميرا التي تناسب وزن الحيوانات. تأكد من ذلك عن طريق وضع أخف وأثقل على الممشى واختيار إعداد الكاميرا التي تمكن من جودة البيانات الجيدة في كلتا الحالتين. اضبط كسب الكاميرا، وإضاءة السقف الأحمر، وإضاءة الممشى الأخضر، وعتبة الكثافة الخضراء (GIT) لضمان اكتشاف طباعة الكف الأمثل.ملاحظة: لا تقم بتغيير الإعدادات المختارة بعد بدء عملية الحصول على البيانات لأن هذا سيعيق إمكانية المقارنة بين البيانات المكتسبة. كاستثناء، يمكن تغيير GIT أثناء تصنيف البيانات، ولكن يجب القيام بذلك لجميع التجارب بشكل موحد. تعريف ومعايرة الممشى باستخدام ورقة المعايرة المتوفرة. اختر كاميرا مسجلة مدرجة في علامة التبويب الإعداد. انقر على زر فتح الاستحواذ الذي يمكن العثور عليه في علامة التبويب الحصول على. أخذ لقطة من الممشى فارغة، تنظيفها، والتي سيتم استخدامها كمرجع في جميع أنحاء الإجراء التالي الحصول على البيانات. لاحظ الحالة المتغيرة من انتظار لقطة إلى جاهزة للاكتساب. انقر فوق الزر ابدأ اكتساب ولاحظ تغيير الحالة من جاهز للاكتساب إلى انتظار تشغيل إلى بدء التشغيل. ضع فأرًا على الممشى واتبع حركة الحيوان على شاشة الكمبيوتر. لاحظ تغيير الحالة من انتظار تشغيل إلى بدء تشغيل إلى تشغيل التسجيل.ملاحظة: سيقوم البرنامج تلقائيًا بتصنيف عمليات التشغيل التي يعتبرها متوافقة وفقًا لخصائص التشغيل المسبق مع رمز أخضر، بينما سيتم وضع علامة على عمليات التشغيل غير المتوافقة مع رمز أحمر. البرنامج تلقائيا توقف الحصول على البيانات عندما تم تسجيل ثلاثة أشواط متوافقة، ولكن يمكن الاستمرار في الحصول على البيانات عن طريق النقر على زر ابدأ الاستحواذ مرة أخرى. 8 – تصنيف البيانات ملاحظة: راجع الجدول 1 للحصول على قائمة معلمات نتائج AGA. وهناك حاجة إلى ما لا يقل عن ثلاثة أشواط متوافقة في الحيوان الذي يجب عبور الممشى باطراد دون تردد27. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن تطابق سرعات التشغيل داخل نفس الفئات كما هو محدد في الأدب30. انقر على زر التصنيف في علامة التبويب “مستكشف تجريبي” من التجارب المعنية التي سيتم تصنيفها. تشغيل المدى المكتسبة مع السرعة العادية للحصول على انطباع ما إذا كانت البيانات تتوافق مع المتطلبات المذكورة من قبل. في الزاوية العلوية اليسرى، انقر على زر التصنيف التلقائي للتصنيف التلقائي لبصمات الكفوف من قبل البرنامج.ملاحظة: على الرغم من أن البرنامج لديه معدل عال من تصنيف مخلب الصحيح، فإنه يفشل في بعض الأحيان لتعيين مخلب إلى مطبوعات أو يعين مخلب خاطئ. لذلك، دائماً تحقق مرتين من مطبوعات مخلب المصنفة تلقائياً بعد ذلك. لحساب الصحيح من أنماط تسلسل الخطوة العادية (NSSPs)، تأكد من أن خوارزمية تصنيف لا يتم الخلط بين مطبوعات مخلب غير مرئية، مما يؤدي إلى خلل NSSP (الشكل 1A). لذلك ، لا تشمل سوى مطبوعات مخلب التي يمكن الكشف عنها في حين أن مخلب contralateral هو أيضا مرئية لحسابات NSSP ، على سبيل المثال ، مخلب الجبهة اليسرى (LF) والحق مخلب هند (RH) (الشكل 1B). الشكل 1: بيانات آغا المثالية، مما يدل على الحاجة إلى الفحص المزدوج اليدوي لتصنيف البيانات الصحيح. في حالة اكتشاف موضع من مخلب الجبهة نجح من قبل وضع الكشف عن مخلب الجبهة آخر (A) قد تخلط بين برنامج AGA هذا مع نمط المشي غير منسقة منذ تم الكشف عن أي الكفوف الخلفية. لذلك، فمن المستحسن دائما الاختيار المزدوج وحدد طباعة مخلب الأولي، والتي تم الكشف عنها عندما مخلب contralateral هو أيضا مرئية (B). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 9. حساب الإحصاءات ملاحظة: لضبط بيانات التشغيل من أجل زيادة الوزن التغييرات ذات الصلة مع مرور الوقت، فمن المستحسن بشدة لحساب نسبة مخلب التجريبية مع مخلب غير تجريبي (مثل، التحكم). بالإضافة إلى ذلك، حساب نسبة إلى القيم قبل الجراحة من هذه المقارنة مخلب إلى مخلب للنظر في الاختلافات الفردية في استخدام مخلب. انقر على الزر عرض إحصائيات التشغيل للحصول على نظرة عامة شاملة حول إحصائيات التشغيل. حدد ملف وتصدير إلى تصدير إحصائيات التشغيل أو إحصائيات الإصدار التجريبي إلى برنامج جدول بيانات.

Representative Results

خضع 12 جرذًا لجراحة الأعصاب الطرفية التجريبية. تم إجراء استئصال العصب الوركي(الشكل 2A)في 7 فئران ، في حين أن تكوين العصب الفخذي(الشكل 2B)تم تحريضه في 5 فئران. في جميع الحيوانات، تم إعادة بناء الخلل العصبي عن طريق الكسب غير المشروع العصبي الذاتي. إصابة كدمة الحبل الشوكي(الشكل 2C)في مستوىTh 11 تم حدوثها في 6 فئران، مما أدى إلى ما مجموعه 18 الفئران. الشكل 2: مواقع العمليات بعد إعادة بناء الأعصاب. إعادة بناء العصب مع autografts في العصب الوركي (أ) والاعصاب الفخذية (B) وكذلك بعد إصابة كدمة الحبل الشوكي (C). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. وقد تعافت جميع الحيوانات بشكل جيد من الجراحة ولم تحدث أي حالات لتشويه الذات. طوّر واحد من مجموعة إصابات العصب الوركي انكماشات قوية للمخلف الخلفي الأيمن خلال فترة المراقبة بعد العملية الجراحية وكان لا بد من استبعاده من المزيد من تحليل البيانات. العصب العصبي الوركيمنذ أن يوفر العصب الوركي الداخلي العضلي والحسي لغالبية hindlimb ، فإن استئصاله يؤدي إلى ضعف شديد في وظيفة الحركي. بعد الإصابة، الفئران استخدام كعب مخلب لدعم الوزن فقط (الشكل 3B-E) ويتم نقل الطرف في حركة محيطة كاسحة. ولذلك، تصبح التغيرات الحركيّة التي تمّ تقييمها عبر AGA واضحة عن طريق منطقة طباعة مُخفّضَة بشكل ملحوظ (الشكل 4A) وزادت بشكل كبير من وقت الأرجوحة (الشكل 4B). وما زالت كلتا المعلمتين تُغيَّر كثيراً بالمقارنة مع قياسات ما قبل البروتوكول الاختياري في نهاية فترة المراقبة. جدير بالذكر، وضعت واحد انكماش قوية من مخلب هند الحق بدءا من الأسبوع بعد العملية الجراحية (WPO) 10. وأدى ذلك إلى زيادة مساحة الطباعة من مخلب هند الحق إلى أكثر من 150٪ بالمقارنة مع مخلب اليسار في WPO12 (الشكل 5). وبما أن هذا كان مُنْتَدِيًا بالمقارنة مع جميع الحيوانات الأخرى التي تم تقييمها في هذه الدراسة، فقد استبعدنا هذا الحيوان من تحليل البيانات فيما يتعلق بمنطقة الطباعة. الشكل 3: ممثل مخلب يطبع قبل وبعد التصاق حجم حرج من العصب الوركي الأيمن وإصلاح autograft. لاحظ الانخفاض القوي في منطقة الطباعة بعد إصابة العصب (B) مقارنة بـ (A) قبل الجراحة . على الرغم من زيادة طفيفة في منطقة الطباعة خلال فترة المراقبة (C-E)ظلت بصمات مخلب الطرف الخلفي الأيمن تتغير بشكل ملحوظ من التسجيلات الأساسية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: مسار الانتعاش الوظيفي بعد استئصال الحجم الحرج وإصلاح autograft من العصب الوركي. نسبة منطقة الطباعة (A) ونسبة وقت التأرجح (B) تغيرت إحصائيا بشكل كبير من قيم ما قبل OP مباشرة بعد استئصال العصب الوركي. بينما ظلت منطقة الطباعة انخفضت بشكل ملحوظ مقارنة مع خط الأساس حتى WPO10، تم زيادة وقت سوينغ بشكل كبير إلى قيم ما قبل البروتوكول الاختياري في WPO12. *: p < 0.05 مقارنة بـ Pre-OP، **: p < 0.01 مقارنة بـ Pre-OP. تشير أشرطة الخطأ إلى الخطأ ± الخطأ القياسي في الوسط (SEM). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 5: Boxplot من مسار منطقة الطباعة بعد إصابة العصب الوركي. لاحظ الطرف (القطع الناقص الأحمر) في WPO12، والذي يفسره حقيقة أن حيوانًا واحدًا طور انكماشات قوية للمخلف الخلفي الأيمن بدءًا من WPO10. ولذلك تم استبعاد الحيوان من التحليل الإحصائي المعروض في الشكل 4. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. تكوين العصب الفخذي العصبياستئصال العصب الفخذي النتائج في denervation من العضلات رباعية الفخذ33,34. ونتيجة لذلك، يتم اضعف تمديد الركبة، مما يؤدي إلى فرط المرونة من مفصل الكاحل مع رفع متتالية من كعب الكف. لذلك ، يتم تقليل منطقة طباعة مخلب المعنية (الشكل 6B) ، بقوة بعد الجراحة. يتم زيادة مساحة الطباعة من مخلب هند اليسار بسبب تحول تعويضي من الوزن إلى اليسار. وينبغي أن يوضع هذا في الاعتبار، لأن هذه الظاهرة تؤثر بشكل مباشر على النسبة المحسوبة بين مخلب “التجريبي” و “السيطرة”. بدءا من WPO4 reinnervation من رباعية من قبل العصب الفخذي تجديد يؤدي إلى عكس هذه التغيرات مما أدى إلى زيادة منطقة طباعة مخلب مخلب من مخلب الحق(الشكل 7A). كما أن العضلات رباعية الفخذ يلعب أيضا دورا في مرحلة التأرجح من مخلب المعنية، سوينغ تايم(الشكل 7B)هو لفترات طويلة إلى حد كبير في الفئران مع إصابة العصب الفخذي. يعكس عودة منطقة الطباعة، وينخفض وقت سوينغ مع وصول العصب الفخذي المتجدد إلى عضلة الفخذ الرباعية. في WPO10، عادت كل من معلمات مشية إلى خط الأساس، مما يشير إلى الانتعاش الوظيفي الكامل. الشكل 6: مطبوعات مخلب الممثل. ممثل مخلب يطبع قبل (A) وبعد (B –E) حق استئصال العصب الفخذي وإصلاح autograft. انخفضت مساحة الطباعة من RH بقوة في WPO2 (B)، في حين أصبحت الزيادة في مساحة الطباعة للمخلب الخلفي (LH) بسبب زيادة الحمل الوزن مرئية. بدأت منطقة الطباعة RH لزيادة بدءا من WPO6 (C) يرافقه انخفاض في منطقة الطباعة من LH. في WPO8 (D) وWPO10 (E) منطقة الطباعة من RH تعافى مرة أخرى قريبة من مستويات ما قبل الجراحة. (مقتبس بإذن من Heinzel et al.22، مرخص بموجب CC BY 4.0).) الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 7: مسار الانتعاش الوظيفي بعد استئصال 7 مم وإصلاح الأورغات الأوتوماتيكية للأعصاب الفخذية. مسار نسبة منطقة الطباعة (A) و نسبة وقت الأرجوحة (B) كشفت عن تغير قوي مباشرة بعد استئصال العصب الفخذي ، ولكن القيم التي تم استردادها مرة أخرى إلى قيم ما قبل الجراحة في WPO8. #: p < 0.05. تشير أشرطة الخطأ إلى متوسط ± SEM.(مقتبس بإذن من Heinzel etal. 22، مرخص تحت CC BY 4.0.) الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. كدمة الحبل الشوكيوكشف تحليل مشية بشكل ملحوظ مطبوعات مخلب تغيرت بعد إصابة كدمة الحبل الشوكي الصدري (الشكل 8)، والأهم من ذلك أن ينشط في منطقة الطباعة ودوران داخلي ملحوظ من الكفوف الخلفية في WPO2 (الشكل 8B). الجدير بالذكر، يتم تنفيذ تناوب مخلب أيضا كميزة قابلة للتقييم في BBB، مما يؤكد على قابلية تطبيق تحليل مشية المحوسبة لتقييم التغيرات في مشية التي تم تقييمها في الأصل مع اختبار حقل مفتوح. وفيما يتعلق بمسار معلمات المشي الفردية، فإن كدمة الحبل الشوكي عند مستوى11 th أدت إلى انخفاض نسبة مساحة الطباعة (الشكل 9A) وزيادة نسبة وقت التأرجح (الشكل 9B). وقد اتجهت كل من البارامترات نحو مستويات خط الأساس خلال دورة أخرى من فترة المراقبة، ولكن لم تحدث أي تغييرات ذات دلالة إحصائية يمكن ملاحظتها. كما انخفض مؤشر انتظام المعلمة المتعلقة بالتنسيق(الشكل 9C)في WPO2 ، ولكن درجة تباينت بشكل كبير بين الحيوانات. كما اتجهت نحو القيم قبل الجراحة حتى WPO16. قاعدة دعم الكفوف الخلفية(الشكل 9D)،معلمة عامة من مشية وفقا لDumens، وأظهرت زيادة ملحوظة، والتي كانت ذات دلالة إحصائية من WPO10 حتى WPO14. اتجهت نحو مستويات خط الأساس في WPO16 ولم تعد تتغير بشكل كبير من قيمة ما قبل البروتوكول الاختياري في هذه النقطة الزمنية. الشكل 8: ممثل مخلب يطبع من الكفوف الخلفية اثنين. مخلب يطبع قبل الجراحة (A) وبعد إصابة كدمة الحبل الشوكي الصدرية (B – F). لاحظ انخفاض في مجال الطباعة بدءا من WPO2 (B) يرافقه تناوب الداخلية ملحوظ من الكفوف. خلال فترة المراقبة (C -F) زيادة في منطقة الطباعة يمكن ملاحظتها وكذلك إزالة الدوران الداخلي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 9: كدمة الحبل الشوكي عند مستوى 11. كدمات الحبل الشوكي في th 11 أسفرت عن تغييرات ملحوظة من نسبة منطقة الطباعة (أ) ووقت سوينغ (ب) ومؤشر الانتظام (C) ، ولكن هذه التغييرات لم تكن ذات دلالة إحصائية. بعد الإصابة، أظهرت قاعدة دعم الكفوف الخلفية زيادة ملحوظة مقارنة مع خط الأساس، ما كان ذا أهمية إحصائية في WPO10 حتى WPO14. *: p < 0.05 بالمقارنة مع ما قبل البروتوكول الاختياري. تشير أشرطة الخطأ إلى ± SEM. الرجاء النقر هنا لعرض إصدار أكبر من هذا الرقم. الملف التكميلي 1: تفاصيل استكشاف الأخطاء وإصلاحها. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

ولا يزال تقييم الانتعاش الوظيفي في النماذج الحيوانية من PNI وSCI تحديا نظرا لتنوع كبير من أساليب التقييم، ولكل منها مزايا وعيوب فردية. ولم يتم اختبار سوى عدد قليل من الأساليب والتحقق من صحتها في نماذج متعددة من الإصابات العصبية الطرفية والمركزية، على الرغم من أن التقنيات الجديدة الواعدة التي تجمع بين تتبع الحركة والتعلم الآلي قد تدفع البحوث السلوكية العصبية إلى المستوى التالي من الاختبارات الوظيفية. ونحن مقتنعون بأن الأساليب المتطورة التي تنطبق على نطاق واسع على مجموعة واسعة من نماذج الحيوانات والإصابات ستظهر قريبا. في ضوء هذه الاعتبارات، واحدة من مزايا AGA هو إمكانية تقييم الانتعاش الوظيفي في نماذج متعددة من إصابات الأعصاب باستخدام جهاز واحد فقط. منذ أوائل 2000s وقد استخدم هذا النهج في النماذج التجريبية من PNI مثل^{الوركي 37}، peroneal³⁸، وإصابة العصب الفخذي نموذج²² وكذلك بعد avulsion الجذر من كل من^{39 و 39} زلقة العضدية^40. كما تمت دراسة مختلف الإصابات العصبية المركزية بما في ذلك إصابة كدمة الحبل الشوكي مع طريقة⁴¹^,⁴². مع هذه الورقة، عرضنا بروتوكولا مفصلا حول كيفية الحث على ثلاث إصابات الأعصاب درس عادة، فضلا عن كيفية تقييم الانتعاش الوظيفي بعد ذلك. في رأينا، من شأن التدريب العملي على المبادئ التوجيهية للباحثين المهتمين في مجال إصابة العصب التجريبية، وإصلاح، وتجديد حول كيفية الاستفادة المثلى من ميزات مفيدة الأسلوب يكون عونا كبيرا.

وقد تناول العديد من المؤلفين إمكانات AGA لتقييم الانتعاش الوظيفي في القوارض، وتسليط الضوء على ميزة الأسلوب لتقييم المعلمات مشية ذات الصلة في وقت واحد 27^،²⁸. بالإضافة إلى ذلك، فإن مقارنة البيانات من مخلب تجريبي، على سبيل المثال، إصابة الأعصاب المعاد بناؤها إلى مخلب غير مفتوح كما هو مبين في كل من النماذج المقدمة تسمح بإدراج عنصر تحكم إيجابي داخل الحيوان. عكسيا، مخلب تعمل دون إعادة بناء جراحية أو علاج إضافي يمكن أن تكون بمثابة السيطرة السلبية داخل الحيوان. كما تبين أنه من الممكن الجمع بين AGA مع أساليب التعلم الآلي⁴³. وعلى الرغم من مزايا الأسلوب، فإنه أيضا لديه عدة قيود وعيوب، مثل جهود التدريب التي تستغرق وقتا طويلا، والتي هي إلزامية لتعود على الحيوان إلى إجراءات الاستحواذ²⁸^،⁴⁴. وهناك قيد آخر من الـ AGA هو الحجم الأقصى للحيوانات المؤهلة للاختبار بسبب الأبعاد المحدودة للجهاز. ولذلك، فإن استخدام AGA يقتصر حاليا على الحيوانات حجم القوارض والنامس⁴⁵. بالإضافة إلى ذلك ، قد تتجاوز نُهج التقييم السلوك العصبي الناشئة مؤخرًا في مجال تتبع الحركة القادرة على التعلم الآلي AGA في كل من الشمولية وكذلك التطبيقات الممكنة¹⁸^،¹⁹^،⁴⁶. الأكثر الجديرة بالملاحظة، ولكن وفقا لأساليب التقييم الأخرى، يبدو أن الانتعاش الوظيفي كما تم تقييمه من قبل AGA محدودة بشدة – حتى إذا كان يحدث – في نماذج العصب الوركي⁴⁷^،⁴⁸. من ناحية أخرى، يسمح AGA بتقييم شامل لمسار الانتعاش الوظيفي بعد تكوين العصب الفخذي كما هو موضح في بياناتنا. مع هذا العمل، أثبتنا أن منطقة باف الطباعة هي معلمة مشية تمثيلية قابلة للتقييم عبر AGA، والتي تعتبر مثالية لمسار الانتعاش الوظيفي في نموذجين إصابات الأعصاب الطرفية المذكورة أعلاه التي تقدمها لنا. في حين أن الانتعاش الوظيفية ad integrum كان يمكن ملاحظته بعد إصلاح autograft من العصب الفخذي، وكانت لا تزال المعلمات AGA تغيرت بشكل كبير من خط الأساس في نهاية فترة المراقبة بعد إصلاح autograft من العصب الوركي. وتجدر الإشارة في هذا السياق إلى أن انكماش الأطراف ظاهرة شائعة لدى الفئران المصابة بإصابة العصب الوركي والحذر ضروري لعدم الخلط بين علامات الاختلال العضلي والشلل هذه مع التعافى الوظيفي المُستجد³². هذا من ناحية يؤكد عدم قدرة طريقة AGA على اكتشاف الانتعاش الوظيفية كبيرة بعد الإصابة العصبية في هذا النموذج. من ناحية أخرى، فإنه يثير السؤال عما إذا كان من الممكن تقييم نموذج إصابة العصب الوركي من الفئران، والتي لا تزال نموذج إصلاح الأعصاب التجريبية الأكثر استخداما، عن طريق تحليل المشية بشكل عام في حالة إصابة الأعصاب هو أكثر شدة من axonotmesis⁴⁸. يتم توفير تفاصيل استكشاف الأخطاء وإصلاحها في الملف التكميلي 1.

كما قدمنا بيانات مثالية عن استخدام طريقة تقييم وظيفة الحركي في الفئران المصابة بإصابة الحبل الشوكي، وهو أمر ممكن دون أي تغييرات مطلوبة في إعداد الأجهزة أو إجراء الاستحواذ. نفس المبدأ ينطبق على نماذج أخرى من القوارض من إصابة العصبي المركزي (CNI)²⁶^,⁴⁹^,⁵⁰ وإصابة قاروية الجذر. على النقيض من PNIs المعزولة ، إصابات الحبل الشوكي هي أكثر تعقيدًا في عواقبها الفيزيولوجية ، حيث تضررت العديد من الهياكل المهمة للغاية ، والتي تنطوي على مسارات افيرنت مثل المسالك القشرية و rubrospinal والمسارات الدوارة مثل الأعمدة الظهرية والمسالك spinothalamic³⁵. وينعكس التحدي في تقييم هذه التغيرات المرضية بشكل كاف في التسلح الشامل للاختبارات السلوكية، مثل باسو، بيتي، وبريسناهان (BBB) النتيجة³⁶. وقد تم الإبلاغ عن معلمة مشية قاعدة الدعم لزيادة بعد الإصابات العصبية المركزية، على الأرجح لحساب مشية غير قابلة للانتهاك الناتجة. تم تغيير قاعدة الدعم بشكل كبير من خط الأساس من WPO10 حتى WPO14 في نموذجنا ، مما يدعم افتراضنا بأن هذه المعلمة تسمح بتقييم مسار الانتعاش الوظيفي من قبل AGA بعد إصابة كدمة الحبل الشوكي الصدرية.

نحن مقتنعون بأن AGA هو أداة مجدية لتقييم الانتعاش الوظيفي في القوارض مع إصابات الجهاز العصبي. ومع ذلك، فإننا ننصح أن تعكس التغيرات الملحوظة من مشية بعناية ودقة في كل الإعداد التجريبية المعنية. التعديلات في معلمات المشية، على سبيل المثال، زيادة في منطقة الطباعة بعد تراجع فوري بعد العملية الجراحية أو انخفاض في وقت التأرجح رفع فوري لهذه المعلمة بعد العملية الجراحية، على مدار فترة المراقبة لا تتصل حتما الانتعاش الوظيفي. بدلا من ذلك يمكن أن تكون هذه التغييرات أيضا ذات صلة التكيف الوظيفية المحتملة للحفاظ على مشية غير واضحة، بالنظر إلى أن الفئران هي الأنواع فريسة ومحاولة تجنب إظهار الألم أو العجز إلى الحيوانات المفترسة المحتملة⁵¹. ولذلك، فمن المستحسن استخدام تحليل مشية الآلي كأداة تكميلية لربط التغييرات في مشية إلى غيرها من التدابير نتيجة إصابات الأعصاب الطرفية والتجدد²¹. كما ذكر سابقا، ونحن نعتقد أيضا أنه ينبغي أن تنعكس بعناية إذا القوارض مع العصب الوركي ينبغي التحقيق عن طريق AGA كما تشير النتيجة التي توصلنا إليها بقوة إلى أن الانتعاش الوظيفي محدود بشدة في هذه الحالة.

كما هو موضح في عملنا، الأصول الرئيسية لـ AGA هي إمكانية دراسة كل من إعادة تنشيط المحرك والحسية في العديد من نماذج PNI التجريبية وكذلك CNI مع اشتراط إعداد واحد فقط. ولذلك، فإن هذه الطريقة هي، في رأينا، أداة قيمة للغاية لاختبار السلوك العصبي الشامل. واحدة من الأصول AGA ، وهو إمكانية لدراسة المحرك والحسيس reinnervation في مختلف النماذج الحيوانية من PNI و CNI في حين تتطلب الإعداد واحد فقط ، في رأينا ميزة الطريقة الرئيسية بالمقارنة مع أساليب التقييم الأخرى لدراسة الانتعاش الوظيفية ، مثل المشي تحليل^{المسار 52}، فون فراي اختبار⁵³، أو مشية kinematics¹⁶. إن إمكانية تقييم تغيرات المشية في وقت واحد والتي ترتبط إما بنتائج التحقيقات الفيزيولوجية الكهربائية للعضلات²² أو طرق التقييم لوظيفة الحسية⁵⁴ واعدة فيما يتعلق بالتطبيقات المستقبلية للطريقة. ولذلك نوصي باستخدام AGA للتحقيق في الانتعاش الوظيفي في نماذج القوارض من PNI forelimb، مثل العصب الزندي، شعاعي، أو متوسط، أو نماذج نقل الأعصاب التجريبية⁵⁵، والتي لا تزال غير مدروسة مع هذه الطريقة حتى الآن.

نحن نقدم بموجب هذا بروتوكول مفصل حول كيفية استخدام تحليل المشي الآلي لدراسة الانتعاش الوظيفي في ثلاثة نماذج القوارض من إصابة الأعصاب. في حين أن هذه الطريقة تتطلب دراسة متأنية لمختلف الجوانب الرئيسية مثل التدريب الكافي ومعايرة الدقيق الثابت والبرمجيات، بل هو أداة تكميلية مجدية وقيمة لتقييم تجديد الأعصاب في نماذج القوارض من إصابات الأعصاب المركزية والمحيطية.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ويود المؤلفان أن يشكرا كارين برينر على رعايتها للحيوانات بحماس. كما يود المؤلفان أن يشكرا كلوديا كيبل وجيمس فيرغسون وغابرييل لينفلنر وسوزان دريشلر على مساعدتهم خلال العمليات الجراحية التجريبية.

Materials

0.9% Saline	B. Braun Austria	3570410	Vehicle for drug delivery
1 ml syringe	B. Braun Austria	9161708V	Injecting device
10 ml syringe	B. Braun Austria	4606728 V	Injecting device
1-Propanol, 2-Propanol, Hexetidin	Gebro Pharma	N/A	Alcoholic skin disinfection
23-gauge (G) canula	B. Braun Austria	4657667	Canula for s.c. injection
26-gauge (G) canula	B. Braun Austria	4657683	Canula for s.c. injection
5 ml syringe	B. Braun Austria	4606710 V	Injecting device
Buprenorphine hydrochloride	Sigma	B9275	Analgetic agent
Burrs for Micro Drill	F.S.T	19007-29	Drilling of a hole inside the lamina
Caprofen	Zoetis Austria	N/A	Analgetic agent
Catwalk Automated gait analysis system	Noldus	N/A	Automatic analysis software of animal gait
Cauterizer Kit	F.S.T	18010-00	Cauterization of vessels during surgery
Enrofloxacin	Bayer Austria	N/A	Antibiotic
Ethilon (10-0)	ETHICON	2810G	Suture material for neurrorhaphy
Ethilon (11-0)	ETHICON	EH7465G	Suture material for neurrorhaphy
Eye ointment	Fresenius Kabi Austria	4302436	Eye protection during anesthesia
Friedman-Pearson Rongeurs	F.S.T	16221-14	Surgical instrument
Gabapentin	Wedgewood Pharmacy	N/A	Analgetic agent
Goldstein retractor	F.S.T	17003-03	Retraction of tissues during surgery
Hair trimmer	Aescular	N/A	Hair trimmer for shaving of the operation site prior to surgery
Heating Pad for rodents	ALA Scientific Instruments	N/A	Regulation of body temperature
Impactor	Precision Systems and Instrumentation	N/A	Induction of spinal cord contusion
Lewis rat ()	Janvier	N/A	Experimental animal
Magnetic Fixator Retraction System	F.S.T	18200-50	Retraction of tissues during surgery
Metzenbaum Baby Scissors	F.S.T	14019-13	Surgical instrument
Micro Drill	Word Precision Instruments	503599	Instrument for bone drilling
Micro Needle holder	F.S.T	12076-12	Surgical instrument
Micro-scissors (curved)	F.S.T	15023-10	Surgical instrument
Micro-scissors (straight)	F.S.T	15007-08	Surgical instrument
Mirror Finish Forceps	F.S.T	11251-23	Surgical instrument
Needle holder	F.S.T	12002-12	Surgical instrument
Operating microscope	Leica	M651 MSD	Magnification of the operative site
Povidone Iod	B. Braun Melsungen	N/A	Non-alcoholic skin disinfectant
Pulse Oximeter	STARR Life Sciences	N/A	Surveillance of heart rate and oxygen saturation
Rodent thermometer	BIOSEB	BIO-TK8851	Surveillance of body temperature
Scalpel blade	F.S.T	10010-00 (#10)	Surgical instrument to make an incision
Scalpel handle	F.S.T	10003-12 (#3)	Surgical instrument to make an incision
Sevoflurane Inhalation Vapour, Liquid (100%)	Baxter	HDG9117A	Anesthetic
Spatula & Probe	F.S.T	10090-13	Surgical instrument
Sprague Dawley rat ()	Janvier	N/A	Experimental animal
Sterila gauze 5x5cm	EVAC MEDICAL	E010.03.00215	Sterile gauze compress
Tissue Forceps	F.S.T	11021-12	Surgical instrument
Vicryl (4-0)	ETHICON	V3040H	Suture material for subcutaneous sutures
Vicryl (5-0)	ETHICON	V303H	Suture material for subcutaneous sutures
Vicryl cutting needle (4-0)	ETHICON	V392ZH	Suture material for skin sutures
Vicryl cutting needle (5-0)	ETHICON	V391H	Suture material for skin sutures

Referencias

Mohanty, C. B., Bhat, D. I., Devi, B. I. Use of animal models in peripheral nerve surgery and research. Neurology India. 9, 100-105 (2019).
Vela, F. J., et al. Animal models used to study direct peripheral nerve repair: a systematic review. Neural Regeneration Research. 15 (3), 491-502 (2020).
Verma, R., Virdi, J. K., Singh, N., Jaggi, A. S. Animals models of spinal cord contusion injury. The Korean Journal of Pain. 32 (1), 12-21 (2019).
de Medinaceli, L., Freed, W. J., Wyatt, R. J. An index of the functional condition of rat sciatic nerve based on measurements made from walking tracks. Experimental Neurology. 77 (3), 634-643 (1982).
Navarro, X. Functional evaluation of peripheral nerve regeneration and target reinnervation in animal models: a critical overview. The European Journal of Neuroscience. 43 (3), 271-286 (2016).
Sperry, R. W. The functional results of muscle transposition in the hind limb of the rat. The Journal of Comparative Neurology. 73 (3), 379-404 (1940).
Sperry, R. W. The effect of crossing nerves to antagonistic muscles in the hind limb of the rat. The Journal of Comparative Neurology. 75 (1), 1-19 (1941).
Sperry, R. W. Transplantation of motor nerves and muscles in the forelimb of the rat. The Journal of Comparative Neurology. 76 (2), 283-321 (1942).
Zimmerman, E. A., Chambers, W. W., Liu, C. N. An experimental study of the anatomical organization of the Cortico-Bulbar System in the Albino Rat. The Journal of Comparative Neurology. 123, 301-323 (1964).
Cohen, A. H., Gans, C. Muscle activity in rat locomotion: movement analysis and electromyography of the flexors and extensors of the elbow. Journal of Morphology. 146 (2), 177-196 (1975).
Barnett, S. A. . The Rat: A Study in Behaviour. , (1963).
Hare, G. M., et al. Walking track analysis: utilization of individual footprint parameters. Annals of Plastic Surgery. 30 (2), 147-153 (1993).
Hare, G. M., et al. Walking track analysis: a long-term assessment of peripheral nerve recovery. Plastic and Reconstructive Surgery. 89 (2), 251-258 (1992).
Bertelli, J. A., Mira, J. C. Behavioral evaluating methods in the objective clinical assessment of motor function after experimental brachial plexus reconstruction in the rat. Journa of Neuroscience Methods. 46 (3), 203-208 (1993).
Varejao, A. S., Melo-Pinto, P., Meek, M. F., Filipe, V. M., Bulas-Cruz, J. Methods for the experimental functional assessment of rat sciatic nerve regeneration. Neurological Research. 26 (2), 186-194 (2004).
Varejao, A. S., et al. Functional assessment of peripheral nerve recovery in the rat: gait kinematics. Microsurgery. 21 (8), 383-388 (2001).
Varejao, A. S., et al. Ankle kinematics to evaluate functional recovery in crushed rat sciatic nerve. Muscle and Nerve. 27 (6), 706-714 (2003).
Nath, T., et al. Using DeepLabCut for 3D markerless pose estimation across species and behaviors. Nature Protocols. 14 (7), 2152-2176 (2019).
Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neuroscience. 21 (9), 1281-1289 (2018).
Deumens, R., Jaken, R. J., Marcus, M. A., Joosten, E. A. The CatWalk gait analysis in assessment of both dynamic and static gait changes after adult rat sciatic nerve resection. Journal of Neuroscience Methods. 164 (1), 120-130 (2007).
Heinzel, J., et al. Use of the CatWalk gait analysis system to assess functional recovery in rodent models of peripheral nerve injury – a systematic review. Journal of Neuroscience Methods. 345, 108889 (2020).
Heinzel, J. C., Hercher, D., Redl, H. The course of recovery of locomotor function over a 10-week observation period in a rat model of femoral nerve resection and autograft repair. Brain and Behavior. , 01580 (2020).
Chen, S. H., et al. Changes in GABA and GABA(B) receptor expressions are involved in neuropathy in the rat cuneate nucleus following median nerve transection. Synapse. 66 (6), 561-572 (2012).
Chen, S. H., et al. Decreases of glycine receptor expression induced by median nerve injury in the rat cuneate nucleus contribute to NPY release and c-Fos expression. Life Sciences. 90 (7-8), 278-288 (2012).
Hetze, S., Romer, C., Teufelhart, C., Meisel, A., Engel, O. Gait analysis as a method for assessing neurological outcome in a mouse model of stroke. Journal of Neuroscience Methods. 206 (1), 7-14 (2012).
Sandner, B., et al. Systemic epothilone D improves hindlimb function after spinal cord contusion injury in rats. Experimental Neurology. 306, 250-259 (2018).
Kappos, E. A., et al. Validity and reliability of the CatWalk system as a static and dynamic gait analysis tool for the assessment of functional nerve recovery in small animal models. Brain and Behavior. 7 (7), 00723 (2017).
Deumens, R., Marinangeli, C., Bozkurt, A., Brook, G. A. Assessing motor outcome and functional recovery following nerve injury. Methods in Molecular Biology. 1162, 179-188 (2014).
Webster, G. V. Halstedian principles in the practice of plastic and reconstructive surgery. Stanford Medical Bulletin. 13 (3), 315-316 (1955).
Bozkurt, A., et al. A flexible, sterile, and cost-effective retractor system for microsurgery. Microsurgery. 31 (8), 668-670 (2011).
Carr, M. M., Best, T. J., Mackinnon, S. E., Evans, P. J. Strain differences in autotomy in rats undergoing sciatic nerve transection or repair. Annals of Plastic Surgery. 28 (6), 538-544 (1992).
Dellon, A. L., Mackinnon, S. E. Sciatic nerve regeneration in the rat. Validity of walking track assessment in the presence of chronic contractures. Microsurgery. 10 (3), 220-225 (1989).
Jackson, C. M. Anatomy of the rat. Transactions of the American Philosophical Society, Philadelphia, New Series, Volume XXVII, 1935. The Anatomical Record. 65 (1), 127-129 (1936).
Pena, M. C., Baron, J. Femoral nerve and rectus femoris muscle of the rat: a study in anatomy, histology, and histoenzymes. Annals of Plastic Surgery. 20 (6), 527-532 (1988).
Kjell, J., Olson, L. Rat models of spinal cord injury: from pathology to potential therapies. Disease Models and Mechanisms. 9 (10), 1125-1137 (2016).
Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
Bozkurt, A., et al. CatWalk gait analysis in assessment of functional recovery after sciatic nerve injury. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 91-98 (2008).
Godinho, M. J., et al. Immunohistochemical, ultrastructural and functional analysis of axonal regeneration through peripheral nerve grafts containing Schwann cells expressing BDNF, CNTF or NT3. PLoS One. 8 (8), 69987 (2013).
Pajenda, G., et al. Spatiotemporally limited BDNF and GDNF overexpression rescues motoneurons destined to die and induces elongative axon growth. Experimental Neurology. 261, 367-376 (2014).
Matsuura, Y., et al. The effect of anti-NGF receptor (p75 Neurotrophin Receptor) antibodies on nociceptive behavior and activation of spinal microglia in the rat brachial plexus avulsion model. Spine (Phila Pa 1976). 38 (6), 332-338 (2013).
Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
Koopmans, G. C., et al. The assessment of locomotor function in spinal cord injured rats: the importance of objective analysis of coordination. Journal of Neurotrauma. 22 (2), 214-225 (2005).
Frohlich, H., Claes, K., De Wolf, C., Van Damme, X., Michel, A. A machine learning approach to automated gait analysis for the Noldus Catwalk system. IEEE Transaction on Bio-medical Engineering. 65 (5), 1133-1139 (2018).
Batka, R. J., et al. The need for speed in rodent locomotion analyses. Anatomical Record (Hoboken, N. J). 297 (10), 1839-1864 (2014).
Wood, T., et al. A ferret model of encephalopathy of prematurity. Developmental Neuroscience. 40 (5-6), 475-489 (2018).
Abbas, W., Masip Rodo, D. Computer methods for automatic locomotion and gesture tracking in mice and small animals for neuroscience applications: a survey. Sensors. 19 (15), (2019).
Irintchev, A. Potentials and limitations of peripheral nerve injury models in rodents with particular reference to the femoral nerve. Annals of Anatomy. 193 (4), 276-285 (2011).
Haastert-Talini, K., Haastert-Talini, K., Assmus, H., Antoniadis, G. . Modern Concepts of Peripheral Nerve Repair. , 127-138 (2017).
Lu, L., et al. Growth differentiation factor 11 promotes neurovascular recovery after stroke in mice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, (2018).
Caballero-Garrido, E., Pena-Philippides, J. C., Galochkina, Z., Erhardt, E., Roitbak, T. Characterization of long-term gait deficits in mouse dMCAO, using the CatWalk system. Behavioral Brain Research. 331, 282-296 (2017).
Graham, D. M., Hampshire, V. Methods for measuring pain in laboratory animals. Lab Animal. 45 (3), 99-101 (2016).
Monte-Raso, V. V., Barbieri, C. H., Mazzer, N., Yamasita, A. C., Barbieri, G. Is the sciatic functional index always reliable and reproducible. Journal of Neuroscience Methods. 170 (2), 255-261 (2008).
Stossel, M., et al. Comparative evaluation of chitosan nerve guides with regular or increased bendability for acute and delayed peripheral nerve repair: a comprehensive comparison with autologous nerve grafts and muscle-in-vein grafts. Anatomical Record (Hoboken). 301 (10), 1697-1713 (2018).
Vrinten, D. H., Hamers, F. F. CatWalk’ automated quantitative gait analysis as a novel method to assess mechanical allodynia in the rat; a comparison with von Frey testing. Pain. 102 (1-2), 203-209 (2003).
Aman, M., Sporer, M., Bergmeister, K., Aszmann, O. Animal models for selective nerve transfers of the upper extremity. Handchirurgie Mikrochirurgie Plastische Chirurgie. 51 (4), 319-326 (2019).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artículo

Heinzel, J., Swiadek, N., Ashmwe, M., Rührnößl, A., Oberhauser, V., Kolbenschlag, J., Hercher, D. Automated Gait Analysis to Assess Functional Recovery in Rodents with Peripheral Nerve or Spinal Cord Contusion Injury. J. Vis. Exp. (164), e61852, doi:10.3791/61852 (2020).