Automated Gait Analysis to Assess Functional Recovery in Rodents with Peripheral Nerve or Spinal Cord Contusion Injury

Johannes Heinzel; Nicole Swiadek; Mohamed Ashmwe; Alexander R&#252;hrn&#246;&#223;l; Viola Oberhauser; Jonas Kolbenschlag; David Hercher

doi:10.3791/61852

JoVE Journal > Neuroscience

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Neurociencias

Periferik Sinir veya Spinal Kord Kontüzyonu Yaralanması olan Kemirgenlerde Fonksiyonel İyileşmeyi Değerlendirmek için Otomatik Yürüyüş Analizi

Published: October 06, 2020

doi:

10.3791/61852

Johannes Heinzel^1,2,3, Nicole Swiadek^2,3, Mohamed Ashmwe^2,3, Alexander Rührnößl^2,3, Viola Oberhauser^2,3, Jonas Kolbenschlag¹, David Hercher^2,3

¹Department of Hand-, Plastic, Reconstructive and Burn Surgery, BG Trauma Center Tubingen,Eberhard Karls University, ²Ludwig Boltzmann Institute for Experimental and Clinical Traumatology, ³Austrian Cluster for Tissue Regeneration

Summary

Otomatik yürüyüş analizi periferik sinir yaralanması ve omurilik kontüzyonu yaralanması kemirgen modellerinde fonksiyonel iyileşme değerlendirmek için uygun bir araçtır. Çeşitli deneysel modellerde lokomotor fonksiyonu değerlendirmek için tek bir kurulum gerektirmesine gerek kalırken, hayvanların titiz sert ve yumuşak gereç lerin ayarlanmave eğitimi son derece önemlidir.

Abstract

Periferik ve santral sinir yaralanmaları çoğunlukla kemirgenlerde, özellikle sıçanlarda incelenmiştir, bu hayvan modellerinin hem uygun maliyetli olduğu ve literatürde karşılaştırmalı birçok veri yayınlandığı göz önüne alındığında. Bu sinir yaralanması ve onarım sonrasında fonksiyonel kurtarma çalışma değerlendirme yöntemleri çok sayıda içerir. Sinir rejenerasyonunun histoloji, elektrofizyoloji ve diğer in vivo ve in vitro değerlendirme teknikleri ile değerlendirilmesinin yanı sıra, fonksiyonel geri kazanım nöral rejenerasyon derecesini belirleyen en önemli kriterdir. Otomatik yürüyüş analizi, Paw Baskı Alanı ve Paw Salıncak Hızı gibi yürüyüşle ilgili parametrelerin büyük bir miktarının yanı sıra ekstremiteler arası koordinasyon önlemlerinin kaydedilmesine olanak tanır. Ayrıca, yöntem nöronal hasar sonrası ve sinir rejenerasyonu sırasında farelerin pençeleri dijital veri sağlar, nasıl periferik ve merkezi sinir yaralanmaları lokomotor davranışlarını etkileyen anlayışımızı ekleyerek. Ağırlıklı olarak kullanılan siyatik sinir yaralanması modelinin yanı sıra, femoral sinir gibi periferik sinir hasarının diğer modelleri de bu yöntem le incelenebilir. Periferik sinir sistemlerinin yaralanmalarına ek olarak, merkezi sinir sistemi lezyonları, örneğin, spinal kord kontüzyonu değerlendirilebilir. Geçerli ve tekrarlanabilir veri değerlendirmesi, veri toplama öncesinde ki sabit ve yazılım ayarlarının titiz bir şekilde ayarlanmasına bağlıdır. Ayrıca, deneysel hayvanların doğru eğitim çok önemlidir. Bu çalışma, periferik sinir hasarının farklı hayvan modellerinde fonksiyonel iyileşmenin yanı sıra omurilik kontüzyonu yaralanmasını değerlendirmek için bilgisayarlı otomatik yürüyüş analizinin kullanımını göstermeyi amaçlamaktadır. Ayrıca yöntemin sınırlamaları vurgulamaktadır, örneğin, siyatik sinir nörotmesi sınırlı fonksiyonel iyileşme nedeniyle sıçanlarda sinir rejenerasyondasyonu değerlendirilmesi. Bu nedenle, bu protokol kemirgen modellerinde fonksiyonel iyileşme değerlendirmek için periferik ve merkezi sinir yaralanmaları ilgilenen araştırmacılar yardımcı olduğu düşünülmektedir.

Introduction

Periferik ve merkezi sinir sistemi yaralanmaları genellikle kemirgenler üzerinde çalışılır, sinir yaralanması, onarım veya nörokoruma daha fazla ikincil yaralanmalar ve rejenerasyon^1,²^,³tabi olarak seyri ile ilgili karşılaştırmalı veri büyük miktarda sonuçlanan . Kemirgen modellerinde deneysel tedavi stratejilerinin sonucu histoloji, immünohistokimya, elektrofizyoloji ve X-ışını mikrotomografisi (μCT) taramaları gibi görüntüleme teknikleri gibi çeşitli tekniklerle değerlendirilebilir, ancak tedavinin başarısını belirlemek için en önemli kriter-insan hastalarda olduğu gibi-fonksiyonel iyileşme derecesi⁴^,⁵. Kemirgenlerde lokomotor performansı araştıran ilk çalışmalar 1940’lara kadar uzanır⁶^,⁷^,⁸. Sıçanlar ve fareler sonraki yıllarda lokomotor davranışlarını araştıran çalışmalar büyük miktarda tabi tutuldu⁹^,¹⁰^,¹¹. Günümüzde, periferik ve merkezi sinir yaralanmaları kemirgen modelleri için değerlendirme teknikleri geniş bir yelpazede var, mürekkep ve kağıt ile yürüyüş parça analizi arasında değişen¹²^,¹³^,¹⁴ ayak bileği ve yürüyüş kinematics üzerinde¹⁵^,¹⁶^,¹⁷ makine öğrenme gelişmiş yöntemler, hangi yürüyüş karmaşık tahmini için izin, ekstremite, ve eklem yörüngeleri¹⁸^,¹⁹.

Bilgisayarlı Otomatik Yürüyüş Analizi (AGA), periferik ve merkezi sinir yaralanmaları ve bu yaralanmaların potansiyel deneysel tedavisi sonrasında lokomotor fonksiyonu değerlendirmek için kullanılır. Cihaz esas olarak bir cam geçit ve onlar tarafından aşan basınç ile korelasyon kemirgen pençe baskılar aydınlatAn bir ışık kaynağı oluşur. Bu veriler daha sonra statik ve dinamik parametrelerin geniş bir dizi hesaplamak için bilgisayara. Deumens’e göre bu parametreler genel parametreler, ağrıyla ilgili parametreler ve yürüyüş^20’nin koordinasyonla ilgili parametreleri kategorilerine ayrılabilir (Tablo 1). AGA fizibilite yürüyüş davranışı değişiklikleri tespit etmek için periferik sinir hasarı (PNI)²¹çeşitli hayvan modellerinde kanıtlanmıştır , siyatik sinir gibi²⁰, femoral sinir²², ve medyan sinir²³^,²⁴. Ayrıca rutin merkezi sinir yaralanmaları olan sıçanlarda lokomotor fonksiyon değerlendirmek için kullanılır, örneğin, inme²⁵ veya omurilik kontüzyonu²⁶. Yöntemin ilerlemeleri karşılaştırılabilir veri büyük miktarda ve yürüyüş²⁷ile ilgili parametrelerin bir bolluk kaydetmek için olasılığı yalan. Bu makale, pni ve omurilik yaralanması (SCI) hayvan modelleri ile ilgilenen araştırmacılarbu tür modellerde lokomotor fonksiyon değerlendirmek için ayrıntılı ve uygulamalı bir kılavuz ile sunmayı amaçlamaktadır.

Kategori	Parametre	Açıklama
Yürüyüşün genel parametreleri	Baskı Alanı (mesafe birimi)	Pençe baskı alanı
	Baskı Uzunluğu (mesafe birimi)	Pençe izinin uzunluğu
	Destek Üssü (BoS) (mesafe birimi)	İki arka veya ön pati arasındaki mesafe
	Adım Uzunluğu (mesafe birimi)	Bir patinin art arda iki yerleşimi arasındaki mesafe
Yürüyüşün ağrıya bağlı parametreleri	Salıncak Süresi (ler)	Salıncak aşamasının süresi
	Stand Süresi (ler)	Duruş aşamasının süresi
	Ortalama Pençe Baskı Yoğunluğu (rasgele birim)	Duruş aşamasında pençe baskısının ortalama iYoğunluk
Yürüyüşün koordinasyonla ilgili parametreleri	Normal Adım Sırası Desenleri (NSSP)	Bir adım döngüsü sırasında pençe yerleşimlerinin belirli dizileri
	Faz Dağılımları (%)	İki özel patinin basamak döngüleri arasındaki zamansal farklar
	Düzenlilik Endeksi (RI) (%)	Kusursuz NSSP kez 4 miktarını bir adım döngüsü sırasında toplam pençe yerleştirme sayısına bölerek interlimb koordinasyonunun ölçülmesi

Tablo 1: Otomatik yürüyüş analizi ile değerlendirilebilir yürüyüş parametreleri. Parametrelerin sınıflandırıldığı kategoriler Deumens ve ark.^20’yegöre seçilir.

Protocol

Tüm deneyler için deneysel protokol Viyana Şehir Hükümeti Hayvan Protokolü İnceleme Kurulu tarafından önceden onaylanmıştır. Tüm prosedürler Helsinki Hayvan Hakları Bildirgesi ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu’na uygun olarak gerçekleştirilmiştir. 1. Hayvan muhafazası Ev erkek sıçanlar (Lewis veya Sprague Dawley) gıda ve suya reklam libitum erişimi ile 12 saat ışık / karanlık döngüsü altında 250-300 g ağırlığında. Hem oda sıcaklığını (20-22 °C’de tutulur) hem de nemi (-65) kontrol edin yeterli hayvan muhafazası için. Bu çalışmada erkek Lewis (PNIs) ve Sprague Dawley (SCI) sıçanları kullanıldı. Haftada iki kez yeni, temizlenmiş bir kafes sağlayın. İki ya da üç erli gruplar halinde ev fareleri ve yakından sosyal davranış ve etkileşim izler. Sıçanlar herhangi bir cerrahi işlem veya fonksiyonel test önce en az 1 hafta bir alışma süresi bekleyin.NOT: Sıçanlar ameliyat tan önce yürüyüş analiz cihazları üzerinde günlük eğitim en az 5 gün gerektirir, bu nedenle tesise farelerin gelişi ve deneysel cerrahi için planlanan verileri arasında en az 2 hafta hesaplamak28. 2. Sinir yaralanması indüksiyonu NOT: Cerrahi gece elbisesi, eldiven ve maske gibi kişisel koruyucu ekipmanlar giyin. Steril bir cerrahi gece elbisesi nin mevcut olmaması durumunda, temiz, aklanmış bir laboratuvar önlüğü de yeterlidir. Kontamine olmadıkça, elbise nin veya paltonun hayvanlar arasında değil, ameliyat seansları arasında değiştirilmesi gerekir. Steril cerrahi eldiven kullanılması tavsiye edilir. Bu tür eldivenlerin mevcut olmaması durumunda muayene eldivenleri de kullanılabilir ancak ameliyattan önce cerrahi dezenfektan kullanılarak yıkanmalıdır. Eldivenler hayvanlar arasında değiştirilmelidir. Ameliyat günü, bu anestezi ile müdahale edebilir gibi hayvanlariçin stres herhangi bir miktarda en aza indirmek için deneyin, örneğin, hayvanlar anestezi daha yüksek dozlarda gerektirecektir. Ameliyat günü, ameliyat öncesi ve interoperatif analjezi sağlamak için ameliyat tan önce 25 G kanula 1 saat deri altı kullanarak süspansiyona 0.05 mg Buprenorfin/kg vücut ağırlığı enjekte edin. Aksi belirtilmezse, sıçan kanadı enjeksiyon için tercih edilen yerdir. Bir sevofluran buharlaştırıcı ve co2absorbe etmek için aktif bir tebeşir konteyner bağlı bir anestezi indüksiyon odasına yerleştirerek sıçanlar anestezi . Anestezi kutusunu 1,5 L/dk (başlangıç evsinasyonu) oksijen akışı kullanarak yaklaşık 5 dakika boyunca %4-5 sevoflurane-oksijen karışımıile su layarak fareyi uyuşturun. Kemirgenin kan oksijen doygunluğu izlemek için pençeleri birine bir darbe oksimetri klipt bağlayın. %2.5-%4.5 sevofluran-oksijen karışımı ile genel anestezi durumunu koruyun.NOT: Deneysel cerrahi için genel anestezi zorunludur. Kuyruk veya pençeleri çimdik uyaran yanıt eksikliği kontrol ederek genel anestezi onaylayın. Sıçan genel anesteziye girdiğinde, ameliyat edilecek olan areal’i tıraş edin ve alkol ve deri dezenfektanı ile dönüşümlü olarak kaydırarak bölgeyi dezenfekte edin. Son kaydırma deri dezenfektanile yapılmalıdır. Gerekli pozisyonda ayarlanabilir bir ısıtma yastığı üzerine yerleştirin (femoral sinir modeli için supine, siyatik ve SCI modeli için eğilimli). Hastanın sıcaklığını izlemek ve ameliyat sırasında yaklaşık 37 °C’de tutmak için farenin rektumuna esnek bir termometre probu yerleştirin. Anestezi sırasında, göz merhemi kullanarak kurutma gelen farenin gözlerini korumak 3. Sinir hasarının cerrahi indüksiyonu Cerrahi işlemler yapılırken, Halsted29’un yedi prensibine aşağıdaki gibi bağlıdır: Onlarla çalışırken her zaman dokuları nazikçe ele alın. Dokuları yırtmaktan veya ezmekten kaçının.NOT: Kendi kendine üretilen30 veya ticari olarak kullanılabilen retraktör sistemleri kasları ve damarları çalışma alanından uzak tutmak için yararlıdır. Dikkatli hemostazsağlamak için damarları veya bağları eruterize etmek için elektrikli hemostaz kullanarak hemostazı dikkatlice koruyun. Her zaman dikkatle kesip ve incelikle işleyerek dokulara kan akımını koruyun. Maske, gece elbisesi ve steril eldiven giyerek sıkı sepsisi koruyun. Ne çok sıkı ne de çok gevşek dikişler uygulayarak dokularda gerginlik kaçının. Titizlikle herhangi bir örtüşme olmadan birlikte kendi kenarlarını getirerek dokuları appose.NOT: Bu özellikle epineüriyal veya perineurial nörorrhaphy durumunda önemlidir. Tüm mikrocerrahi işlemleri 6x-16x büyütme altında bir işletim mikroskobu kullanarak gerçekleştirin. İdeal olarak, mikroskop bir asistan tarafından operasyonun gözlem için izin vermek için oküler iki çift sağlar. Dikkatle farklı doku katmanları dikerek ölü alanlarda oluşturulmasıkaçının. Sağ arka ekstremitenin siyatik sinir nörotmesiinin indüksiyonu Arka ekstremitenin dorsal tarafında #3 neşter sapına bağlı #10 bir neşter bıçağı ile 5 cm uzunluğunda bir kesi yaparak ve üstteki kas ve yumuşak dokuyu keserek sağ siyatik siniri orta uyluk seviyesinde ortaya çıkarın. Parçalanmış kas ve deri situs dışında tutmak için yara içine bir retraktör yerleştirin. Kavisli mikrocerrahi makas kullanarak çevredeki dokuyu çıkararak siniri hafifçe ortaya çıkar. Siyatik sinirin 8 mm uzunluğundaki sinir segmentini düz mikrocerrahi makasla trifurkasyonuna 1-2 mm proksimal olarak çıkarın. Sinir segmentini 180°döndürün, transektif iskitik sinirin proksimal ve distal kütüğü arasına yerleştirin ve her bölgede iki adet 10-0 dikiş ve mikrocerrahi iğne tutucu ile epineüriyal nörorrhaphy yapın. Sağ arka ekstremitede femoral sinir nörotmesis indüksiyonu Sağ femoral nörovasküler demet ortaya çıkarmak için #3 neşter sapına bağlı bir #10 neşter bıçak ile uzunlamasına 3-4 cm kasık insizyonu gerçekleştirin. Femoral sinir bifurkasyon maruz kalana kadar künt diseksiyon için cerrahi makas kullanın. Parçalanmış kas ve deri situs dışında tutmak için yara içine bir retraktör yerleştirin. Maruz kalan motor ve duyusal dalları çatallanma distal transect ve her şubenin 6 mm uzunluğunda sinir segmenti çıkarmak, sırasıyla, düz mikrocerrahi makas kullanarak. Her iki sinir segmentini 180°döndürün, transektif femoral sinir dallarının proksimal ve distal kütüğü arasına yerleştirin ve her bölgede iki adet 11-0 dikiş ve mikrocerrahi iğne tutucu ile epineüriyal nörorrhaphy yapın.NOT: Motor grefti orijinal motor dalına, duyusal grefti de orijinal duyusal dala aşılayarak homotopik otolog sinir grefti yapın. Alternatif olarak, orijinal duyusal dalı ve tersi motor greft aşılayarak bir heterotopik otolog sinir grefti gerçekleştirin. Torasik spinal kord kontüzyonu yaralanmasıin indüksiyonu #3 neşter sapına bağlı #10 bir neşter bıçağı ve ardından kas geri çekilmesini kolaylaştırmak için spinous işlemlere paralel iki kas kesileri ile göğüs omuriliği boyunca bir deri kesisi yapın. Parçalanmış kas ve deri situs dışında tutmak için yara içine bir retraktör yerleştirin. 11. torasik vertebra (Th) tanımlayın ve bir rongeur kullanarak spinous süreci yanı sıra üstteki doku kaldırarak vertebra kemer lamina ortaya çıkarmak. Bir mikro matkap ve uygun bir çapak kullanarak bir laminektomi gerçekleştirin lamina içine küçük bir delik matkap, biraz darbeci ucu daha büyük. Omuriliğin zarar görmesini önlemek için, bir rongeur kullanarak deliği açıp genişletirken laminayı inceltin. Periost hala sağlamsa, dura mater’e zarar vermeden sivri uçlu bir sonda kullanarak dikkatlice çıkarın. Laminanın dengesini bozmadan yeterince büyük bir delik yapılmasını sağladıktan sonra, hayvanın omurgasını, darbecinin stabilizatörleri ile Th11’e kadar kenetleyerek yerinde tutun. Öndeki ve yan taraftaki el tekerlekleri kullanarak çelik çubuğu laminektomi deliğinin 3-5 mm yukarısına yerleştirin. Son olarak, omurilik kontüzyon yaralanması4hafif ve orta derecede indüklemek için 150 kilodyne tanımlanmış bir kuvvet ile bir etkiye tüm hayvanlar tabi . Poliglactin 4-0 veya 5-0 kesilen dikişler ve cerrahi iğne tutucu kullanarak anatomik tabakalarda yara kapatma gerçekleştirin. Yarayı steril %0,9 NaCl ile ıslatılmış bir gazlı bez pedi ile hafifçe silerek iyice temizleyin. Ameliyattan sonra, hayvanları ev kafeslerine geri döndürün ve ışık ve sese maruz kalmalarını karşılayın. Ameliyat sonrası güne (DPO) 7’ye kadar hayvanların davranışlarını yakından izleyin ve yeterli yiyecek ve su alımını temin edin. Gerekirse deri altı enjeksiyonlarla ek sıvı sağlayın (örn. 10 ml NaCl %0.9). Opioidler (0.05 mg/kg vücut ağırlığı Buprenorfin subkutan (s.c.)) ve/veya antipiretikler (4 mg/kg vücut ağırlığı Carprofen s.c. Gerekirse ve SCI modeli nde ameliyat sonrası antibiyotik tedavisi de mevcuttur (7.5 mg/kg vücut ağırlığı Enrofloksasin/os başına (p.o.)). Omurilik yaralanması durumunda, spontan idrara çıkma dönene kadar farenin mesanesini elle boşaltın. 4. Yürüyüş analizi öncesi cerrahi girişimlerden kurtarma NOT: Siyatik sinir yaralanması olan sıçanlar sinir yaralanması sonrasında ağrılı nöropati başlangıcı nedeniyle arka pençeleri kemirmek eğilimi göstermektedir. Otomutilation Bu formu ton veya ilgili arka pençe parçaları otoamputasyon neden olabilir. Bu sıçan zorlanma otomutilation için daha küçük bir eğilim gösterir gibi, siyatik sinir yaralanması modelikullanırken durumda diğer sıçan suşları üzerinde Lewis sıçantercih . Siyatik sinir yaralanması olan sıçanlar da işletilen ekstremite kontraktürgeliştirmek için eğilim göstermek, hangi veri toplama ile girişim nedeniyle çalışmadan dışlanmasına neden olabilir. Bu tür advers olaylar femoral yaralanması olan sıçanlarda çok daha az görülür. Ameliyat sonrası ameliyat edilen hayvanları sırasıyla uzuvlarının ve patilerinin durumuna özellikle dikkat ederek inceleyin.NOT: SCI olan sıçanlarda, Th11 yükseklikte, penis veya rektal prolapsus hayvanların doğal idrar ve dışkı için yeteneğinin bozulması nedeniyle oluşabilir. Bu olaylar genellikle çalışmanın insan uç noktaları olarak tanımlanır ve etkilenen hayvanın çalışmadan derhal dışlanmasını ima ediyor. Sıçanlar ağrıya bağlı semptomları göstermeyi bırakana kadar postoperatif analjeziye devam edin. Kalıcı ağrı durumunda, gabapentin (30-120 mg /kg vücut ağırlığı) p.o. nöropatik ağrı tedavisinde uygulayın. 5. Otomatik yürüyüş analizi nin yapılmAmasından çnce hazırlık NOT: Yürüyüş analiz sisteminin metodolojisi, yeşil LED ışıkla aydınlatılan cam bir plakayı geçerken hayvanların aşağıdan kaydedilmesine dayanır. Hayvanların pençeleri zemine temas ettiğinde, pençe baskı alanı aydınlatılır ve yüksek hızlı bir video kamera tarafından kaydedilir. Bu veriler daha sonra bir Ethernet kablosu aracılığıyla yürüyüş analizi yazılımını çalıştıran bir bilgisayara gönderilir. Tek tek ayak izleri deneyci tarafından el ile sınıflandırılabilirken, en son yazılım sürümü nde otomatik ayak izi sınıflandırması da bulunmaktadır. Karanlıkta ve rahatsız edici seslerin yokluğunda tüm test prosedürlerini gerçekleştirin. Sıçanlar süpersonik frekansları algılayabildiği için, bu tür sesler inanamayan hiçbir kaynağın olmadığını da doğrulayın.NOT: Haftalık ya da iki haftada bir yürüyüş analizi yapın, ancak özellikle Lewis sıçanları belirli bir egzersize çok sık maruz kaldıklarızaman prosedüre katılma ya da zaman içinde ilgikaybetme eğiliminde olduklarından fareleri çok sık test etmeyin. Ancak, test ortamı ve prosedürü onları alışmak için ameliyattan önce 5 gün boyunca günlük fareler eğitmek için gereklidir. Eğitim oturumları sırasında ve sınav gününde, tüm ışık kaynaklarını kapatarak davranışsal test odasını hazırlayın, bu da otomatik yürüyüş analiz cihazının kamerasına engel olabilir. Işığın kameraya müdahale etmesini önlemek için veri toplama için gerekli bilgisayar ekranını kameradan uzaklaştırın. Bu, veri toplama işlemini ciddi şekilde engelleyeceğinden, aygıtın kararlı bir konumda ve herhangi bir titreşim biçimini önleyecek şekilde yüklendiğinden emin olun. Fareleri davranış salanına getirin ve testten önce en az 30 dakika boyunca kendi kafeslerinde alıştırın.NOT: Hayvanları ne zaman kullanırsak, cerrahi önlük veya laboratuvar önlüğü, eldiven ve maske gibi kişisel koruyucu ekipmanlar giyin. 6. Otomatik yürüyüş analizi yapmak EğitimNOT: Eğitim sırasında, hayvanlar bir öğrenme eğrisi tabi olacak, bu nedenle yavaş yavaş eğitim programı ayarlamak için tavsiye edilir. Her eğitim seansını başarıyla tamamladıktan sonra hayvanları ödüllendirmek için gıda ödülleri (örn. 1-2 adet kahvaltılık gevrek) kullanın. Eğitimin ilk gününde, hayvanı gövdesinin altında tutarak hafifçe kaldırın ve yavaşça geçit girişine taşıyın. Hayvanı giriş alanına yerleştirin ve test işlemini gerçekleştiren kişinin müdahalesi olmadan koridorun açılmasını keşfetmesine izin verin.NOT: Yürüyerek geçmek için hayvanı motive etmek için bağırmayın, ıslık çalmayın, üflemayın veya dürtmeyin. Tüm bu davranışlar hayvanı ciddi şekilde strese serecek ve veri toplama prosedürünü daha da karmaşık hale getirecektir. Hayvan kendi isteğiyle kendi kafesulaşmak için geçit geçer kadar bekleyin. Bazen, özellikle eğitimsiz hayvanlarda, bu birkaç dakika kadar sürebilir. İlk eğitim gününde, hayvan ne beklenen ne de tek tip yürüme hızı ile kesintisiz çalışır yapmak için gerekli. Bunun yerine test aparatı ve prosedürü ile kendini alışmak gerekir. Eğitimin ikinci gününde, alışık olan hayvanlar hiç tereddüt etmeden kaldırıma girmek ve aynı zamanda hiç tereddüt etmeden evlerine dönmek için. Bazı hayvanlar muhtemelen zaten kesinti olmadan geçit geçmeyi öğrenmiş olacak, ama bu hala ikinci günün sonunda gerekli değildir. Eğitimin üçüncü gününde, hayvanların tereddüt etmeden, koklayarak veya başka bir şekilde keşif hareketleri yapmadan geçitten geçmeyi öğrenmelerini sağlayın. Tek tip hızda yürüdüklerine emin olun. Eğitimin dördüncü ve beşinci gününde, test prosedürünü pekiştirmek için önceki alıştırmayı tekrarlayın.NOT: Bir hayvanın 5 günlük eğitim süresinin sonuna kadar geçitten düzgün bir şekilde geçebilmek için gerekli beceriyi elde edememesi durumunda, 2 günlük ek eğitim (örn. hafta sonu) ekleyin. Ayrıca, günde en az 2 saat bireysel seans arasında istirahat ile ayrılmış, günde en fazla 3 eğitim oturumu gerçekleştirmeyi düşünün. Vakaların ‘inde hayvan, bu uzun eğitim döneminin sonunda gerekli eğitim deneyimini kazanmış olacaktır. Nadir durumlarda bir hayvan hala eğitim 7 gün sonra bu beceri elde değil, en az 1 hafta için planlanan deneysel cerrahi oturumu ertelemek ve yukarıda belirtilen eğitim rejimi tekrar tavsiye edilir. 7. Veri toplama NOT: Yürüyüş analiz sistemi, hayvan yürürken her bir pençe baskısını görselleştirir ve Pati Baskı Alanı, Pati Baskı Yoğunluğu, Pati Salıncak Zamanı ve Paw Salıncak Hızı(Tablo 1)gibi çeşitli yürüyüş parametrelerini otomatik olarak analiz eder. Yürüyüş analiz sistemi hayvanların pençe baskılarının oluşturduğu yoğunluğa göre tüm verileri kaydederken, kamera ayarlarının farelerin ağırlığına ve boyutuna göre ayarlandıklarından emin olun. Ayrıca, veri toplama üzerinde herhangi bir etkiyi önlemek için veri kaydı öncesinde geçit kuru ve temiz olduğundan emin olun. Herhangi bir veri elde etmeden önce, ticari cam temizleyici ve bir squeegee kullanarak geçit temizleyin. Sprey cam plaka birkaç kez ve daha sonra yüzeyinden herhangi bir parçacık kaldırmak için squeegee ile silin. Ayrıca, alt temiz. Hayvanlar aksi takdirde kaydedilen verileri etkileyecek adım olabilir, çünkü geçit ucundan herhangi bir sıvı kaldırmak için emin olun. Temizlik işlemini gerektiğinde, örneğin, geçitte kirlenme ve farklı bir kafesten bir farenin verisini kaydetmeden önce tekrarlayın. Bu, hayvanın konspesifik lerinin kokusuyla dikkatinin dağılmasını önlediği düşünülmektedir. İlk veri toplamadan önce, hayvanların ağırlığına uygun kamera ayarlarını ayarlayın. En hafif ve en ağır hayvanı kaldırıma koyarak bunu doğrulayın ve her iki durumda da iyi veri kalitesi sağlayan bir kamera ayarı seçin. En iyi pençe baskı algılamasını sağlamak için Kamera Kazancını, Kırmızı Tavan ışığını, Yeşil Geçit ışığını ve Yeşil Yoğunluk Eşiğini (GIT) ayarlayın.NOT: Veri toplama başladıktan sonra seçilen ayarları değiştirmeyin, çünkü bu, edinilen verilerin karşılaştırılabilirliğini engelleyecektir. Bir istisna olarak, GIT veri sınıflandırması sırasında değiştirilebilir, ancak bu tüm denemeler için düzgün yapılmalıdır. Sağlanan kalibrasyon sayfasını kullanarak geçiti tanımlayın ve kalibre edin. Kurulum sekmesinde listelenen kayıtlı bir kamera seçin. Edinme sekmesinde bulunan Kazan’ı Aç düğmesine tıklayın. Aşağıdaki veri toplama yordamı boyunca referans olarak kullanılacak olan boş, temizlenmiş geçitin anlık görüntüsünü alın. Anlık Görüntü Beklemeden Satın Alma için Hazır duruma değişen duruma dikkat edin. Satın Alma Başlat düğmesine tıklayın ve Satın Alma için Hazır’dan Başlat’ı Beklemeye kadar durum değişikliğini fark edin. Geçitte bir fare yerleştirin ve bilgisayarın ekranında hayvanın hareketini takip edin. Run’dan Başlat’a Kadar Bekleme den Durum Değişikliğine Dikkat Edin Çalıştır.NOT: Yazılım, uyumlu gördüğü çalıştırma özelliklerini yeşil bir sembolle otomatik olarak sınıflandırılırken, uyumlu olmayan çalıştırmalar kırmızı bir sembolle işaretlenir. Yazılım, üç uyumlu çalıştırma kaydedildiğinde veri toplamayı otomatik olarak durdurur, ancak yeniden Başlat Edinme düğmesine tıklayarak veri toplamaya devam edilebilir. 8. Veri sınıflandırması NOT: AGA sonuç parametreleri listesi için Tablo 1’e bakın. En az üç uyumlu çalışır hangi hayvan tereddüt etmeden sürekli geçit geçmek gerekir27gereklidir. Ayrıca, çalışma hızları literatürde tanımlanan aynı kategoriler içinde eşleşmelidir30. Sınıflandırılacak ilgili denemelerin Deneysel Explorer sekmesindeki Sınıflandırma düğmesini tıklatın. Verilerin daha önce listelenen gereksinimlere uygun olup olmadığı izlenimini elde etmek için edinilmiş çalıştırmayı normal hızda oynayın. Sol üst köşede, yazılım tarafından pençe baskılarının otomatik olarak sınıflandırılması için Otomatik Sınıflandırma düğmesine tıklayın.NOT: Yazılım doğru pençe sınıflandırmayüksek bir oranda olmasına rağmen, bazen baskılar bir pençe atamak için başarısız veya yanlış pençe atar. Bu nedenle, her zaman çift sonra otomatik sınıflandırılmış pençe baskılar kontrol edin. Normal Adım Sırası Desenlerinin (NSSP) doğru hesaplanması için, sınıflandırma algoritmasının görünmeyen pençe baskıları ile karıştırılmadığından emin olun ve bu da hatalı NSSP ‘ye(Şekil 1A)yol açmıştır. Bu nedenle, sadece kontralateral pençe de NSSP hesaplamaları için görünür iken tespit edilebilir pençe baskılar içerir, örneğin, sol ön pençe (LF) ve sağ arka pençe (RH) (Şekil 1B). Şekil 1: Doğru veri sınıflandırmasının manuel olarak çift eki olarak kontrol edilmesi gerektiğini gösteren örnek AGA verileri. Bir ön pati tespit yerleşimi başka bir ön pençe tespit yerleşimi başarılı olması durumunda(A) AGA yazılımı hiçbir arka pençeleri tespit edilmiştir beri koordinasyonsuz bir yürüyüş deseni ile bu karıştırabilir. Bu nedenle, her zaman iki kez kontrol etmek ve kontralateral pençe de görünür olduğunda tespit edilen bir başlangıç pençe baskı, seçmek için tavsiye edilir (B). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 9. İstatistikleri hesaplama NOT: Zaman içinde kilo alımıyla ilgili değişiklikler için çalışma verilerini ayarlamak için, deneysel olmayan (örn. kontrol) bir pençe ile deneysel pençenin oranını hesaplamak şiddetle tavsiye edilir. Ayrıca, pençe kullanımıbireysel farklılıkları dikkate almak için bu pençe-pati karşılaştırma preoperatif değerleri oranı hesaplamak. Çalışan istatistikleri hakkında kapsamlı bir genel bakış elde etmek için İstatistikleri Çalıştır düğmesini görüntüleyin düğmesini tıklatın. Çalışma istatistiklerini veya deneme istatistiklerini elektronik tablo yazılımına aktarmak için Dosya ve Dışa Aktarma’yı seçin.

Representative Results

12 sıçana deneysel periferik sinir cerrahisi uygulandı. 7 sıçanda siyatik sinir rezeksiyonu(Şekil 2A)yapılırken, 5 sıçanda femoral sinir nörotmesi(Şekil 2B)indüklendi. Tüm hayvanlarda, sinir defekti otolog sinir grefti ile yeniden inşa edilmiştir. Omurilik kontüzyonu(Şekil 2C)Th11 seviyesinde 6 sıçanda indüklendi ve toplam 18 sıçan sonuçlandı. Şekil 2: Sinir rekonstrüksiyonu sonrası operatif bölgeler. Siyatik sinir otogreftleri ile sinir rekonstrüksiyonu (A) ve femoral sinir (B) yanı sıra omurilik kontüzyon yaralanması sonra (C). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Tüm hayvanlar ameliyattan sonra iyi leşti ve kendi kendine sakatlanma vakası meydana gelmedi. Siyatik sinir yaralanması grubundan bir hayvan, postoperatif gözlem süresi boyunca sağ arka patide güçlü kontraktürler geliştirmiş ve daha fazla veri analizinden dışlanmalıdır. Siyatik sinir nörotmesisSiyatik sinir arka ekstremitenin çoğunluğuna kas ve duyusal innervasyon sağladığından, rezeksiyonu lokomotor fonksiyonun ciddi bir bozulmasına neden olur. Yaralanmadan sonra, sıçanlar sadece ağırlık desteği için pençe topuk kullanın(Şekil 3B-E) ve ekstremite süpürme bir circumductory hareket hareket ettirilir. Bu nedenle, AGA ile değerlendirilen lokomotor değişiklikler önemli ölçüde azaltılmış Baskı Alanı(Şekil 4A)ve önemli ölçüde artmış Salınım Süresi(Şekil 4B)ile belirgin hale gelir. Her iki parametre de gözlem döneminin sonunda olduğu gibi Pre-OP ölçümlerine göre hala önemli ölçüde değişmiştir. Kayda değer, bir hayvan postoperatif hafta (WPO) 10 başlayan sağ arka pençe güçlü kontraktürler geliştirdi. Bu durum, sağ arka patinin Baskı Alanı’nın WPO12’deki sol patiye kıyasla 0’den fazla artmasına neden oldu(Şekil 5). Bu çalışmada değerlendirilen diğer tüm hayvanlara göre bir ekstremum olduğu için, bu hayvanı Baskı Alanı açısından veri analizinden dışladık. Şekil 3: Sağ siyatik sinir ve otogreft onarımının kritik boyutta rezeksiyonundan önce ve sonra gelen temsili pençe izleri. Preoperatif(A)ile karşılaştırıldığında sinir yaralanması(B)sonrası Baskı Alanında güçlü bir düşüş e-not. Gözlem dönemi boyunca(C-E)Baskı Alanında hafif bir artışa rağmen sağ arka ekstremitenin pençe izleri temel kayıtlardan önemli ölçüde değişmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Kritik boyut rezeksiyonu ve siyatik sinirin otogreft onarımı sonrası fonksiyonel iyileşme süreci. Baskı Alanı Oranı (A) ve Salıncak Zaman Oranı(B)siyatik sinir rezeksiyonundan hemen sonra pre-OP değerlerinden istatistiksel olarak anlamlı olarak değiştirildi. Baskı Alanı WPO10’a kadar taban çizgisine göre önemli ölçüde azalırken, Swing Time yine de WPO12’de Pre-OP değerlerine önemli ölçüde yükseltildi. *: p < 0.05 Pre-OP ile karşılaştırıldığında, **: p < 0.01 Pre-OP ile karşılaştırıldığında. Hata çubukları ortalama (SEM) standart ± hata anlamına gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: Siyatik sinir yaralanmasını takiben Baskı Alanı’nın seyrinin boxplot’ı. WPO12’deki ekstremuma (kırmızı elips) dikkat edin, bu da bir hayvanın WPO10’dan başlayarak sağ arka patide güçlü kontraktürler geliştirmesi ile açıklanabilir. Bu nedenle hayvan Şekil 4’tegösterilen istatistiksel analizden dışlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Femoral sinir nörotmesisFemoral sinir rezeksiyonu uyluk quadriceps kas denervasyon sonuçları33,34. Sonuç olarak, diz uzatma bozulur, pençe topuk ardışık kaldırma ile ayak bileği ekleminin hiperfleksiyon ile sonuçlanan. Bu nedenle, ilgili pençe Baskı Alanı(Şekil 6B),kuvvetle ameliyattan sonra azalır. Sol arka patinin baskı alanı, ağırlığın sola doğru dengesel kayması nedeniyle artırılır. Bu fenomen doğrudan “deneysel” ve “kontrol” pençesi arasındaki hesaplanan oranı etkilediği için, bu akılda tutulmalıdır. Rejenerasyon femoral sinir tarafından kuadriseps WPO4 reinnervasyonu başlayarak sağ arka pençe artan Pençe Baskı Alanı ile sonuçlanan bu değişikliklerin ters yol açar (Şekil 7A). Uyluk quadriceps kas da ilgili pençe salıncak aşamasında bir rol oynar gibi, Swing Time(Şekil 7B) femoral sinir yaralanması olan sıçanlarda büyük ölçüde uzatır. Baskı Alanı dönüş aynalama, Swing Zaman rejenerasyon femoral sinir uyluk quadriceps kas ulaştıkça azalır. WPO10’da, yürüyüşün her iki parametresi de taban çizgisine geri dönerek tam işlevsel iyileşme sinyali verdi. Şekil 6: Temsili pençe izleri. Temsili pençe baskılar önce (A) ve aşağıdaki (B-E) sağ femoral sinir rezeksiyonu ve otogreft onarımı. Rh Baskı Alanı WPO2 güçlü azaldı (B), sol arka pençe Baskı Alanı bir artış (LH) artan ağırlık yükü nedeniyle görünür hale geldi. RH Baskı Alanı WPO6(C)itibaren LH Baskı Alanında bir azalma ile birlikte artmaya başladı. WPO8 (D) ve WPO10(E) RH baskı alanı preoperatif düzeylere yakın geri kurtarıldı. (Heinzel ve ark.22izni ile uyarlanmıştır , CC by 4.0 lisanslı.) Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 7: Femoral sinirin 7-mm rezeksiyon uzerine fonksiyonel iyileşme ve otogreft onarımı. Baskı Alanı Oranı (A) ve Salıncak Zaman Oranı(B)seyri femoral sinir rezeksiyonundan hemen sonra güçlü bir değişim ortaya koymuştur, ancak wpo8’de preoperatif değerlere geri dönen değerler. #: p < 0.05. Hata çubukları ortalama ± SEM gösterir (Heinzel ve ark.22izni ile uyarlanmıştır , CC by 4.0 lisanslı.) Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Omurilik kontüzyonuYürüyüş analizi, torasik omurilik kontüzyonu yaralanması(Şekil 8),Baskı Alanında en dikkat çekici bir dekremt ve WPO2’de arka pençelerin belirgin bir iç rotasyonu(Şekil 8B)sonrası belirgin şekilde değiştirilmiş pençe izleri saptandı. Dikkat çekici, pençe rotasyonu da BBB değerlendirilebilir bir özellik olarak uygulanmaktadır, başlangıçta Açık Alan testi ile değerlendirildi yürüyüş değişiklikleri değerlendirmek için bilgisayarlı yürüyüş analizi uygulanabilirliği altını çizerek. Bireysel yürüyüş parametrelerinin seyri ne olursa olsun, Th11 düzeyindeki omurilik kontüzyonu Baskı Alanı Oranının(Şekil 9A)azalmasına ve Salıncak Zaman Oranının(Şekil 9B)artmasına neden oldu. Her iki parametre de gözlem döneminin ileri ki bölümünde temel seviyelere doğru eğilim göstermiştir, ancak gözlemlenebilir istatistiksel olarak anlamlı bir değişiklik yoktu. Koordinasyonla ilgili parametre Düzenlilik İndeksi(Şekil 9C)de WPO2’de azalmıştır, ancak hayvanlar arasında derece büyük ölçüde farklılık göstermektedir. Ayrıca WPO16 kadar preoperatif değerlere doğru eğilimli. Deumens’e göre yürüyüşün genel bir parametresi olan arka patilerin destek tabanı(Şekil 9D),WPO10’dan WPO14’e kadar istatistiksel olarak anlamlı olan belirgin bir artış göstermiştir. WPO16’da temel seviyelere doğru eğilimlendi ve bu noktada pre-OP değerinden önemli ölçüde değiştirilmemişti. Şekil 8: İki arka patinin temsili pençe izleri. Pati preoperatif (A) ve torasik spinal kord kontüzyonu(B-F)aşağıdaki baskılar. WPO2(B)ile başlayan baskı alanında, pençelerin önemli bir iç rotasyonu eşliğinde küçülmeye dikkat edin. Gözlem dönemi boyunca(C-F)Baskı Alanı’nın bir artış yanı sıra iç rotasyon un temizlenmesi gözlemlenebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 9: Th 11 düzeyinde omurilik kontüzyonu. 11 Şubat’ta omurilik kontüzyonu, Baskı Alanı Oranı(A) ve Swing Time (B) ve Düzenlilik İndeksi(C)gözgöremez değişikliklere yol açtı, ancak bu değişiklikler istatistiksel olarak anlamlı değildi. Yaralanmanın ardından, arka patilerin Destek Üssü, WPO10’da WPO14’e kadar istatistiksel olarak anlamlı olan bazal çizgiye göre belirgin bir artış gösterdi. *: p < 0.05 Pre-OP ile karşılaştırıldığında. Hata çubukları sem ± anlamına geldiğini gösterir. Ek Dosya 1: Sorun giderme ayrıntıları. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

PNI ve SCI hayvan modellerinde fonksiyonel iyileşmenin değerlendirilmesi, her biri bireysel avantaj ve dezavantajları olan çok çeşitli değerlendirme yöntemleri nedeniyle zorlu olmaya devam etmektedir. Sadece birkaç yaklaşım test edilmiş ve periferik ve merkezi sinir yaralanmaları birden fazla model doğrulandı, hareket izleme ve makine öğrenme birleştiren umut verici yeni teknikler potansiyel fonksiyonel test sonraki seviyeye nörodavranışsal araştırma itmek olabilir rağmen. Çok çeşitli hayvan ve yaralanma modelleri için geniş çapta uygulanabilir olan en son yöntemlerin yakında ortaya çıkacağına eminiz. Bu hususlar ışığında, AGA avantajlarından biri sadece bir cihaz kullanarak sinir hasarı birden fazla modelfonksiyonel kurtarma değerlendirmek için olasılığıdır. 2000’li yılların başından bu yana bu yaklaşım siyatik³⁷gibi PNI deneysel modellerde kullanılmıştır , peroneal³⁸, ve femoral sinir yaralanması modeli²² yanı sıra hem lomber kök avulzyonu sonra³⁹ ve brakiyal pleksus⁴⁰. Omurilik kontüzyonu yaralanması da dahil olmak üzere çeşitli merkezi sinir yaralanmaları da yöntem⁴¹ile çalışılmıştır⁴²^. Bu yazı ile, üç yaygın olarak çalışılan sinir yaralanmaları neden yanı sıra nasıl daha sonra fonksiyonel iyileşme değerlendirmek için ayrıntılı bir protokol sundu. Bizim görüşümüze göre, deneysel sinir hasarı, onarım ve yöntemin avantajlı özellikleri optimum kullanımı nasıl rejenerasyon alanında ilgilenen araştırmacılar için bir hands-on-kılavuzu büyük yardımcı olacaktır.

Çeşitli yazarlar aynı anda motor ve duyusal reinnervasyon^27,²⁸ile ilgili yürüyüş parametrelerini değerlendirmek için yöntemin avantajı vurgulayarak, kemirgenlerde fonksiyonel kurtarma değerlendirmek için AGA potansiyeline yönelik var . Ayrıca, deneysel bir pençe den veri karşılaştırma, örneğin, bir çalışmamış pençe için yeniden sinir yaralanması sunulan modellerin her iki sinde gösterildiği gibi bir intra-hayvan pozitif kontrol dahil sağlar. Ters, cerrahi rekonstrüksiyon veya ek tedavi olmadan ameliyat pençe bir intra-hayvan negatif kontrol olarak hizmet verebilir. Ayrıca AGA’yı makine öğrenimi yaklaşımları⁴³ile birleştirmenin mümkün olduğu gösterilmiştir. Yöntemin avantajlarına rağmen, aynı zamanda satın alma prosedürü^28,⁴⁴hayvan alışmak için zorunlu olan zaman alıcı eğitim çabaları gibi çeşitli sınırlamalar ve dezavantajları vardır. AGA’nın bir diğer sınırlaması da cihazın sınırlı boyutları nedeniyle test edilmeye uygun hayvanların maksimum boyutudur. Bu nedenle, AGA kullanımı şu anda hayvanlar kemirgenler ve gelincik⁴⁵boyutu ile sınırlıdır. Ayrıca, hareket izleme alanında son zamanlarda ortaya çıkan nörodavranışsal değerlendirme yaklaşımları makine öğrenme yeteneğine sahip hem kapsamlılık hem de olası uygulamalar da AGA aşabilir¹⁸^,¹⁹^,⁴⁶. En kayda değer, ama diğer değerlendirme yöntemleri uyarınca, aga tarafından değerlendirilen fonksiyonel iyileşme güçlü sınırlı gibi görünüyor-hatta meydana geliyor-siyatik sinir nörotmesis modellerinde⁴⁷^,⁴⁸. Öte yandan, AGA bizim veri gösterildiği gibi femoral sinir nörotmesis aşağıdaki fonksiyonel iyileşme seyrinin kapsamlı bir değerlendirme sağlar. Bu çalışma ile, Paw Baskı Alanı’nın, bizim sunduğumuz iki adet çevresel sinir yaralanması modelinde fonksiyonel iyileşme nin seyri için örnek teşkil eden AGA üzerinden değerlendirilebilen temsili bir yürüyüş parametresi olduğunu gösterdik. Femoral sinirin otogreft onarımından sonra fonksiyonel kurtarma reklam integrum gözlemlenebilir iken, AGA parametreleri hala önemli ölçüde siyatik sinirin otogreft onarımı aşağıdaki gözlem döneminin sonunda bazal değiştirildi. Bu bağlamda ekstremite kontraktürlerinin siyatik sinir hasarı olan sıçanlarda sık rastlanan bir olgu olması dikkat çekicidir ve kas dengesizliği ve felç belirtilerini devam eden fonksiyonel iyileşme ile karıştırmamak gerekir³². Bu bir yandan AGA yönteminin bu modelde nörotmesis yaralanması sonrasında önemli fonksiyonel iyileşme tespit etmek için yetersizlik altını çizer. Öte yandan, bu sıçan siyatik sinir yaralanması modeli değerlendirmek mümkün olup olmadığı sorusunu gündeme getiriyor, hala en sık kullanılan deneysel sinir onarım modeli, sinir yaralanması axonotmesis daha şiddetli olması durumunda genel olarak yürüyüş analizi yoluyla⁴⁸. Sorun giderme ayrıntıları Ek Dosya 1’de verilmiştir.

Ayrıca Omurilik Yaralanması olan sıçanlarda lokomotor fonksiyonu değerlendirmek için yöntemin kullanımı hakkında örnek veriler sağladık, bu da donanım kurulumu veya satın alma prosedüründe gerekli herhangi bir değişiklik olmaksızın mümkündür. Aynı ilke merkezi sinir yaralanması diğer kemirgen modelleri için de geçerlidir (CNI)²⁶^,^49,⁵⁰ ve kök avulsiyon yaralanması. İzole PNI aksine, omurilik yaralanmaları patofizyolojik sonuçları çok daha karmaşıktır, son derece önemli yapıların çok sayıda hasar lı olarak, kortikospinal ve rubrospinal yolları ve dorsal sütunlar ve spinothalamic yolları gibi afferent yollar içeren³⁵. Bu patolojik değişiklikleri yeterince değerlendirmek için meydan basso, Beattie ve Bresnahan (BBB) puanı³⁶gibi davranışsal testler, kapsamlı armamentarium yansıtılır. Yürüyüş parametresi Destek Üssü merkezi sinir yaralanmaları sonrasında artış bildirilmiştir, büyük olasılıkla bir kararsız yürüyüş için hesap. Destek tabanı, modelimizde WPO10’dan WPO14’e kadar önemli ölçüde değiştirildi ve bu parametrenin torasik omurilik kontüzyonu yaralanması sonrasında AGA tarafından fonksiyonel iyileşme nin seyrinin değerlendirilmesine olanak sağladığı varsayımını destekledi.

Biz AGA sinir sistemi yaralanmaları ile kemirgenler fonksiyonel iyileşme değerlendirmek için uygun bir araç olduğuna eminiz. Bununla birlikte, her bir deneysel kurulumda yürüyüşte gözlenen değişiklikleri dikkatli ve ayrıntılı bir şekilde yansıtmanızı tavsiye ederiz. Yürüyüş parametrelerindeki değişiklikler, örneğin, ameliyat sonrası bir kararnamenin ardından Baskı Alanında bir artış veya bu parametrenin hemen postoperatif yükselmesini takiben Swing Time’da bir azalma, gözlem süresi boyunca kaçınılmaz olarak fonksiyonel iyileşme ile ilgili değildir. Bunun yerine bu değişiklikler de göze çarpmayan bir yürüyüş korumak için olası bir fonksiyonel adaptasyon ile ilgili olabilir, sıçanlar bir av türü ve potansiyel yırtıcılar için ağrı veya sakatlık gösteren önlemek için deneyin göz önüne alındığında⁵¹. Bu nedenle, periferik sinir yaralanması ve rejenerasyon diğer sonuç önlemleri için yürüyüş değişiklikleri ilişkilendirmek için tamamlayıcı bir araç olarak otomatik yürüyüş analizi kullanılması tavsiye edilir²¹. Daha önce de belirtildiği gibi, biz de dikkatli siyatik sinir nörotmesi ile kemirgenler AGA yoluyla araştırılması gerektiğini inanıyoruz bizim bulgu kuvvetle fonksiyonel iyileşme ciddi bu durumda sınırlı olduğunu gösterir gibi.

Çalışmamızda gösterildiği gibi, AGA’nın ana varlığı, sadece bir kurulum gerektiren çok sayıda deneysel PNI modelinin yanı sıra CNI modellerinde hem motor hem de duyusal reinnervasyon eğitimi alma imkanıdır. Bu nedenle, yöntem, bizim görüşümüze göre, kapsamlı nörodavranışsal test için son derece değerli bir araçtır. Aga varlıklarından biri, hangi sadece bir kurulum gerektiren PNI ve CNI çeşitli hayvan modellerinde motor ve duyusal reinnervasyon çalışma imkanı, bizim görüşümüze göre diğer değerlendirme yöntemleri ile karşılaştırıldığında fonksiyonel kurtarma çalışma yönteminin ana avantajı, bu tür yürüyüş parça analizi⁵², Von Frey test⁵³, veya yürüyüş kinematics¹⁶. Reinnerevveed kas^22’nin elektrofizyolojik incelemeleri veya duyusal fonksiyon⁵⁴ için değerlendirme yöntemleri nin sonuçlarıyla ilişkili olan yürüyüş değişikliklerini aynı anda değerlendirme potansiyeli, yöntemin gelecekteki uygulamaları açısından umut vericidir. Bu nedenle, ulnar, radyal veya median sinir veya deneysel sinir transferi modelleri⁵⁵gibi forelimb PNI kemirgen modellerinde fonksiyonel iyileşmearaştırmak için AGA kullanmanızı öneririz, henüz bu yöntem ile çalışılmamış kalır.

Bu vesileyle sinir yaralanması üç kemirgen modellerinde fonksiyonel kurtarma çalışma için otomatik yürüyüş analizi nasıl kullanılacağı hakkında ayrıntılı bir protokol sağlar. Yöntem yeterli eğitim ve titiz sert ve yazılım kalibrasyonu gibi çeşitli temel yönleri dikkatli dikkate gerektirir iken, merkezi ve periferik sinir hasarı kemirgen modellerinde sinir rejenerasyon değerlendirmek için uygun ve değerli bir tamamlayıcı araçtır.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar karin Brenner’a hayvanlara karşı tutkulu ilgisi için teşekkür etmek isterler. Yazarlar ayrıca Claudia Keibl, James Ferguson, Gabriele Leinfellner ve Susanne Drechsler’e deneysel ameliyatlar sırasında ki yardımları için teşekkür etmek istiyor.

Materials

0.9% Saline	B. Braun Austria	3570410	Vehicle for drug delivery
1 ml syringe	B. Braun Austria	9161708V	Injecting device
10 ml syringe	B. Braun Austria	4606728 V	Injecting device
1-Propanol, 2-Propanol, Hexetidin	Gebro Pharma	N/A	Alcoholic skin disinfection
23-gauge (G) canula	B. Braun Austria	4657667	Canula for s.c. injection
26-gauge (G) canula	B. Braun Austria	4657683	Canula for s.c. injection
5 ml syringe	B. Braun Austria	4606710 V	Injecting device
Buprenorphine hydrochloride	Sigma	B9275	Analgetic agent
Burrs for Micro Drill	F.S.T	19007-29	Drilling of a hole inside the lamina
Caprofen	Zoetis Austria	N/A	Analgetic agent
Catwalk Automated gait analysis system	Noldus	N/A	Automatic analysis software of animal gait
Cauterizer Kit	F.S.T	18010-00	Cauterization of vessels during surgery
Enrofloxacin	Bayer Austria	N/A	Antibiotic
Ethilon (10-0)	ETHICON	2810G	Suture material for neurrorhaphy
Ethilon (11-0)	ETHICON	EH7465G	Suture material for neurrorhaphy
Eye ointment	Fresenius Kabi Austria	4302436	Eye protection during anesthesia
Friedman-Pearson Rongeurs	F.S.T	16221-14	Surgical instrument
Gabapentin	Wedgewood Pharmacy	N/A	Analgetic agent
Goldstein retractor	F.S.T	17003-03	Retraction of tissues during surgery
Hair trimmer	Aescular	N/A	Hair trimmer for shaving of the operation site prior to surgery
Heating Pad for rodents	ALA Scientific Instruments	N/A	Regulation of body temperature
Impactor	Precision Systems and Instrumentation	N/A	Induction of spinal cord contusion
Lewis rat ()	Janvier	N/A	Experimental animal
Magnetic Fixator Retraction System	F.S.T	18200-50	Retraction of tissues during surgery
Metzenbaum Baby Scissors	F.S.T	14019-13	Surgical instrument
Micro Drill	Word Precision Instruments	503599	Instrument for bone drilling
Micro Needle holder	F.S.T	12076-12	Surgical instrument
Micro-scissors (curved)	F.S.T	15023-10	Surgical instrument
Micro-scissors (straight)	F.S.T	15007-08	Surgical instrument
Mirror Finish Forceps	F.S.T	11251-23	Surgical instrument
Needle holder	F.S.T	12002-12	Surgical instrument
Operating microscope	Leica	M651 MSD	Magnification of the operative site
Povidone Iod	B. Braun Melsungen	N/A	Non-alcoholic skin disinfectant
Pulse Oximeter	STARR Life Sciences	N/A	Surveillance of heart rate and oxygen saturation
Rodent thermometer	BIOSEB	BIO-TK8851	Surveillance of body temperature
Scalpel blade	F.S.T	10010-00 (#10)	Surgical instrument to make an incision
Scalpel handle	F.S.T	10003-12 (#3)	Surgical instrument to make an incision
Sevoflurane Inhalation Vapour, Liquid (100%)	Baxter	HDG9117A	Anesthetic
Spatula & Probe	F.S.T	10090-13	Surgical instrument
Sprague Dawley rat ()	Janvier	N/A	Experimental animal
Sterila gauze 5x5cm	EVAC MEDICAL	E010.03.00215	Sterile gauze compress
Tissue Forceps	F.S.T	11021-12	Surgical instrument
Vicryl (4-0)	ETHICON	V3040H	Suture material for subcutaneous sutures
Vicryl (5-0)	ETHICON	V303H	Suture material for subcutaneous sutures
Vicryl cutting needle (4-0)	ETHICON	V392ZH	Suture material for skin sutures
Vicryl cutting needle (5-0)	ETHICON	V391H	Suture material for skin sutures

Referencias

Mohanty, C. B., Bhat, D. I., Devi, B. I. Use of animal models in peripheral nerve surgery and research. Neurology India. 9, 100-105 (2019).
Vela, F. J., et al. Animal models used to study direct peripheral nerve repair: a systematic review. Neural Regeneration Research. 15 (3), 491-502 (2020).
Verma, R., Virdi, J. K., Singh, N., Jaggi, A. S. Animals models of spinal cord contusion injury. The Korean Journal of Pain. 32 (1), 12-21 (2019).
de Medinaceli, L., Freed, W. J., Wyatt, R. J. An index of the functional condition of rat sciatic nerve based on measurements made from walking tracks. Experimental Neurology. 77 (3), 634-643 (1982).
Navarro, X. Functional evaluation of peripheral nerve regeneration and target reinnervation in animal models: a critical overview. The European Journal of Neuroscience. 43 (3), 271-286 (2016).
Sperry, R. W. The functional results of muscle transposition in the hind limb of the rat. The Journal of Comparative Neurology. 73 (3), 379-404 (1940).
Sperry, R. W. The effect of crossing nerves to antagonistic muscles in the hind limb of the rat. The Journal of Comparative Neurology. 75 (1), 1-19 (1941).
Sperry, R. W. Transplantation of motor nerves and muscles in the forelimb of the rat. The Journal of Comparative Neurology. 76 (2), 283-321 (1942).
Zimmerman, E. A., Chambers, W. W., Liu, C. N. An experimental study of the anatomical organization of the Cortico-Bulbar System in the Albino Rat. The Journal of Comparative Neurology. 123, 301-323 (1964).
Cohen, A. H., Gans, C. Muscle activity in rat locomotion: movement analysis and electromyography of the flexors and extensors of the elbow. Journal of Morphology. 146 (2), 177-196 (1975).
Barnett, S. A. . The Rat: A Study in Behaviour. , (1963).
Hare, G. M., et al. Walking track analysis: utilization of individual footprint parameters. Annals of Plastic Surgery. 30 (2), 147-153 (1993).
Hare, G. M., et al. Walking track analysis: a long-term assessment of peripheral nerve recovery. Plastic and Reconstructive Surgery. 89 (2), 251-258 (1992).
Bertelli, J. A., Mira, J. C. Behavioral evaluating methods in the objective clinical assessment of motor function after experimental brachial plexus reconstruction in the rat. Journa of Neuroscience Methods. 46 (3), 203-208 (1993).
Varejao, A. S., Melo-Pinto, P., Meek, M. F., Filipe, V. M., Bulas-Cruz, J. Methods for the experimental functional assessment of rat sciatic nerve regeneration. Neurological Research. 26 (2), 186-194 (2004).
Varejao, A. S., et al. Functional assessment of peripheral nerve recovery in the rat: gait kinematics. Microsurgery. 21 (8), 383-388 (2001).
Varejao, A. S., et al. Ankle kinematics to evaluate functional recovery in crushed rat sciatic nerve. Muscle and Nerve. 27 (6), 706-714 (2003).
Nath, T., et al. Using DeepLabCut for 3D markerless pose estimation across species and behaviors. Nature Protocols. 14 (7), 2152-2176 (2019).
Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neuroscience. 21 (9), 1281-1289 (2018).
Deumens, R., Jaken, R. J., Marcus, M. A., Joosten, E. A. The CatWalk gait analysis in assessment of both dynamic and static gait changes after adult rat sciatic nerve resection. Journal of Neuroscience Methods. 164 (1), 120-130 (2007).
Heinzel, J., et al. Use of the CatWalk gait analysis system to assess functional recovery in rodent models of peripheral nerve injury – a systematic review. Journal of Neuroscience Methods. 345, 108889 (2020).
Heinzel, J. C., Hercher, D., Redl, H. The course of recovery of locomotor function over a 10-week observation period in a rat model of femoral nerve resection and autograft repair. Brain and Behavior. , 01580 (2020).
Chen, S. H., et al. Changes in GABA and GABA(B) receptor expressions are involved in neuropathy in the rat cuneate nucleus following median nerve transection. Synapse. 66 (6), 561-572 (2012).
Chen, S. H., et al. Decreases of glycine receptor expression induced by median nerve injury in the rat cuneate nucleus contribute to NPY release and c-Fos expression. Life Sciences. 90 (7-8), 278-288 (2012).
Hetze, S., Romer, C., Teufelhart, C., Meisel, A., Engel, O. Gait analysis as a method for assessing neurological outcome in a mouse model of stroke. Journal of Neuroscience Methods. 206 (1), 7-14 (2012).
Sandner, B., et al. Systemic epothilone D improves hindlimb function after spinal cord contusion injury in rats. Experimental Neurology. 306, 250-259 (2018).
Kappos, E. A., et al. Validity and reliability of the CatWalk system as a static and dynamic gait analysis tool for the assessment of functional nerve recovery in small animal models. Brain and Behavior. 7 (7), 00723 (2017).
Deumens, R., Marinangeli, C., Bozkurt, A., Brook, G. A. Assessing motor outcome and functional recovery following nerve injury. Methods in Molecular Biology. 1162, 179-188 (2014).
Webster, G. V. Halstedian principles in the practice of plastic and reconstructive surgery. Stanford Medical Bulletin. 13 (3), 315-316 (1955).
Bozkurt, A., et al. A flexible, sterile, and cost-effective retractor system for microsurgery. Microsurgery. 31 (8), 668-670 (2011).
Carr, M. M., Best, T. J., Mackinnon, S. E., Evans, P. J. Strain differences in autotomy in rats undergoing sciatic nerve transection or repair. Annals of Plastic Surgery. 28 (6), 538-544 (1992).
Dellon, A. L., Mackinnon, S. E. Sciatic nerve regeneration in the rat. Validity of walking track assessment in the presence of chronic contractures. Microsurgery. 10 (3), 220-225 (1989).
Jackson, C. M. Anatomy of the rat. Transactions of the American Philosophical Society, Philadelphia, New Series, Volume XXVII, 1935. The Anatomical Record. 65 (1), 127-129 (1936).
Pena, M. C., Baron, J. Femoral nerve and rectus femoris muscle of the rat: a study in anatomy, histology, and histoenzymes. Annals of Plastic Surgery. 20 (6), 527-532 (1988).
Kjell, J., Olson, L. Rat models of spinal cord injury: from pathology to potential therapies. Disease Models and Mechanisms. 9 (10), 1125-1137 (2016).
Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
Bozkurt, A., et al. CatWalk gait analysis in assessment of functional recovery after sciatic nerve injury. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 91-98 (2008).
Godinho, M. J., et al. Immunohistochemical, ultrastructural and functional analysis of axonal regeneration through peripheral nerve grafts containing Schwann cells expressing BDNF, CNTF or NT3. PLoS One. 8 (8), 69987 (2013).
Pajenda, G., et al. Spatiotemporally limited BDNF and GDNF overexpression rescues motoneurons destined to die and induces elongative axon growth. Experimental Neurology. 261, 367-376 (2014).
Matsuura, Y., et al. The effect of anti-NGF receptor (p75 Neurotrophin Receptor) antibodies on nociceptive behavior and activation of spinal microglia in the rat brachial plexus avulsion model. Spine (Phila Pa 1976). 38 (6), 332-338 (2013).
Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
Koopmans, G. C., et al. The assessment of locomotor function in spinal cord injured rats: the importance of objective analysis of coordination. Journal of Neurotrauma. 22 (2), 214-225 (2005).
Frohlich, H., Claes, K., De Wolf, C., Van Damme, X., Michel, A. A machine learning approach to automated gait analysis for the Noldus Catwalk system. IEEE Transaction on Bio-medical Engineering. 65 (5), 1133-1139 (2018).
Batka, R. J., et al. The need for speed in rodent locomotion analyses. Anatomical Record (Hoboken, N. J). 297 (10), 1839-1864 (2014).
Wood, T., et al. A ferret model of encephalopathy of prematurity. Developmental Neuroscience. 40 (5-6), 475-489 (2018).
Abbas, W., Masip Rodo, D. Computer methods for automatic locomotion and gesture tracking in mice and small animals for neuroscience applications: a survey. Sensors. 19 (15), (2019).
Irintchev, A. Potentials and limitations of peripheral nerve injury models in rodents with particular reference to the femoral nerve. Annals of Anatomy. 193 (4), 276-285 (2011).
Haastert-Talini, K., Haastert-Talini, K., Assmus, H., Antoniadis, G. . Modern Concepts of Peripheral Nerve Repair. , 127-138 (2017).
Lu, L., et al. Growth differentiation factor 11 promotes neurovascular recovery after stroke in mice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, (2018).
Caballero-Garrido, E., Pena-Philippides, J. C., Galochkina, Z., Erhardt, E., Roitbak, T. Characterization of long-term gait deficits in mouse dMCAO, using the CatWalk system. Behavioral Brain Research. 331, 282-296 (2017).
Graham, D. M., Hampshire, V. Methods for measuring pain in laboratory animals. Lab Animal. 45 (3), 99-101 (2016).
Monte-Raso, V. V., Barbieri, C. H., Mazzer, N., Yamasita, A. C., Barbieri, G. Is the sciatic functional index always reliable and reproducible. Journal of Neuroscience Methods. 170 (2), 255-261 (2008).
Stossel, M., et al. Comparative evaluation of chitosan nerve guides with regular or increased bendability for acute and delayed peripheral nerve repair: a comprehensive comparison with autologous nerve grafts and muscle-in-vein grafts. Anatomical Record (Hoboken). 301 (10), 1697-1713 (2018).
Vrinten, D. H., Hamers, F. F. CatWalk’ automated quantitative gait analysis as a novel method to assess mechanical allodynia in the rat; a comparison with von Frey testing. Pain. 102 (1-2), 203-209 (2003).
Aman, M., Sporer, M., Bergmeister, K., Aszmann, O. Animal models for selective nerve transfers of the upper extremity. Handchirurgie Mikrochirurgie Plastische Chirurgie. 51 (4), 319-326 (2019).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artículo

Heinzel, J., Swiadek, N., Ashmwe, M., Rührnößl, A., Oberhauser, V., Kolbenschlag, J., Hercher, D. Automated Gait Analysis to Assess Functional Recovery in Rodents with Peripheral Nerve or Spinal Cord Contusion Injury. J. Vis. Exp. (164), e61852, doi:10.3791/61852 (2020).