Automated Gait Analysis to Assess Functional Recovery in Rodents with Peripheral Nerve or Spinal Cord Contusion Injury

Johannes Heinzel; Nicole Swiadek; Mohamed Ashmwe; Alexander R&#252;hrn&#246;&#223;l; Viola Oberhauser; Jonas Kolbenschlag; David Hercher

doi:10.3791/61852

JoVE Journal > Neuroscience

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Neurociencias

ניתוח הליכה אוטומטי כדי להעריך התאוששות תפקודית מכרסמים עם פגיעה בעצב היקפי או חבלה בחוט השדרה

Published: October 06, 2020

doi:

10.3791/61852

Johannes Heinzel^1,2,3, Nicole Swiadek^2,3, Mohamed Ashmwe^2,3, Alexander Rührnößl^2,3, Viola Oberhauser^2,3, Jonas Kolbenschlag¹, David Hercher^2,3

¹Department of Hand-, Plastic, Reconstructive and Burn Surgery, BG Trauma Center Tubingen,Eberhard Karls University, ²Ludwig Boltzmann Institute for Experimental and Clinical Traumatology, ³Austrian Cluster for Tissue Regeneration

Summary

ניתוח הליכה אוטומטי הוא כלי אפשרי להערכת התאוששות תפקודית במודלים של מכרסמים של פגיעה בעצב היקפי ופגיעה בחוט השדרה. אמנם זה דורש רק התקנה אחת כדי להעריך את תפקוד הקטר במודלים ניסיוניים שונים, התאמה קפדנית קשה ורכה והכשרה של בעלי החיים הוא חשוב מאוד.

Abstract

פציעות עצביות היקפיות ומרכזיות נחקרות בעיקר מכרסמים, במיוחד חולדות, בהתחשב בעובדה כי מודלים אלה של בעלי חיים הם גם חסכוניים והרבה נתונים השוואתיים פורסמו בספרות. זה כולל מספר רב של שיטות הערכה ללמוד התאוששות תפקודית בעקבות פגיעה עצבית ותיקון. מלבד הערכה של התחדשות עצבית באמצעות היסטולוגיה, אלקטרופיזיולוגיה, וטכניקות אחרות vivo ובהערכת המבחנה, התאוששות תפקודית היא הקריטריון החשוב ביותר כדי לקבוע את מידת ההתחדשות העצבית. ניתוח הליכה אוטומטי מאפשר הקלטה של כמות עצומה של פרמטרים הקשורים הליכה כגון Paw Print Area ו- Paw Swing Speed, כמו גם אמצעים של תיאום בין גפיים. בנוסף, השיטה מספקת נתונים דיגיטליים של כפות החולדות לאחר נזק עצבי ובמהלך התחדשות עצבית, ומוסיפה להבנה שלנו כיצד פציעות עצבים היקפיות ומרכזיות משפיעות על התנהגות הקטר שלהם. מלבד מודל פגיעה בעיקר בעצב הירך, מודלים אחרים של פגיעה בעצב היקפי כגון עצב הירך ניתן ללמוד באמצעות שיטה זו. בנוסף לפציעות של מערכות העצבים ההיקפיות, נגעים של מערכת העצבים המרכזית, למשל, חבלה בחוט השדרה ניתן להעריך. הערכת נתונים תקפה ותוקף תלויה מאוד בהתאמה קפדנית של הגדרות הקשה והתוכנה לפני רכישת הנתונים. בנוסף, הכשרה נכונה של בעלי החיים הניסיוניים היא בעלת חשיבות מכרעת. עבודה זו נועדה להמחיש את השימוש בניתוח הליכה אוטומטי ממוחשב כדי להעריך התאוששות תפקודית במודלים שונים של בעלי חיים של פגיעה עצבית היקפית, כמו גם פגיעה בחוט השדרה. הוא גם מדגיש את המגבלות של השיטה, למשל, הערכה של התחדשות עצבית בחולדות עם neurotmesis עצב ירך בשל התאוששות תפקודית מוגבלת. לכן, פרוטוקול זה נחשב כדי לסייע לחוקרים המעוניינים בפציעות עצבים היקפיות ומרכזיות כדי להעריך התאוששות תפקודית במודלים מכרסמים.

Introduction

פציעות של מערכת העצבים ההיקפית והמרכזית נחקרים לעתים קרובות מכרסמים, וכתוצאה מכך כמות גדולה של נתונים השוואתיים לגבי מהלך של פגיעה עצבית, תיקון, או neuroprotection כדי לנטרל פציעות משניות נוספות^{והתחדשות 1,}^2,³. את התוצאה של אסטרטגיות טיפול ניסיוניות במודלים מכרסמים ניתן להעריך על ידי מגוון רחב של טכניקות כגון היסטולוגיה, אימונוהיסטוכימיה, אלקטרופיזיולוגיה, וטכניקות הדמיה כגון מיקרוטומוגרפיה רנטגן (μCT) סריקות, אבל הקריטריון החשוב ביותר כדי לקבוע את ההצלחה של טיפול הוא – כמו בחולים אנושיים – מידת^{ההתאוששות תפקודית 4}^,⁵. המחקרים הראשונים החוקרים את ביצועי הקטרים מכרסמים מתוארכות^ל-6,^{7, 8}. חולדות ועכברים היו נתונים לכמות גדולה של מחקרים שחקרו את התנהגות הקטר שלהם בעשורים^{הבאים 9}^,¹⁰^,¹¹. כיום קיימות מגוון רחב של טכניקות הערכה למודלים של מכרסמים של פציעות עצביות היקפיות ומרכזיות, החל מניתוח מסלול הליכה עם דיו^{ונייר 12,}^13,^{14 מעל} הקרסול והליכה קינמטיקה¹⁵,¹⁶^,^{17 ועד שיטות} משופרות למידת מכונה, המאפשרות הערכת עור של הליכה, גפיים ומסלולים^{משותפים 18}^,¹⁹.

ניתוח הליכה אוטומטי ממוחשב (AGA) משמש להערכת תפקוד הקטר בעקבות פציעות עצבים היקפיות ומרכזיות וטיפול ניסיוני פוטנציאלי של פציעות כאלה. המכשיר מורכב בעיקר מפסל זכוכית ומקור אור המאיר את טביעות כף הרגל של המכרסם בקורלציה עם הלחץ העולה עליהם. לאחר מכן, נתונים אלה ממוחשבים כדי לחשב מערך רחב של פרמטרים סטטיים ודינאמיים. לדברי Deumens, פרמטרים אלה ניתן גם לתכלת לקטגוריות של פרמטרים כלליים, פרמטרים הקשורים לכאב, כמו גם פרמטרים הקשורים לתיאום של הליכה²⁰ (טבלה 1). ההיתכנות של AGA לזהות שינויים בהתנהגות הליכה הוכח במודלים שונים של בעלי חיים של פגיעה עצבית^היקפית(PNI) 21 , כגון עצב הירך²⁰,^{עצב הירך 22},^{ועצב החציוני 23}^,²⁴. הוא משמש גם באופן שגרתי כדי להעריך את תפקוד הקטר בחולדות עם פציעות עצבים מרכזיות, למשל,^{שבץ 25} או חבלה בחוט^{השדרה 26}. ההתקדמות של השיטה טמורה בכמות הגדולה של נתונים דומים ובאפשרותה לתעד שפע של פרמטרים הקשורים הליכה²⁷. מאמר זה נועד לספק לחוקרים המעוניינים במודלים של בעלי חיים של PNI ופגיעה בחוט השדרה (SCI) עם קו מנחה מפורט וידי כדי להעריך את תפקוד הקטר במודלים כאלה.

קטגוריה	פרמטר	תיאור
פרמטרים כלליים של הליכה	אזור הדפסה (יחידת מרחק)	שטח טביעת כף הרגל
	אורך הדפסה (יחידת מרחק)	אורך טביעת כף הרגל
	בסיס תמיכה (BoS) (יחידת מרחק)	מרחק בין שתי כפות הרגליים האחוריות או הקדמיות
	אורך פסיעה (יחידת מרחק)	מרחק בין שני מיקום רצופים של כף רגל
פרמטרים הקשורים לכאב של הליכה	זמן נדנדה (עם)	משך שלב הנדנדה
	זמן המתנה (עם)	משך שלב העמידה
	עוצמת הדפסה של כפה מתכוונת (יחידה שרירותית)	משמעות iIntensity של טביעת כף הרגל במהלך שלב העמידה
פרמטרים הקשורים לתיאום ההליכה	תבניות רצף שלבים רגילים (NSSP)	רצפים ספציפיים של מיקום כפות רגליים במהלך מחזור שלב
	פיזור פאזה (%)	הבדלים זמניים בין מחזורי השלב של שתי כפות ספציפיות
	מדד סדירות (RI) (%)	כימות של קואורדינציה interlimb על ידי חלוקת כמות NSSP ללא רבב פעמים 4 על ידי המספר הכולל של מיקום כף הרגל במהלך מחזור צעד אחד

טבלה 1: פרמטרים של הליכה להעריך עם ניתוח הליכה אוטומטי. הקטגוריות שבהן הפרמטרים מסווגים נבחרות על פי דומנס^{ואח’ 20.}

Protocol

הפרוטוקול הניסיוני לכל הניסויים אושר מראש על ידי ועדת הביקורת של פרוטוקול בעלי חיים של ממשלת וינה. כל ההליכים בוצעו בהתאם להצהרת הלסינקי בדבר זכויות בעלי חיים ולמדריך לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות. 1. בעלי חיים חולדות זכר בית (לואיס או ספראג דאולי) במשקל 250-300 גרם תחת מחזור אור / כהה 12 שעות עם גישה ל-ad libitum למזון ומים. שליטה הן בטמפרטורת החדר (מתוחזקת ב- 20-22°C) והן בלחות (45%-65 %) לדיור לבעלי חיים הולם. עבור עבודה זו, זכר לואיס (PNIs) ו Sprague דאולי (SCI) חולדות שימשו. לספק כלוב חדש, נקי פעמיים בשבוע. חולדות בית בקבוצות של שתיים או שלוש ולעקוב מקרוב אחר ההתנהגות החברתית שלהם ואינטראקציה. אפשר לחולדות תקופת התאקלמות של שבוע אחד לפחות לפני כל הליך כירורגי או בדיקה תפקודית.הערה: חולדות דורשות לפחות 5 ימים של אימונים יומיים על מכשיר ניתוח הליכה לפני הניתוח, כך לחשב לפחות 2 שבועות בין הגעת החולדות במתקן ואת הנתונים המתוכננים לניתוחניסיוני 28. 2. אינדוקציה של פגיעה עצבית הערה: לבש ציוד מגן אישי כגון חלוק כירורגי, כפפות ומסכה. במקרה ששמלה כירורגית סטרילית אינה זמינה, די בחלוק מעבדה נקי ומלבן. אלא אם כן זה הופך מזוהם, השמלה או המעיל לא צריך להיות שונה בין בעלי חיים, אבל בין ניתוחים. מומלץ להשתמש בכפפות כירורגיות סטריליות. במקרה שכפפות כאלה אינן זמינות, ניתן להשתמש גם בכפפות בדיקה, אך יש לשטוףן לפני הניתוח באמצעות חיטוי כירורגי. יש להחליף כפפות בין בעלי חיים. ביום הניתוח, נסו למזער כל כמות של לחץ על בעלי החיים, מכיוון שזה עלול להפריע להרדמה, למשל, בעלי חיים ידרשו מינונים גבוהים יותר של הרדמה. ביום הניתוח, להזריק 0.05 מ”ג Buprenorphine/kg משקל גוף בהשעיה עם 100-200 μL 0.9% NaCl תת עורית באמצעות 25 G canula 1 שעות לפני הניתוח כדי לספק משכך כאבים טרום-ניתוחי. אם לא צוין אחרת, האגף של העכברוש הוא האתר המועדף להזרקה. מרדים את החולדות על ידי הצבתן בתא אינדוקציה הרדמה המחובר לאיידוי sevoflurane ומיכל גיר פעיל כדי לספוג את CO2. להרדים את החולדה על ידי הצפת תיבת ההרדמה עם 4%-5% תערובת sevoflurane-חמצן במשך כ 5 דקות באמצעות זרימת חמצן של 1.5 L/min (שלב חניכה). חבר מהדק חמצון פעימה לאחת הכפות כדי לפקח על רוויית החמצן בדם של המכרסם. לשמור על מצב ההרדמה הכללית עם 2.5%-4.5% תערובת חמצן sevoflurane.הערה: עבור ניתוח ניסיוני, הרדמה כללית היא חובה. אשר הרדמה כללית על ידי בדיקת חוסר התגובה לגירוי צביטה של הזנב או כפות הרגליים. כאשר החולדה נכנסה להרדמה כללית, לגלח את areal בהתאמה כי הוא הולך להיות מנותח על ולחטא את האזור על ידי החלקה אותו לסירוגין עם אלכוהול חיטוי העור. החלקה סופית צריכה להתבצע עם חיטוי העור. מניחים אותו על משטח חימום מתכוונן בתנוחה הנדרשת (supine עבור מודל עצב הירך, נוטה מודל sciatic ו- SCI). הכנס גשושית מדחום גמישה בפי הטבעת של החולדה כדי לפקח על טמפרטורת החיה ולשמור עליו בסביבות 37 מעלות צלזיוס במהלך הניתוח. במהלך ההרדמה, הגן על עיני החולדה מפני היתוך באמצעות משחה לעיניים 3. אינדוקציה כירורגית של פגיעה עצבית בעת ביצוע הליכים כירורגיים, לדבוק אך ורק בשבעת העקרונות של Halsted29 כדלקמן: תמיד לטפל בממחטות בעדינות בעת עבודה איתם. הימנע קריעת או ריסוק הרקמות.הערה: מערכותמפשק עצמאיות של 30 או זמינות מסחרית מועילות להרחיק את השרירים וכלי הדם מתוך שדה ההפעלה. בזהירות לשמור על המוסטאזיס באמצעות hemostat חשמלי לצרוב כלי או ליגטורות כדי להבטיח המוסטזיס זהיר. תמיד לשמור על אספקת הדם לרקמות על ידי לנתח אותם בזהירות וטיפול בהם בעדינות. לשמור על asepsis קפדני על ידי לבישת מסכה, שמלה, וכפפות סטריליות. הימנע מתח על הרקמות על ידי החלת תפרים שאינם הדוקים מדי או רופפים מדי. לפייס בקפדנות את הרקמות על ידי הבאת הקצוות שלהם יחד ללא כל חפיפה.הערה: זה חשוב במיוחד במקרה של אפינורי או neurorrhaphy perineurial. בצע את כל ההליכים המיקרוסקופיים תחת הגדלה של פי 6-16 באמצעות מיקרוסקופ הפעלה. באופן אידיאלי, המיקרוסקופ מספק שני זוגות עינית כדי לאפשר תצפית על הפעולה על ידי עוזר. הימנע יצירה של חללים מתים על ידי תפירת בזהירות שכבות רקמות שונות. אינדוקציה של נוירוטמזיס עצב ירך של הירך הימנית לחשוף את עצב הירך הימני ברמה בינונית על ידי ביצוע חתך באורך 5 ס”מ בצד הגב של האיבר האחורי עם להב אזמל #10 מחובר ידית אזמל #3 ועל ידי ניתוח השרירים הנייחים ואת הרקמה הרכה. מניחים מפשק בתוך הפצע כדי לשמור על השריר המצועצע והעור מחוץ לסיטוס. לחשוף בעדינות את העצב על ידי הסרת הרקמה שמסביב באמצעות מספריים מיקרוכירורגיים מעוקלים. הסר קטע עצב באורך 8 מ”מ של עצב הירך הפרוקסימלי 1-2 מ”מ לטריפורציה שלו עם מספריים מיקרוכירורגיים ישרים. לסובב את קטע העצב 180°, למקם אותו בין הגדם הפרוקסימלי והדיסטלי של עצב הירך הקצוצת ולבצע neurorrhaphy אפינורי בכל אתר עם שני תפרים 10-0 קטע ומחזיק מחט מיקרוכירורגית. אינדוקציה של נוירוטמסיס עצב הירך על האחוריים הימניים בצע חתך במפשעה 3-4 ס”מ אורכי עם להב אזמל #10 המחובר ידית אזמל #3 על מנת לחשוף את צרור נוירווסקולרי הירך הנכון. השתמש במספריים כירורגיות עבור ניתוח בוטה עד bifurcation של עצב הירך נחשף. מניחים מפשק בתוך הפצע כדי לשמור על השריר המצועצע והעור מחוץ לסיטוס. לתקע את הענפים המוטוריים והחושיים החשופים דיסטליציה ל bifurcation ולגזול קטע עצב 6 מ”מ ארוך של כל ענף, בהתאמה, באמצעות מספריים מיקרוכירורגיים ישר. לסובב את שני קטעי העצב 180°, למקם אותם בין הגדם הפרוקסימלי והדיסטלי של ענפי עצב הירך הקצוצים ולבצע neurorrhaphy epineurial בכל אתר עם שני תפרים 11-0 קטעים ומחזיק מחט מיקרוכירורגית.הערה: בצע שתל עצב הומוטופי אוטולוגי על-ידי השתלת השתלת המנוע לענף המנוע המקורי ואת השתל החושי לענף החושי המקורי. לחלופין, לבצע שתל עצב אוטולוגי הטרוטופי על ידי השתלת השתל המנוע לענף החושי המקורי ולהיפך. אינדוקציה של פגיעה בחוט השדרה של בית החזה לבצע חתך בעור על פני עמוד השדרה של בית החזה עם להב אזמל #10 מחובר ידית אזמל #3 ואחריו שני חתך שרירים במקביל לתהליכים קוצניים כדי להקל על נסיגת שרירים. מניחים מפשק בתוך הפצע כדי לשמור על השריר המצועצע והעור מחוץ לסיטוס. זהה את חוליית בית החזה ה-11 (Th) ויחשוף את ה למינציה של קשת החוליות על ידי הסרת רקמה מעל, כמו גם את התהליך הספיני באמצעות rongeur. לבצע כריתת למינקטה באמצעות מקדחה מיקרו בר מתאים לקדוח חור קטן לתוך ה למינה, מעט גדול יותר מהקצה של המשפיע. כדי למנוע נזק לחוט השדרה, רק לדלל את ה למינה בעת פתיחה והגדלת החור באמצעות rongeur. אם periosteum עדיין שלם, בזהירות להסיר אותו באמצעות בדיקה מחודדת חדה מבלי לפגוע מאטר dura. לאחר הבטחת חור גדול מספיק נעשה מבלי לערער את היציבות למינה, להחזיק את עמוד השדרה של בעל החיים במקום על ידי הידוק אותו rostrally וcaudally Th11 עם מלחציים ייצוב של המשפיע. בעזרת גלגלי היד בחזית ו בצד, מקם את מוט הפלדה 3-5 מ”מ מעל חור כריתת ה למינקט. לבסוף, לחשוף את כל בעלי החיים להשפעה עם כוח מוגדר של 150 kilodyne כדי לגרום מידה קלה עד בינונית של חבלה בחוטהשדרה 4. לבצע סגירת פצע בשכבות אנטומיות באמצעות polyglactin 4-0 או 5-0 קטעים תפרים ומחזיק מחט כירורגית. נקה את הפצע ביסודיות על ידי ניגוב עדין עם משטח גזה ספוג סטרילי 0.9% NaCl. לאחר הניתוח, החזירו את בעלי החיים לכלוב הבית שלהם והגן עליהם מפני חשיפה לאור וקול. עקבו מקרוב אחר התנהגות בעלי החיים עד ליום שלאחר הניתוח (DPO) 7 ולהבטיח צריכת מזון ומים מספקת. במידת הצורך, לספק נוזל נוסף על ידי זריקות תת עוריות (למשל, 10 מ”ל NaCl 0.9%). לספק משכך כאבים לאחר הניתוח למינימום של 2 ימים באמצעות, למשל, אופיואידים (0.05 מ”ג/ק”ג משקל גוף Buprenorphine תת עורית (s.c.)) ו / או antipyretics (4 מ”ג/ ק”ג משקל גוף Carprofen s.c.). במידת הצורך, ובמקרה של מודל SCI, לספק גם טיפול אנטיביוטי לאחר הניתוח (7.5 מ”ג/ק”ג משקל גוף Enrofloxacin לכל מערכת הפעלה (p.o.)). במקרה של פגיעה בחוט השדרה, רוקן ידנית את שלפוחית השתן של העכברוש עד שההשתנה הספונטנית תחזור. 4. התאוששות מהתערבויות כירורגיות לפני ניתוח הליכה הערה: חולדות עם פגיעה בעצב הירך להראות את הנטייה לכרסם על כפות הרגליים האחוריות שלהם בשל תחילתו של נוירופתיה כואבת בעקבות פגיעה עצבית. צורה זו של השתקה אוטומטית עלולה לגרום להדחה אוטומטית של בהונות או חלקים של כף הרגל האחורית המתאימה. מעדיף חולדות לואיס על זנים אחרים חולדה במקרה בעת שימוש במודל פגיעה בעצב הירך, כמו זן חולדה זה מראה נטייה קטנה יותר עבור automutilation31. חולדות עם פגיעה בעצב הירך גם להראות את הנטייה לפתח התכווצויות של האיבר המופעל, אשר עלול לגרום הדרתם מהמחקר עקב הפרעה לרכישת נתונים. תופעות לוואי כאלה מתרחשות הרבה פחות נפוץ בחולדות עם פגיעה בירך. בדוק בעלי חיים המופעלים מדי יום לאחר הניתוח עם תשומת לב מיוחדת על מצב הגפיים והכפות שלהם, בהתאמה.הערה: בחולדות עם SCI, בשיא Th11, צניחה פין או פי הטבעת עלולה להתרחש עקב הפגיעה ביכולת הטבעית של בעלי החיים להשתין ו לעשות להם שתן. אירועים אלה מוגדרים בדרך כלל כנקודות קצה אנושיות של המחקר ומרמזים על הדרה מיידית של בעל החיים המושפע מהמחקר. המשך משכך כאבים לאחר הניתוח עד חולדות להפסיק להציג כל סימפטומים הקשורים לכאב. במקרה של כאב מתמיד, לתת גאבאפנטין (30-120 מ”ג/ק”ג משקל גוף) p.o. לטיפול בכאב נוירופתי. 5. הכנה לפני ביצוע ניתוח הליכה אוטומטי הערה: המתודולוגיה של מערכת ניתוח ההליכה מבוססת על הקלטת בעלי החיים מלמטה בעת חציית לוח זכוכית, המואר באור LED ירוק. כאשר כפות הרגליים של בעלי החיים יוצרות קשר עם הרצפה, שטח טביעת כף הרגל מואר ומוקלט על ידי מצלמת וידאו במהירות גבוהה. לאחר מכן, נתונים אלה נשלחים באמצעות כבל Ethernet למחשב שבו פועלת תוכנת ניתוח ההליכה. בעוד עקבות בודדים יכול להיות מסווג באופן ידני על ידי experimenter, גרסת התוכנה העדכנית ביותר כוללת גם סיווג טביעת רגל אוטומטי. בצע את כל הליכי הבדיקה בחושך ובהיעדר רעשים מטרידים. מאז חולדות מסוגלים לתפוס תדרים על קוליים, גם לוודא כי אין מקורות פולטים צלילים כאלה.הערה: לבצע ניתוח הליכה שבועי או כל שבוע שני, אבל לא לבדוק חולדות בתדירות גבוהה מדי כמו חולדות לואיס במיוחד נוטים לאבד עניין בהשתתפות בהליך לאורך זמן כאשר הם נחשפים תרגיל מסוים בתדירות גבוהה מדי. עם זאת, הוא נדרש לאמן חולדות מדי יום במשך 5 ימים לפני הניתוח כדי להתאים אותן לסביבת הבדיקה ולהליך. במהלך האימונים וביום הבדיקה, הכינו את חדר הבדיקה ההתנהגותי על-ידי כיבוי כל מקורות האור, דבר שעלול להפריע אחרת למצלמה האוטומטית של התקן ניתוח ההליכה. מקם את מסך המחשב הדרוש לרכישת נתונים הרחק מהמצלמה כדי למנוע מהאור שלו להפריע למצלמה. ודא שההתקן מותקן במיקום יציב ובאופן המונע כל צורה של רטט, מכיוון שפעולה זו תפריע ברצינות להליך רכישת הנתונים. הביאו את החולדות לחדר הבדיקה ההתנהגותי והסתגלו בכלוב הבית שלהם לפחות 30 דקות לפני הבדיקה.הערה: בכל פעם שמטפלים בבעלי החיים, לבשו ציוד מגן אישי כגון חלוק כירורגי או חלוק מעבדה, כפפות ומסכה. 6. ביצוע ניתוח הליכה אוטומטי אימוניםהערה: במהלך האימון, בעלי חיים יעברו עקומת למידה, לכן מומלץ להתאים את לוח הזמנים של האימונים בהדרגה. השתמשו בתגמולי מזון (למשל, 1-2 חתיכות של דגני בוקר) כדי לתגמל את בעלי החיים לאחר סיום מוצלח של כל אימון. ביום הראשון של האימון, הרימו בעדינות את החיה על ידי החזקתה מתחת לתא המטען שלה וסחבו אותה בעדינות לכניסה לכניסה לדרך. מניחים את החיה באזור הכניסה ותנו לו לחקור את פתיחת המסדרון ללא כל הפרעה מהאדם שביצע את הליך הבדיקה.הערה: אל תצעקו, תשרוק, תשרוק או תדקרו את החיה בניסיון להניע אותה לחצות את השביל. כל התנהגות כזו תלחץ קשות על בעל החיים ותסבך עוד יותר את הליך רכישת הנתונים. חכו עד שהחיה תחצה מרצונה את השביל כדי להגיע לכלוב הבית שלה. לפעמים, במיוחד בבעלי חיים לא מאומנים, זה יכול לקחת עד כמה דקות. ביום האימון הראשון, החיה אינה צפויה ולא נדרשת לבצע ריצות רצופות במהירות הליכה אחידה. במקום זאת הוא צריך להתאקלם עם נוהל הבדיקה. ביום השני של האימונים, בעלי חיים רגילים להיכנס לדרך ללא היסוס, וגם לחזור לכלוב הבית שלהם ללא היסוס. בעלי חיים מסוימים כנראה כבר למדו לחצות את השביל ללא הפרעות, אבל זה עדיין לא נדרש בסוף היום השני. ביום השלישי של האימונים, ודאו שבעלי חיים ילמדו לחצות את השביל ללא היסוס, רחרוח או תנועות גישוש אחרות. ודא שהם הולכים במהירות אחידה. ביום הרביעי והחמישי של האימונים, חזור על התרגיל הקודם כדי לגבש את הליך הבדיקה.הערה: במקרה בעל חיים אינו רוכש את המיומנות הדרושה כדי לחצות את השביל כראוי עד סוף תקופת האימון של 5 ימים, להוסיף 2 ימים נוספים של אימונים (למשל, בסוף השבוע). כמו כן, שקול לבצע עד 3 אימונים ביום, מופרדים על ידי לפחות 2 שעות של מנוחה בין אימון בודד. ב-95% מהמקרים, בעל החיים ירכוש את חוויית האימון הנדרשת עד סוף תקופת אימון ממושכת זו. במקרה הנדיר בעל חיים עדיין לא רכש מיומנות זו לאחר 7 ימים של אימונים, מומלץ לדחות את הניתוח הניסיוני המתוכנן למשך שבוע לפחות ולחזור על משטר האימונים הנ”ל. 7. רכישת נתונים הערה: מערכת ניתוח ההליכה מדמיינת כל טביעת רגל בזמן שהחיה הולכת ומנתחת באופן אוטומטי פרמטרים שונים של הליכה כגון Paw Print Area, Paw Print Intensity, Paw Swing Time ו-Paw Swing Speed(שולחן 1). כאשר מערכת ניתוח ההליכה מתעדת את כל הנתונים בהתבסס על העוצמה שנוצרת על ידי הדפסי כפות הרגליים של בעלי החיים, ודא שהגדרות המצלמה מותאמות בהתאם למשקל ולגודל של החולדות. בנוסף, ודא שהדרך יבשה ונקייה לפני הקלטת נתונים כדי למנוע כל השפעה על רכישת נתונים. לפני רכישת נתונים כלשהם, נקו את השביל באמצעות מנקה זכוכית מסחרי ומגב. לרסס את צלחת הזכוכית מספר פעמים ולאחר מכן לנגב אותו עם המגב כדי להסיר את כל החלקיקים מפני השטח שלה. כמו כן, לנקות את התתים. הקפד להסיר כל נוזל מקצה השביל מאז בעלי החיים יכולים אחרת לדרוך על זה, אשר ישפיע על הנתונים הרשומים. חזור על הליך הניקוי במידת הצורך, למשל, זיהום של השביל ולפני הקלטה של נתונים של חולדה מכלוב אחר. זה נחשב כדי למנוע את דעתם של בעל החיים על ידי הריח של conspecifics שלהם. לפני רכישת הנתונים הראשונה, התאם את הגדרות המצלמה המתאימות למשקל בעלי החיים. אשר זאת על-ידי הצבת בעל החיים הקל והכבד ביותר על השביל ובחר הגדרת מצלמה המאפשרת איכות נתונים טובה בשני המקרים. כוונן את רווח המצלמה, אור התקרה האדום, אור השביל הירוק ותסף העוצמה הירוקה (GIT) כדי להבטיח זיהוי מיטבי של הדפסת כף הרגל.הערה: אל תשנה את ההגדרות שנבחרו לאחר רכישת נתונים החלה כמו זה יעכב את ההשוואה של הנתונים שנרכשו. כחריג, ניתן לשנות את ה- GIT במהלך סיווג נתונים, אך יש לעשות זאת עבור כל הניסויים באופן אחיד. הגדר וכויל את השביל באמצעות גליון הכיול שסופק. בחר מצלמה רשומה המופיעה בכרטיסיה התקנה. לחץ על לחצן פתח רכישה אשר ניתן למצוא בכרטיסיה רכישה. צלם תמונה של השביל הריק והנקי, אשר ישמש כהפניה לאורך כל הליך רכישת הנתונים הבא. שים לב לשינוי המצב מממתין לתמונה למוכן לרכישה. לחץ על לחצן התחל רכישה ושים לב לשינוי המצב ממוכן לרכישה כדי להמתין להפעלה להתחלה. מניחים חולדה על השביל ועקבו אחר תנועת החיה על מסך המחשב. שים לב לשינוי המצב מהמתנה להפעלה כדי להתחיל בהקלטה .הערה: התוכנה תסווג באופן אוטומטי הפעלות שהיא רואה תואמות בהתאם למאפייני הפעלה מוגדרים מראש עם סמל ירוק, בעוד שריצות שאינן תואמות יסומנו בסימן אדום. התוכנה עוצרת באופן אוטומטי את רכישת הנתונים כאשר נרשמו שלוש הפעלות תואמות, אך ניתן להמשיך ברכישת נתונים על-ידי לחיצה שוב על לחצן התחל רכישה. 8. סיווג נתונים הערה: עיין בטבלה 1 לקבלת רשימה של פרמטרי תוצאת AGA. יש צורך בלפחות שלוש ריצות תואמות, שבהן על החיה לחצות את השביל בהתמדה ללא היסוס27. בנוסף, מהירויות ריצה צריכות להתאים לאותן קטגוריות כמוגדר בספרות30. לחץ על לחצן סיווג בכרטיסיה סייר ניסיוני של הניסויים המתאימים שיש לסווג. הפעל את הריצה הנרכשת במהירות רגילה כדי לקבל רושם אם הנתונים תואמים לדרישות המפורטות קודם לכן. בפינה הימנית העליונה, לחץ על לחצן סיווג אוטומטי לצורך סיווג אוטומטי של הדפסות כפות רגליים על-ידי התוכנה.הערה: למרות שלתוכנה יש שיעור גבוה של סיווג כף רגל נכונה, לעתים היא אינה מצליחה להקצות כף יד להדפסים או מקצה את כף הרגל הלא נכונה. לכן, תמיד לבדוק את טביעות כף הרגל מסווגות אוטומטית לאחר מכן. לחישוב נכון של תבניות רצף שלבים רגילים (NSSPs), ודא שאלגוריתם הסיווג אינו מבולבל על-ידי הדפסות כף רגל שאינן נראות לעין, המובילות ל- NSSP פגום(איור 1A). לכן, כלול רק את הדפסי כף הרגל הניתנים לזיהוי בעוד כף הרגל ההפוך גלויה גם לחישובי NSSP, למשל, כף הרגל הקדמית השמאלית (LF) וכף הרגל האחורית הימנית (RH)(איור 1B). איור 1: נתוני AGA למופת, הממחישים את הצורך בבדיקה כפולה ידנית של סיווג הנתונים הנכון. במקרה שמיקום שזוהה של כף רגל קדמית יצליח במיקום שזוהה של כף רגל קדמית אחרת (A)תוכנת AGA עשויה לבלבל את זה עם דפוס הליכה לא מתואם מאז לא זוהו כפות אחוריות. לכן, מומלץ תמיד לבדוק שוב ולבחור טביעת כף רגל ראשונית, אשר מזוהה כאשר כף הרגל ההתפלה גלויה גם (ב). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. 9. חישוב סטטיסטיקה הערה: כדי להתאים נתוני ריצה לשינויים הקשורים לעלייה במשקל לאורך זמן, מומלץ מאוד לחשב יחס של כף הרגל הניסיונית עם כף רגל לא ניסיונית (למשל, בקרה). בנוסף, חשב את היחס לערכים טרום-פעולה של השוואה זו בין כפה לכף הרגל לשיקול של הבדלים בודדים בשימוש בכפות הרגליים. לחץ על לחצן הצג סטטיסטיקת הפעלה כדי לקבל מבט כולל מקיף על סטטיסטיקת ההפעלה. בחר קובץ וייצוא כדי לייצא סטטיסטיקת הפעלת סטטיסטיקה או סטטיסטיקת ניסיון לתוכנת גיליון אלקטרוני.

Representative Results

12 חולדות עברו ניתוח ניסיוני בעצב היקפי. ניתוח עצבי ירך(איור 2A) בוצעב-7 חולדות, בעוד שעצב הירך(איור 2B)הושרה ב-5 חולדות. בכל בעלי החיים, הפגם העצבי שוחזר באמצעות שתל עצב אוטולוגי. פגיעה בחוט השדרה(איור 2C)ברמה Th11 נגרמה ב-6 חולדות, וכתוצאה מכך 18 חולדות בסך הכל. איור 2: אתרים אופרטיביים לאחר שחזור עצבים. שחזור עצבי עם שקעים אוטומטיים בעצב הירך(A)ועצב הירך(B)גם לאחר פגיעה בחוט השדרה(C). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. כל בעלי החיים החלימו היטב מניתוח ולא התרחשו מקרים של השחתה עצמית. חיה אחת של קבוצת הפציעה בעצב הירך פיתחה התכווצויות חזקות של כף הרגל האחורית הימנית במהלך תקופת התצפית שלאחר הניתוח והיה צריך להיכלל בניתוח נתונים נוסף. נוירוטמיסיס עצב ירךמאז עצב הירך מספק פנימיות שרירים וחושיים לרוב האחוריים, הכריתה שלה גורמת לפגיעה חמורה בתפקוד הקטר. בעקבות הפציעה, חולדות להשתמש בעקב של כף הרגל לתמיכה במשקל בלבד(איור 3B-E)ואת האיבר מועבר בתנועת היקף גורפת. לכן, שינויי קטר המוערכים באמצעות AGA להתבהר באמצעות אזור הדפסה מופחת באופן משמעותי (איור 4A) וזמן נדנדה גדל באופן משמעותי(איור 4B). שני הפרמטרים עדיין שונו באופן משמעותי בהשוואה למדידות טרום-OP כמו בסוף תקופת התצפית. ראוי לציון, בעל חיים אחד פיתח התכווצויות חזקות של כף הרגל האחורית הימנית החל בשבוע שלאחר הניתוח (WPO) 10. כתוצאה מכך גדל אזור ההדפסה של כף הרגל האחורית הימנית ליותר מ-150% בהשוואה לכף הרגל השמאלית ב-WPO12(איור 5). מכיוון שזה היה גפיים בהשוואה לכל בעלי החיים האחרים שהוערכו במחקר זה, הוצאנו בעל חיים זה מניתוח נתונים בנוגע לאזור ההדפסה. איור 3: הדפסות כף הרגל המייצגות לפני ועקבות ניתוח גודל קריטי של עצב הירך הימני ותיקון הירך האוטומטי. שימו לב לירידה החזקה באזור ההדפסה בעקבות פגיעה עצבית(B)בהשוואה לטרום פעולה (A). למרות עלייה קלה באזור ההדפסה במהלך תקופת התצפית(C-E)טביעות כף הרגל של האיבר האחורי הימני נותרו שונות במיוחד מהקלטות בסיסיות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. איור 4: מהלך של התאוששות תפקודית לאחר ניתוח גודל קריטי ותיקון autograft של עצב הירך. יחס אזור הדפסה (A) ו- Swing Time Ratio (B) שונו באופן סטטיסטי מערכי טרום-ניתוח מיד לאחר ניתוח עצב הירך. בעוד אזור ההדפסה נשאר מופחת באופן משמעותי בהשוואה לקו הבסיס עד WPO10, זמן הנדנדה עדיין גדל באופן משמעותי לערכי טרום-OP ב- WPO12. *: p < 0.05 בהשוואה ל- Pre-OP, **: p < 0.01 בהשוואה ל- Pre-OP. קווי שגיאה מציינים ± שגיאה סטנדרטית של ה- Mean (SEM). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. איור 5: עלה תיבת של מהלך של אזור הדפסה בעקבות פגיעה בעצב הירך. שים לב לגפיים (אליפסה אדומה) ב WPO12, אשר מוסבר על ידי העובדה כי בעל חיים אחד פיתח התכווצויות חזקות של כף הרגל האחורית הימנית החל WPO10. לפיכך, בעל החיים לא נכלל בניתוח הסטטיסטי המוצג באות 4. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. נוירוטמיסיס עצבי בעצםהתכווצות עצב הירך גורמת לפירוק שריר הארבע ראשי שלהירך 33,34. כתוצאה מכך, הארכת הברך נפגעת, וכתוצאה מכך היפרפלקסיה של מפרק הקרסול עם הרמת עקב אורך כף הרגל. לכן, אזור ההדפסה של כף הרגלהמתאימה (איור 6B),מצטמצם מאוד לאחר הניתוח. שטח ההדפסה של כף הרגל האחורית השמאלית גדל עקב הסטה מפצה של משקל שמאלה. יש לזכור זאת, מכך שתופעה זו משפיעה ישירות על היחס המחושב בין כף הרגל ה”ניסיונית” ל”שליטה”. החל WPO4 reinnervation של quadriceps על ידי עצב הירך המתחדש מוביל היפוך של שינויים אלה וכתוצאה מכך הגדלת Paw Print Area של כף הרגל האחוריתהימנית (איור 7A). כמו שריר quadriceps של הירך גם משחק תפקיד בשלב הנדנדה של כף הרגל בהתאמה,זמן נדנדה (איור 7B)הוא ממושך מאוד בחולדות עם פגיעה בעצב הירך. שיקוף החזרה של אזור הדפסה, זמן נדנדה פוחת כמו עצב הירך המתחדש מגיע לשריר quadriceps של הירך. ב-WPO10, שני הפרמטרים של הליכה חזרו לקו הבסיס, איתות שחזור תפקודי מלא. איור 6: טביעות רגליים מייצגות. טביעות רגליים מייצגות לפני(א)ובעקבות (B-E) ניתוק עצב הירך הימני ותיקון הירך האוטומטי. שטח ההדפסה של RH ירד מאוד ב- WPO2 (B), בעוד עלייה באזור ההדפסה של כף הרגל האחורית השמאלית (LH) עקב עומס משקל מוגבר הפכה לגלויה. שטח ההדפסה של RH החל לגדול החל מ- WPO6 (C) מלווה בירידה באזור ההדפסה של LH. באזור ההדפסה WPO8 (D) ו- WPO10 (E) של RH התאושש בחזרה קרוב לרמות שלפני הניתוח. (הותאם באישור היינזל ואח’22, מורשה תחת CC על ידי 4.0.) לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. איור 7: מהלך ההחלמה הפונקציונלית לאחר ניתוח של 7 מ”מ ותיקון אוטומטי של עצב הירך. מהלך יחס שטח ההדפסה(A)ו-Swing Time Ratio(ב)חשף שינוי חזק מיד לאחר ניתוק עצב הירך, אך הערכים התאוששו בחזרה לערכים שלפני הניתוח ב-WPO8. מס’ 100. קווי שגיאה מציינים ± SEM. (מותאם באישור של היינזל ואח ’22, מורשה תחת CC על ידי 4.0.) לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. חבלה בחוט השדרהניתוח הליכה גילה טביעות רגליים שהשתנו במידה ניכרת לאחר פגיעה בחוט השדרה(איור 8), הראוילציון ביותר לתווה באזור ההדפסה וסיבוב פנימי מסומן של כפות הרגליים האחוריות ב WPO2(איור 8B). ראוי לציון, סיבוב הכף מיושם גם כתכונה ניתנת להערכה ב-BBB, מתוך לחץ על הישימות של ניתוח הליכה ממוחשב כדי להעריך שינויים של הליכה אשר הוערכו במקור עם בדיקות שדה פתוח. לגבי מהלך הפרמטרים הבודדים של ההליכה, חבלה בחוט השדרה ברמת Th11 הביאה לירידה ביחס אזור ההדפסה(איור 9A) ותואםשל יחס זמן נדנדה(איור 9B). שני הפרמטרים במגמה כלפי רמות בסיסיות במהלך התצפית הנוסף, אבל לא היו שינויים משמעותיים סטטיסטית שנצפו. גם הפרמטר הקבוע הקשור לתיאום(איור 9C)ירד ב-WPO2, אך התואר השתנה מאוד בין בעלי חיים. הוא גם הפך לערכים טרום-ת’פעולה עד ל-WPO16. בסיס התמיכה של כפותהרגליים האחוריות (איור 9D),פרמטר כללי של הליכה על פי Deumens, הראה עלייה ניכרת, אשר היה משמעותי מבחינה סטטיסטית מ WPO10 עד WPO14. הוא הפך לכיוון רמות בסיסיות ב- WPO16 ולא השתנה עוד באופן משמעותי מהערך Pre-OP בשלב זה. איור 8: טביעות רגליים מייצגות של שתי כפות הרגליים האחוריות. טביעות רגליים לפני הניתוח(A)ובעקבות פגיעה בחוט השדרה(B-F). שימו לב לירידה באזור ההדפסה החל מ-WPO2 (B) בליווי סיבוב פנימי בולט של הכפות. במהלך תקופת התצפית(C-F)ניתן לצפות במערך של אזור ההדפסה, כמו גם אישור של הסיבוב הפנימי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. איור 9: חבלה בחוט השדרה ברמת Th 11. חבלה בחוט השדרה ב-11 Th הביאה לשינויים ניכרים ביחס אזור ההדפסה (A) ו-Swing Time (B) ובמדד הרגילות (C), אך שינויים אלה לא היו משמעותיים סטטיסטית. בעקבות הפציעה, בסיס התמיכה של כפות הרגליים האחוריות הראה עלייה ניכרת בהשוואה לקו הבסיס, מה שהיה משמעותי סטטיסטית ב WPO10 עד WPO14. *: p < 0.05 בהשוואה ל-Pre-OP. קווי שגיאה מציינים ± SEM. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. קובץ משלים 1: פתרון בעיות פרטים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

הערכת התאוששות תפקודית במודלים של בעלי חיים של PNI ו-SCI נותרה מאתגרת בשל מגוון שיטות ההערכה הגדולות, כל אחת עם יתרונות וחסרונות אישיים. רק גישות מעטות נבדקו ואושרו במודלים מרובים של פציעות עצבים היקפיות ומרכזיות, אם כי טכניקות חדשות מבטיחות המשלבות מעקב תנועה ולמידת מכונה עשויות להניע את המחקר הנוירו-התנהגותי לשלב הבא של בדיקות פונקציונליות. אנו משוכנעים כי שיטות חדשניות החלות באופן נרחב על מגוון רחב של מודלים של בעלי חיים ופציעות בקרוב יצוצו. לאור שיקולים אלה, אחד היתרונות של AGA היא האפשרות להעריך התאוששות תפקודית במודלים מרובים של פגיעה עצבית באמצעות מכשיר אחד בלבד. מאז תחילת שנות ה-2000 גישה זו שימשה במודלים ניסיוניים של PNI^{כגון sciatic 37},^{peroneal 38}, ו פגיעה בעצב^{הירך מודל 22, כמו} גם לאחר שבירה שורש של^{המותניים 39} ואת הפלקסוס brachial⁴⁰. פציעות עצבים מרכזיות שונות כולל פגיעה חבלה בחוט השדרה נחקרו גם בשיטה⁴¹^,⁴². עם נייר זה, הציגנו פרוטוקול מפורט על איך לגרום שלוש פציעות עצביות נפוץ, כמו גם כיצד להעריך התאוששות פונקציונלית לאחר מכן. לדעתנו, קו מנחה מעשי לחוקרים המעוניינים בתחום של פגיעה עצבית ניסיונית, תיקון, והתחדשות על איך לעשות שימוש אופטימלי של התכונות היתרון של השיטה יהיה עזרה רבה.

מספר מחברים התייחסו לפוטנציאל של AGA להעריך התאוששות פונקציונלית מכרסמים, הדגיש את היתרון של השיטה בו זמנית להעריך פרמטרים הליכה הקשורים 7 57 מנוע וחושי²⁷^,²⁸. בנוסף, השוואת נתונים מכף רגל ניסיונית, למשל, פגיעה עצבית משוחזרת בכף רגל לא פעילה כפי שהוצגה בשני הדגמים שהוצגו מאפשרת הכללה של שליטה חיובית פנים-חיה. הפוך, כף רגל מופעלת ללא שחזור כירורגי או טיפול נוסף יכול לשמש שליטה שלילית פנים-חיה. כמו כן, הוצג כי ניתן לשלב AGA עם גישות למידת מכונה⁴³. למרות היתרונות של השיטה, יש לה גם מספר מגבלות וחסרונות, כגון מאמצי ההכשרה הצורכים זמן רב, אשר מחייבים להתרגל בעל^{החיים להליך הרכישה 28}^,⁴⁴. מגבלה נוספת של AGA היא הגודל המרבי של בעלי החיים הזכאים לבדיקה בשל הממדים המוגבלים של ההתגוון. לכן, השימוש ב-AGA מוגבל כיום לבעלי חיים בגודל של מכרסמים וחמוסים⁴⁵. בנוסף, לאחרונה המתעוררים גישות הערכה neurobehavioral בתחום מעקב תנועה מסוגל למידת מכונה עשוי לעלות AGA הן מקיף, כמו^{גם יישומים אפשריים 18}^,¹⁹^,⁴⁶. ראוי לציון ביותר, אך בהתאם לשיטות הערכה אחרות, נראה כי התאוששות פונקציונלית כפי שהוערכה על ידי AGA מוגבלת מאוד – אם בכלל מתרחשת – במודלים של נוירוטמיסיס^{עצב ירך 47}^,⁴⁸. מצד שני, AGA מאפשר הערכה מקיפה של מהלך ההחלמה תפקודית בעקבות נוירוטמיזיס עצב הירך כפי שהראה הנתונים שלנו. עם עבודה זו, הוכחנו כי Paw Print Area הוא פרמטר הליכה מייצג להעריך באמצעות AGA, אשר למופת עבור מהלך של התאוששות תפקודית בשני מודלים של פגיעה בעצב היקפי הנ”ל שהוצגו על ידינו. בעוד התאוששות פונקציונלית ad integrum היה נצפה לאחר תיקון autograft של עצב הירך, פרמטרים AGA עדיין שונו באופן משמעותי מקו הבסיס בסוף תקופת התצפית לאחר תיקון autograft של עצב הירך. ראוי לציין בהקשר זה כי התכווצויות גפיים הן תופעה נפוצה בחולדות עם פגיעה בעצב הירך וזהירות יש צורך לא לבלבל סימנים אלה של חוסר איזון שרירים ושיתוק עם^{ההליך התאוששות תפקודית 32}. זה מצד אחד מדגיש את חוסר היכולת של שיטת AGA לזהות התאוששות תפקודית משמעותית בעקבות פגיעה neurotmesis במודל זה. מצד שני, זה מעלה את השאלה אם זה אפשרי להעריך את מודל פגיעה עצבית sciatic של החולדה, שהוא עדיין המודל הנפוץ ביותר לתיקון עצבי ניסיוני, באמצעות ניתוח הליכה באופן כללי במקרה הפציעה העצבית חמורה יותר מאשר axonotmesis⁴⁸. פרטי פתרון בעיות מסופקים בקובץ משלים 1.

כמו כן, סיפקנו נתונים למופת על השימוש בשיטה להערכת פונקציית הקטר בחולדות עם פגיעה בחוט השדרה, דבר אפשרי ללא שינויים נדרשים בהליך הגדרת החומרה או ברכישה. אותו עיקרון חל על מודלים אחרים של פגיעה בעצבים מרכזיים (CNI)²⁶^,⁴⁹^,⁵⁰ ופציעה בשורש. בניגוד PNIs מבודד, פציעות של חוט השדרה הם הרבה יותר מורכבים בהשלכות הפתופיזיולוגיות שלהם, כמו שפע של מבנים חשובים מאוד פגומים, מעורבים מסלולים תוססים כגון קורטיקו השדרה ומסלולים אדן-שדרתיים כגון עמודי גב וspinothalamic^35. האתגר להעריך כראוי שינויים פתולוגיים אלה משתקף חימוש מקיף של בדיקות התנהגותיות, כגון באסו, ביטי, ו Bresnahan (BBB)^{ציון 36}. הפרמטר gait Base of Support דווח להגדיל בעקבות פציעות עצבים מרכזיות, ככל הנראה כדי להסביר הליכה לא יציבה וכתוצאה מכך. בסיס התמיכה שונה באופן משמעותי מקו הבסיס מ-WPO10 עד WPO14 במודל שלנו, ותמך בהנחה שלנו כי פרמטר זה מאפשר הערכה של מהלך ההחלמה הפונקציונלית על ידי AGA בעקבות פגיעה בחוט השדרה של בית החזה.

אנו משוכנעים כי AGA הוא כלי אפשרי כדי להעריך התאוששות תפקודית מכרסמים עם פציעות של מערכת העצבים. אף על פי כן, אנו ממליצים לשקף את השינויים שנצפו של הליכה בזהירות וביסודיות בכל התקנה ניסיונית בהתאמה. שינויים בפרמטרים הליכה, למשל, עלייה באזור ההדפסה לאחר הפחתה מיידית לאחר הניתוח או ירידה בזמן נדנדה המשך העלאת מיד לאחר הניתוח של פרמטר זה, במהלך תקופת התצפית אינם קשורים באופן בלתי נמנע לשחזור פונקציונלי. במקום זאת, שינויים אלה יכולים להיות קשורים גם להתאמה תפקודית אפשרית כדי לשמור על הליכה לא בולטת, בהתחשב בכך חולדות הם מין טרף ולנסות להימנע מהצגת כאב או נכות^{לטורפים פוטנציאליים 51}. לכן, מומלץ להשתמש בניתוח הליכה אוטומטי ככלי משלים כדי להתייחס שינויים של הליכה לאמצעי תוצאה אחרים של פגיעה בעצב היקפי^{והתחדשות 21}. כפי שהוזכר קודם לכן, אנו גם מאמינים כי זה צריך להיות משתקף בקפידה אם מכרסמים עם neurotmesis עצב ירך צריך להיחקר באמצעות AGA כמו הממצא שלנו מצביע על כך התאוששות תפקודית מוגבלת מאוד במקרה זה.

כפי שמפורט בעבודה שלנו, הנכס העיקרי של AGA היא האפשרות ללמוד הן מנוע והן תחיד חושי בהמון דגמי PNI ניסיוניים, כמו גם CNI תוך דרישה רק התקנה אחת. לכן, השיטה היא, לדעתנו, כלי בעל ערך רב לבדיקות נוירו-התנהגותיות מקיפות. אחד הנכסים של AGA, שהוא האפשרות ללמוד מחדשות מוטוריות וחושיות במודלים בעלי חיים שונים של PNI ו- CNI תוך דרישה רק התקנה אחת, הוא לדעתנו היתרון העיקרי של השיטה בהשוואה לשיטות הערכה אחרות ללמוד^{התאוששות פונקציונלית, כגון ניתוח מסלול הליכה 52}, פון פריי^{בדיקות 53}, או קינמטיקה^{הליכה 16}. הפוטנציאל להעריך בו זמנית שינויים של הליכה אשר גם לתאם עם תוצאות של חקירות אלקטרופיזיולוגיות של שריר reinnervated²² או שיטות הערכה עבור^{פונקציה חושית 54} מבטיח לגבי יישומים עתידיים של השיטה. לכן אנו ממליצים להשתמש ב-AGA כדי לחקור התאוששות תפקודית במודלים של מכרסמים של PNI forelimb, כגון ulnar, רדיאלי, או עצב החציוני, או^{מודלים ניסיוניים העברת עצב 55}, אשר נותרו ללא מחקר עם שיטה זו עדיין.

אנו מספקים בזאת פרוטוקול מפורט על אופן השימוש בניתוח הליכה אוטומטי כדי ללמוד התאוששות תפקודית בשלושה מודלים של מכרסמים של פגיעה עצבית. בעוד השיטה דורשת התחשבות זהירה בהיבטים מרכזיים שונים כגון הכשרה נאותה וכיל קפדני של קשה ותוכנה, זהו כלי משלים אפשרי ויקר ערך להערכת התחדשות עצבית במודלים של מכרסמים של פגיעה עצבית מרכזית והיקפית.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים רוצים להודות לקארין ברנר על הטיפול הנלהב שלה בבעלי החיים. המחברים רוצים גם להודות לקלאודיה קיבל, ג’יימס פרגוסון, גבריאלה ליינפלנר וסוזאן דרכסלר על עזרתם במהלך הניתוחים הניסיוניים.

Materials

0.9% Saline	B. Braun Austria	3570410	Vehicle for drug delivery
1 ml syringe	B. Braun Austria	9161708V	Injecting device
10 ml syringe	B. Braun Austria	4606728 V	Injecting device
1-Propanol, 2-Propanol, Hexetidin	Gebro Pharma	N/A	Alcoholic skin disinfection
23-gauge (G) canula	B. Braun Austria	4657667	Canula for s.c. injection
26-gauge (G) canula	B. Braun Austria	4657683	Canula for s.c. injection
5 ml syringe	B. Braun Austria	4606710 V	Injecting device
Buprenorphine hydrochloride	Sigma	B9275	Analgetic agent
Burrs for Micro Drill	F.S.T	19007-29	Drilling of a hole inside the lamina
Caprofen	Zoetis Austria	N/A	Analgetic agent
Catwalk Automated gait analysis system	Noldus	N/A	Automatic analysis software of animal gait
Cauterizer Kit	F.S.T	18010-00	Cauterization of vessels during surgery
Enrofloxacin	Bayer Austria	N/A	Antibiotic
Ethilon (10-0)	ETHICON	2810G	Suture material for neurrorhaphy
Ethilon (11-0)	ETHICON	EH7465G	Suture material for neurrorhaphy
Eye ointment	Fresenius Kabi Austria	4302436	Eye protection during anesthesia
Friedman-Pearson Rongeurs	F.S.T	16221-14	Surgical instrument
Gabapentin	Wedgewood Pharmacy	N/A	Analgetic agent
Goldstein retractor	F.S.T	17003-03	Retraction of tissues during surgery
Hair trimmer	Aescular	N/A	Hair trimmer for shaving of the operation site prior to surgery
Heating Pad for rodents	ALA Scientific Instruments	N/A	Regulation of body temperature
Impactor	Precision Systems and Instrumentation	N/A	Induction of spinal cord contusion
Lewis rat ()	Janvier	N/A	Experimental animal
Magnetic Fixator Retraction System	F.S.T	18200-50	Retraction of tissues during surgery
Metzenbaum Baby Scissors	F.S.T	14019-13	Surgical instrument
Micro Drill	Word Precision Instruments	503599	Instrument for bone drilling
Micro Needle holder	F.S.T	12076-12	Surgical instrument
Micro-scissors (curved)	F.S.T	15023-10	Surgical instrument
Micro-scissors (straight)	F.S.T	15007-08	Surgical instrument
Mirror Finish Forceps	F.S.T	11251-23	Surgical instrument
Needle holder	F.S.T	12002-12	Surgical instrument
Operating microscope	Leica	M651 MSD	Magnification of the operative site
Povidone Iod	B. Braun Melsungen	N/A	Non-alcoholic skin disinfectant
Pulse Oximeter	STARR Life Sciences	N/A	Surveillance of heart rate and oxygen saturation
Rodent thermometer	BIOSEB	BIO-TK8851	Surveillance of body temperature
Scalpel blade	F.S.T	10010-00 (#10)	Surgical instrument to make an incision
Scalpel handle	F.S.T	10003-12 (#3)	Surgical instrument to make an incision
Sevoflurane Inhalation Vapour, Liquid (100%)	Baxter	HDG9117A	Anesthetic
Spatula & Probe	F.S.T	10090-13	Surgical instrument
Sprague Dawley rat ()	Janvier	N/A	Experimental animal
Sterila gauze 5x5cm	EVAC MEDICAL	E010.03.00215	Sterile gauze compress
Tissue Forceps	F.S.T	11021-12	Surgical instrument
Vicryl (4-0)	ETHICON	V3040H	Suture material for subcutaneous sutures
Vicryl (5-0)	ETHICON	V303H	Suture material for subcutaneous sutures
Vicryl cutting needle (4-0)	ETHICON	V392ZH	Suture material for skin sutures
Vicryl cutting needle (5-0)	ETHICON	V391H	Suture material for skin sutures

Referencias

Mohanty, C. B., Bhat, D. I., Devi, B. I. Use of animal models in peripheral nerve surgery and research. Neurology India. 9, 100-105 (2019).
Vela, F. J., et al. Animal models used to study direct peripheral nerve repair: a systematic review. Neural Regeneration Research. 15 (3), 491-502 (2020).
Verma, R., Virdi, J. K., Singh, N., Jaggi, A. S. Animals models of spinal cord contusion injury. The Korean Journal of Pain. 32 (1), 12-21 (2019).
de Medinaceli, L., Freed, W. J., Wyatt, R. J. An index of the functional condition of rat sciatic nerve based on measurements made from walking tracks. Experimental Neurology. 77 (3), 634-643 (1982).
Navarro, X. Functional evaluation of peripheral nerve regeneration and target reinnervation in animal models: a critical overview. The European Journal of Neuroscience. 43 (3), 271-286 (2016).
Sperry, R. W. The functional results of muscle transposition in the hind limb of the rat. The Journal of Comparative Neurology. 73 (3), 379-404 (1940).
Sperry, R. W. The effect of crossing nerves to antagonistic muscles in the hind limb of the rat. The Journal of Comparative Neurology. 75 (1), 1-19 (1941).
Sperry, R. W. Transplantation of motor nerves and muscles in the forelimb of the rat. The Journal of Comparative Neurology. 76 (2), 283-321 (1942).
Zimmerman, E. A., Chambers, W. W., Liu, C. N. An experimental study of the anatomical organization of the Cortico-Bulbar System in the Albino Rat. The Journal of Comparative Neurology. 123, 301-323 (1964).
Cohen, A. H., Gans, C. Muscle activity in rat locomotion: movement analysis and electromyography of the flexors and extensors of the elbow. Journal of Morphology. 146 (2), 177-196 (1975).
Barnett, S. A. . The Rat: A Study in Behaviour. , (1963).
Hare, G. M., et al. Walking track analysis: utilization of individual footprint parameters. Annals of Plastic Surgery. 30 (2), 147-153 (1993).
Hare, G. M., et al. Walking track analysis: a long-term assessment of peripheral nerve recovery. Plastic and Reconstructive Surgery. 89 (2), 251-258 (1992).
Bertelli, J. A., Mira, J. C. Behavioral evaluating methods in the objective clinical assessment of motor function after experimental brachial plexus reconstruction in the rat. Journa of Neuroscience Methods. 46 (3), 203-208 (1993).
Varejao, A. S., Melo-Pinto, P., Meek, M. F., Filipe, V. M., Bulas-Cruz, J. Methods for the experimental functional assessment of rat sciatic nerve regeneration. Neurological Research. 26 (2), 186-194 (2004).
Varejao, A. S., et al. Functional assessment of peripheral nerve recovery in the rat: gait kinematics. Microsurgery. 21 (8), 383-388 (2001).
Varejao, A. S., et al. Ankle kinematics to evaluate functional recovery in crushed rat sciatic nerve. Muscle and Nerve. 27 (6), 706-714 (2003).
Nath, T., et al. Using DeepLabCut for 3D markerless pose estimation across species and behaviors. Nature Protocols. 14 (7), 2152-2176 (2019).
Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neuroscience. 21 (9), 1281-1289 (2018).
Deumens, R., Jaken, R. J., Marcus, M. A., Joosten, E. A. The CatWalk gait analysis in assessment of both dynamic and static gait changes after adult rat sciatic nerve resection. Journal of Neuroscience Methods. 164 (1), 120-130 (2007).
Heinzel, J., et al. Use of the CatWalk gait analysis system to assess functional recovery in rodent models of peripheral nerve injury – a systematic review. Journal of Neuroscience Methods. 345, 108889 (2020).
Heinzel, J. C., Hercher, D., Redl, H. The course of recovery of locomotor function over a 10-week observation period in a rat model of femoral nerve resection and autograft repair. Brain and Behavior. , 01580 (2020).
Chen, S. H., et al. Changes in GABA and GABA(B) receptor expressions are involved in neuropathy in the rat cuneate nucleus following median nerve transection. Synapse. 66 (6), 561-572 (2012).
Chen, S. H., et al. Decreases of glycine receptor expression induced by median nerve injury in the rat cuneate nucleus contribute to NPY release and c-Fos expression. Life Sciences. 90 (7-8), 278-288 (2012).
Hetze, S., Romer, C., Teufelhart, C., Meisel, A., Engel, O. Gait analysis as a method for assessing neurological outcome in a mouse model of stroke. Journal of Neuroscience Methods. 206 (1), 7-14 (2012).
Sandner, B., et al. Systemic epothilone D improves hindlimb function after spinal cord contusion injury in rats. Experimental Neurology. 306, 250-259 (2018).
Kappos, E. A., et al. Validity and reliability of the CatWalk system as a static and dynamic gait analysis tool for the assessment of functional nerve recovery in small animal models. Brain and Behavior. 7 (7), 00723 (2017).
Deumens, R., Marinangeli, C., Bozkurt, A., Brook, G. A. Assessing motor outcome and functional recovery following nerve injury. Methods in Molecular Biology. 1162, 179-188 (2014).
Webster, G. V. Halstedian principles in the practice of plastic and reconstructive surgery. Stanford Medical Bulletin. 13 (3), 315-316 (1955).
Bozkurt, A., et al. A flexible, sterile, and cost-effective retractor system for microsurgery. Microsurgery. 31 (8), 668-670 (2011).
Carr, M. M., Best, T. J., Mackinnon, S. E., Evans, P. J. Strain differences in autotomy in rats undergoing sciatic nerve transection or repair. Annals of Plastic Surgery. 28 (6), 538-544 (1992).
Dellon, A. L., Mackinnon, S. E. Sciatic nerve regeneration in the rat. Validity of walking track assessment in the presence of chronic contractures. Microsurgery. 10 (3), 220-225 (1989).
Jackson, C. M. Anatomy of the rat. Transactions of the American Philosophical Society, Philadelphia, New Series, Volume XXVII, 1935. The Anatomical Record. 65 (1), 127-129 (1936).
Pena, M. C., Baron, J. Femoral nerve and rectus femoris muscle of the rat: a study in anatomy, histology, and histoenzymes. Annals of Plastic Surgery. 20 (6), 527-532 (1988).
Kjell, J., Olson, L. Rat models of spinal cord injury: from pathology to potential therapies. Disease Models and Mechanisms. 9 (10), 1125-1137 (2016).
Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
Bozkurt, A., et al. CatWalk gait analysis in assessment of functional recovery after sciatic nerve injury. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 91-98 (2008).
Godinho, M. J., et al. Immunohistochemical, ultrastructural and functional analysis of axonal regeneration through peripheral nerve grafts containing Schwann cells expressing BDNF, CNTF or NT3. PLoS One. 8 (8), 69987 (2013).
Pajenda, G., et al. Spatiotemporally limited BDNF and GDNF overexpression rescues motoneurons destined to die and induces elongative axon growth. Experimental Neurology. 261, 367-376 (2014).
Matsuura, Y., et al. The effect of anti-NGF receptor (p75 Neurotrophin Receptor) antibodies on nociceptive behavior and activation of spinal microglia in the rat brachial plexus avulsion model. Spine (Phila Pa 1976). 38 (6), 332-338 (2013).
Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
Koopmans, G. C., et al. The assessment of locomotor function in spinal cord injured rats: the importance of objective analysis of coordination. Journal of Neurotrauma. 22 (2), 214-225 (2005).
Frohlich, H., Claes, K., De Wolf, C., Van Damme, X., Michel, A. A machine learning approach to automated gait analysis for the Noldus Catwalk system. IEEE Transaction on Bio-medical Engineering. 65 (5), 1133-1139 (2018).
Batka, R. J., et al. The need for speed in rodent locomotion analyses. Anatomical Record (Hoboken, N. J). 297 (10), 1839-1864 (2014).
Wood, T., et al. A ferret model of encephalopathy of prematurity. Developmental Neuroscience. 40 (5-6), 475-489 (2018).
Abbas, W., Masip Rodo, D. Computer methods for automatic locomotion and gesture tracking in mice and small animals for neuroscience applications: a survey. Sensors. 19 (15), (2019).
Irintchev, A. Potentials and limitations of peripheral nerve injury models in rodents with particular reference to the femoral nerve. Annals of Anatomy. 193 (4), 276-285 (2011).
Haastert-Talini, K., Haastert-Talini, K., Assmus, H., Antoniadis, G. . Modern Concepts of Peripheral Nerve Repair. , 127-138 (2017).
Lu, L., et al. Growth differentiation factor 11 promotes neurovascular recovery after stroke in mice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, (2018).
Caballero-Garrido, E., Pena-Philippides, J. C., Galochkina, Z., Erhardt, E., Roitbak, T. Characterization of long-term gait deficits in mouse dMCAO, using the CatWalk system. Behavioral Brain Research. 331, 282-296 (2017).
Graham, D. M., Hampshire, V. Methods for measuring pain in laboratory animals. Lab Animal. 45 (3), 99-101 (2016).
Monte-Raso, V. V., Barbieri, C. H., Mazzer, N., Yamasita, A. C., Barbieri, G. Is the sciatic functional index always reliable and reproducible. Journal of Neuroscience Methods. 170 (2), 255-261 (2008).
Stossel, M., et al. Comparative evaluation of chitosan nerve guides with regular or increased bendability for acute and delayed peripheral nerve repair: a comprehensive comparison with autologous nerve grafts and muscle-in-vein grafts. Anatomical Record (Hoboken). 301 (10), 1697-1713 (2018).
Vrinten, D. H., Hamers, F. F. CatWalk’ automated quantitative gait analysis as a novel method to assess mechanical allodynia in the rat; a comparison with von Frey testing. Pain. 102 (1-2), 203-209 (2003).
Aman, M., Sporer, M., Bergmeister, K., Aszmann, O. Animal models for selective nerve transfers of the upper extremity. Handchirurgie Mikrochirurgie Plastische Chirurgie. 51 (4), 319-326 (2019).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artículo

Heinzel, J., Swiadek, N., Ashmwe, M., Rührnößl, A., Oberhauser, V., Kolbenschlag, J., Hercher, D. Automated Gait Analysis to Assess Functional Recovery in Rodents with Peripheral Nerve or Spinal Cord Contusion Injury. J. Vis. Exp. (164), e61852, doi:10.3791/61852 (2020).