自动步态分析，评估带外周神经或脊髓挫伤的啮齿动物的功能恢复

维也纳市政府动物议定书审查委员会事先批准了所有实验的实验议定书。所有程序都完全按照《赫尔辛基动物权利宣言》和国家卫生研究院实验室动物护理和使用指南执行。 1. 动物住房 房子雄性大鼠（刘易斯或斯普拉格道利）体重250-300克下12小时光/暗循环与广告利比图姆获得食物和水。 控制室温（维持在20~22°C）和湿度（45%~65%）足够的动物住房。对于这项工作，男性刘易斯（PNIS）和斯普拉格道利（SCI）大鼠被使用。 每周提供两次新的清洁笼。将大鼠组成两组或三组，密切监测它们的社会行为和互动。允许大鼠在任何外科手术或功能测试前至少1周的适应期。注：大鼠在手术前需要至少5天的步态分析设备每日训练，因此从大鼠抵达该设施到实验手术的预定数据28之间计算至少2周。 2. 神经损伤的诱导 注：佩戴个人防护装备，如手术服、手套和口罩。如果无菌手术服不可用，清洁、清洗过的实验室外衣也就足够了。除非受到污染，否则不需要在动物之间更换礼服或外衣，而是需要在手术之间更换。建议使用无菌手术手套。如果此类手套不可用，也可以使用检查手套，但应在手术前使用手术消毒剂清洗。手套应在动物之间更换。 在手术当天，尽量减少对动物的任何压力，因为这可能会干扰麻醉，例如，动物将需要更高剂量的麻醉剂。 在手术当天，注射0.05毫克布丙诺啡/千克体重在悬浮液中，100-200μL 0.9% NaCl皮下使用手术前 25 G canula 1 小时提供预和互操作的镇痛。如果没有其他指示，大鼠的侧翼是注射的首选部位。 麻醉大鼠，将大鼠放在麻醉感应室中，与一个合成氟兰蒸发器和一个活性粉笔容器相连，以吸收CO2。麻醉大鼠通过淹没麻醉盒与4%-5%的sevofluran-氧气混合物约5分钟使用1.5升/分钟的氧气流量（启动阶段）。将脉搏血氧仪夹连接到其中一只爪子，以监测啮齿动物的血氧饱和度。使用 2.5%~4.5% 的 sevofluran-氧气混合物保持全身麻醉状态。注：对于实验手术，全身麻醉是强制性的。通过检查对尾巴或爪子的挤压刺激缺乏反应来确认全身麻醉。 当大鼠进入全身麻醉后，剃掉将动手术的各口，用酒精和皮肤消毒剂交替轻扫区域，对该区域进行消毒。最后的刷卡应使用皮肤消毒剂进行。 将它放在可调节加热垫上，位于所需位置（股骨神经模型的 supine，易用于坐骨神经和 SCI 模型）。在大鼠的直肠中插入一个灵活的温度计探针，以监测动物的温度，并在手术期间将其保持在37°C左右。麻醉期间，使用眼药膏保护大鼠的眼睛免受干燥 3. 神经损伤的手术诱导 在进行外科手术时，严格遵守Halsted29的七项原则 ，如下所示： 处理组织时，请始终轻轻处理。避免撕裂或压碎组织。注：自制的30 或市售缩回器系统有助于将肌肉和血管远离操作场。 小心地维护用电动海莫塔特烧灼血管或连字的海莫西，以保证细心的海西。 始终保持血液供应的组织，仔细解剖和精心处理他们。 戴口罩、长袍和无菌手套，保持严格的防毒。 通过涂抹不太紧或不太松的缝合线，避免组织上的张力。 将组织的边缘结合在一起，无需任何重叠，从而精心地应用组织。注：这在肾上腺素或环心神经病的情况下尤其重要。使用操作显微镜在 6x~16x 放大率下执行所有显微手术程序。理想情况下，显微镜提供两对眼部，以便由助手观察手术。 通过仔细监测不同的组织层，避免产生死空间。 右后肢坐骨神经神经瘤的诱导 通过用#10手术刀刀片连接到#3手术刀手柄，解剖过度的肌肉和软组织，在后肢的后肢上执行一个5厘米长的切口，暴露右坐骨神经。将缩回器放在伤口内，使解剖的肌肉和皮肤远离原位。使用弯曲的显微手术剪刀去除周围的组织，轻轻暴露神经。 用直显微手术剪刀去除坐骨神经1~2毫米近部8毫米长的神经段。 旋转神经段180°，将神经段放在横坐神经的近角和近头树桩之间，并在每个位点用两个中断的10+0缝合线和一个显微手术针架进行活生生神经病。 右后肢股骨神经瘤的诱导 执行一个纵向3~4厘米腹股沟切口，用#10刀刀片连接到#3手术刀手柄，以暴露正确的股骨神经血管束。使用手术剪刀进行钝解剖，直到股骨神经的分叉暴露。将缩回器放在伤口内，使解剖的肌肉和皮肤远离原位。 使用直显微手术剪刀将暴露的马达和感觉分支分离到分叉，并分别切除每个分支的 6 mm 长神经段。 旋转两个神经段 180°，将它们放在跨切骨股神经分支的近位和近处树桩之间，并在每个位点进行活生生神经病，用两个中断的 11+0 缝合线和一个显微手术针架。注：通过将运动移植到原始运动分支和感觉移植到原始感觉分支上，执行同位自体神经移植。或者，通过将运动移植移植到原始的感觉分支（反之亦然）来执行异位自体神经移植。 胸脊髓挫伤的诱导 在胸椎柱上执行皮肤切口，用#10手术刀刀片连接到#3手术刀手柄，然后是两个平行于旋转过程的肌肉切口，以方便肌肉缩回。将缩回器放在伤口内，使解剖的肌肉和皮肤远离原位。 识别第 11th 胸椎 （Th）， 并暴露椎骨的层， 通过去除覆盖组织， 以及旋转过程使用荣器。 使用微钻和适当的毛刺进行拉明切除术，将小孔钻入层中，比撞击器的尖端稍大。为了防止对脊髓的损伤，在打开和扩大孔时，只用神经来稀释膜。如果周一仍然完好无损，请使用锋利的尖探针小心地将其拆下，而不会损坏杜拉母体。 在确保在不破坏层膜稳定的情况下制造一个足够大的孔后，用冲击器的稳定钳将动物的脊柱用玫瑰色和卡道夹住到Th11上，从而将动物的脊柱固定到位。使用前部和侧面的手轮，将钢棒放在拉明切除术孔上方 3~5 mm。最后，让所有动物受到150千迪耳的界定力的影响，以诱发轻度至中度脊髓挫伤4。 使用聚氨酯 4+0 或 5+0 中断缝合和手术针架在解剖层中执行伤口闭合。用浸泡在无菌 0.9% NaCl 中的纱布垫轻轻擦拭伤口，彻底清洁伤口。 手术后，将动物回到家中的笼子里，保护它们免受光线和声音的照射。密切监测动物的行为，直到术后日（DPO）7，并确保足够的食物和水摄入量。如果需要，通过皮下注射（例如，10毫升NaCl 0.9%）提供额外的液体。 通过阿片类药物（0.05毫克/千克体重丁丙诺啡皮（s.c.））和/或抗热药（4毫克/千克体重卡普罗芬.c.））提供术后镇痛至少2天。如果需要，在SCI模型中，还提供术后抗生素治疗（每os7.5毫克/千克体重Enrofloxacin（p.o.）。 在脊髓损伤的情况下，手动清空大鼠的膀胱，直到自发排尿返回。 4. 在步态分析之前从手术干预中恢复 注：坐骨神经损伤的老鼠由于神经损伤后出现痛苦的神经病变，有啃后爪的倾向。这种形式的自动利用可能导致脚趾或相应后爪的一部分自动被分割。使用坐骨神经损伤模型时，首选刘易斯大鼠，而不是其他大鼠菌株，因为这种大鼠菌株显示出较小的自残倾向31。坐骨神经损伤的老鼠也表现出手术肢体收缩的倾向，这可能导致它们因干扰数据采集而被排除在研究之外。这种不良事件在股骨损伤的大鼠中发生得要不常见。 手术后每天检查手术动物，特别注意它们的四肢和爪子的状态。注：在有SCI的大鼠中，在Th11的高峰期，由于动物的排尿和排便能力受损，可能发生性压住或直肠脱垂。这些事件通常被定义为研究的人类终点，意味着立即将受影响的动物排除在研究之外。 继续术后镇痛，直到大鼠停止显示任何疼痛相关症状。 在持续疼痛的情况下，服用加巴彭汀（30~120毫克/千克体重）以治疗神经病变疼痛。 5. 执行自动步态分析前的准备 注：步态分析系统的方法基于在穿过玻璃板时从下面记录动物，玻璃板由绿色 LED 灯照亮。当动物的爪子接触地板时，爪印区域通过高速摄像机进行照明和记录。然后，通过以太网电缆将这些数据发送到运行步态分析软件的计算机。虽然实验者可以手动对单个足迹进行分类，但最新的软件版本还具有自动足迹分类功能。 在无干扰噪音的情况下，在黑暗中执行所有测试程序。由于大鼠能够感知超音速频率，也验证没有来源发出这种声音。注意：每周或每隔一周进行步态分析，但不要太频繁地测试大鼠，因为刘易斯大鼠在过度接触某项运动时，往往会对参与手术失去兴趣。然而，在手术前每天训练大鼠5天，以使它们适应测试环境和程序。 在培训课程和测试日，通过关闭所有光源来准备行为测试室，否则可能会干扰自动步态分析设备的摄像头。将数据采集远离摄像机所需的计算机屏幕放置，以防止其光线干扰摄像机。 确保设备安装在稳定位置，并防止任何形式的振动，因为这将严重干扰数据采集程序。 将大鼠带到行为测试室，并在测试前将老鼠放在自己的家庭笼子里至少30分钟。注意：每当处理动物时，请穿戴个人防护装备，如手术服或实验室外套、手套和口罩。 6. 执行自动步态分析 训练注：在训练期间，动物将经历学习曲线，因此建议逐步调整训练计划。使用食物奖励（例如，1~2片早餐麦片）在成功完成每一个培训课程后奖励动物。 在训练的第一天，轻轻地抬起动物，把它放在它的树干下面，轻轻地把它抬到走道入口。 将动物放在入口区域，让它探索走廊的开口，而不受执行测试程序的人的任何干扰。注：不要尖叫、吹口哨、吹口或戳动物，以激励它穿过人行道。所有这些行为都会严重地给动物造成压力，并使数据采集程序进一步复杂化。 等到动物自愿穿过走道到达家笼。有时，特别是在未经训练的动物，这可能需要几分钟。在第一个训练日，动物既不期望也不要求以统一的步行速度进行不间断的跑步。相反，它应该适应自己的测试设备和程序。 训练的第二天，习惯动物毫不犹豫地进入走道，也毫不犹豫地回到自己的笼子里。一些动物可能已经学会了不间断地穿过人行道，但在第二天结束时，这仍然不需要。 在训练的第三天，确保动物学会毫不犹豫地穿过走道，嗅探，或以其他方式探索动作。确保他们以统一的速度行走。 在第四天和第五天的训练中，重复以前的练习以巩固测试程序。注：如果动物在5天训练期结束时没有获得正确穿越走道的必要技能，请额外增加2天的训练（例如周末）。此外，请考虑每天进行最多 3 次培训课程，在个别课程之间至少休息 2 小时。在95%的情况下，动物将在延长训练期结束时获得所需的训练经验。在极少数情况下，动物在训练7天后仍未获得这一技能，建议将计划好的实验手术时间至少推迟1周，并重复上述训练制度。 7. 数据采集 注：步态分析系统在动物行走时可视化每个爪印，并自动分析各种步态参数，如爪印面积、爪印强度、爪摆动时间和爪子摆动速度（表1）。由于步态分析系统根据动物的爪印产生的强度记录所有数据，请确保根据大鼠的体重和大小调整相机设置。此外，在数据记录之前，请确保走道干燥干净，以防止对数据采集产生任何影响。 在获取任何数据之前，使用商业玻璃清洁剂和挤压器清洁走道。喷洒玻璃板几次，然后用挤压器擦拭，以去除其表面的任何颗粒。此外，清洁下面的。确保从走道的末端取出任何液体，否则动物可能会踩到它，这将影响记录的数据。 必要时重复清洁程序，例如，在记录不同笼子的老鼠数据之前，对走道的污染进行。这被认为是为了防止动物被他们特定的气味分心。 在第一次数据采集之前，调整适合动物重量的摄像机设置。通过将最轻、最重的动物放在走道上来确认这一点，并选择一种相机设置，在两种情况下都可实现良好的数据质量。调整摄像机增益、红色天花板灯、绿色走道灯和绿色强度阈值 （GIT），以确保最佳的爪印检测。注意：在开始数据采集后，不要更改所选设置，因为这将妨碍采集数据的可比性。作为例外，可以在数据分类期间更改 GIT，但必须统一完成所有试验。 使用提供的校准表定义和校准走道。 选择”设置”选项卡中列出的 已注册 摄像机。 单击” 已打开获取 “按钮，该按钮位于”获取 ” 选项卡中。 拍摄空的清洁走道的快照，该走道将在整个数据采集过程中用作参考。 请注意状态从”等待快照”更改为”准备获取”。 单击”开始 获取” 按钮，并注意状态从” 准备获取” 更改为 “等待运行”开始。 将老鼠放在走道上，在电脑屏幕上跟随动物的运动。请注意状态从”等待运行”更改为”录制运行”。注：软件将自动根据预设的运行特性（带绿色符号）对运行进行分类，而不符合要求的运行将用红色符号标记。当记录三个兼容的运行时，软件会自动停止数据采集，但可以通过再次单击”开始获取 “按钮来 继续数据采集。 8. 数据分类 注：有关 AGA 结果参数的列表，请参阅表 1。 至少需要三次合规的跑步，动物必须毫不犹豫地平稳地穿过人行道。此外，运行速度应与文献30中定义的相同类别匹配。 单击要 分类 的各 试验的实验的 “实验资源管理器”选项卡中的”分类”按钮。 以正常速度播放获取的运行，以了解数据是否符合之前列出的要求。 在左上角，单击”自动 分类” 按钮，由软件自动分类爪印。注：虽然该软件具有高速率的正确爪子分类，它有时不能分配爪子打印或分配错误的爪子。因此，以后始终仔细检查自动分类的爪印。 要正确计算正常步进序列模式 （NSSP），请确保分类算法不会被不可见的爪印混淆，从而导致有缺陷的 NSSP（图 1A）。因此，仅包括可检测的爪印，而反面爪在 NSSP 计算中也可见，例如左前爪 （LF） 和右后爪 （RH） （图 1B）。 图1：示范性 AGA 数据，说明需要手动仔细检查正确的数据分类。如果检测到前爪的位置被检测到后，另一个前爪 （A） 的位置被检测到，AGA 软件可能会混淆这与不协调的行走模式，因为尚未检测到后爪。因此，建议始终仔细检查并选择初始爪印，当反面爪也可见时检测到该爪印 （B）。 请单击此处查看此图的较大版本。 9. 计算统计数据 注：为了调整运行数据，以适合随时间增加的体重增加相关变化，强烈建议使用非实验爪（例如控制）爪子计算实验爪的比例。此外，计算此爪子与爪子比较的术前值的比率，以考虑爪子使用中的个体差异。 单击” 查看运行统计信息 “按钮可全面了解运行统计信息。 选择”文件”和”导出”以将运行统计信息或试用统计信息导出到电子表格软件中。