스캐닝 전자 현미경 을 사용하여 대량 정보의 표적 수집을위한 배열 단층 학워크

아래 예제는 권장 워크플로의 다재다능함을 입증하는 것을 목표로 합니다. 사례 연구 일러스트레이션은 다른 기술로 만족스러운 결과를 얻는 데 어려움을 겪었던 프로젝트입니다. 우리는 Drosophila 성인을 선택하여 수많은 유형 의 샘플과 발생할 수있는 일반적인 도전을 설명했습니다. 이 관 기관은 약 6mm 길이, 단면에서 500-1000 μm, 독특한 기능 및 세포조성(도 4A)33을가진 다른 영역으로 나뉩니다. 단면 방향에 따라 직감 프로파일의 크기와 섹션의 모양은 다양합니다. 횡방향 또는 세로 지향 섹션은 상대적으로 크고, 단 몇 개만 단일 TEM 그리드(그림2F)에배치할 수 있다. 조직의 작은 부분만이 FIB에서 심화될 수 있으며, SBF-SEM의 경우, 난이도는 비균질성 샘플과 유사하다. AT는 이러한 샘플의 분석을 위한 효율적인 절충을 제공하고 평평한 포함은 ROI 국소화를 용이하게 합니다. 선택한영역(도 4B)주위의 수지 의 과잉을 신중하게 트리밍하는 것은 관련영역(도 4C)으로부터배열의 효율적인 수집에 중요하다. 수백 개의 단면은 단일 웨이퍼에서 순차적으로 또는 무작위로 수집할 수있습니다(그림 4D). 연구 질문에 따라 샘플 검사 및 획득에는 여러 시나리오로 임의로 분할된 다른 전략이 필요합니다. 보다 타겟팅된 다양한 시나리오를 설명하기 위해 다양한 연구 프로젝트에서 여러 사례 연구를 선택했습니다. 수많은 무작위로 분포된 대형 구조물 1-10 μm 범위의분석(도 4E)종종 초구조 데이터는 표준 및 실험적으로 변경된 조건을 비교하여 여러 실험 적 접근법에서 발생한 가설을 검증해야 합니다. 이러한 경우 여러 섹션은 일반적으로 그리드에서 무작위로 수집되고 관심 영역을 지역화하고 이미지화하도록 스크리밍됩니다. 이 전술은 일반적으로 덜 체계적이고 분석 된 섹션의 소수로 제한됩니다. 지정된리본(그림 4D)에서수십/ 수백 개의 중간 해상도 섹션의 개요를 기록하는 것이 좋습니다. 70nm의 전형적인 섹션의 경우, 200개의 섹션은 약 14μm에 걸쳐 있으며, 이는 완전히 또는 부분적으로, 반 시간 이내에 완성된 수많은 세포를 포함할 것이다. 첫 번째 단계로 전체 리본의 저해상도 개요가 기록되고 개요는 준비 유물(예: 접기, 먼지)을 표시하는 섹션을 생략하는 데 도움이 됩니다. 그 후, 단일 또는 모자이크 이미징을 사용하여 섹션의 선택된 부분 또는 전체 섹션에서 수동으로 또는 자동으로 수행한 다음 스티치(그림4E)를수행할 수 있다. 그런 다음 선택한 영역의 이미지를 고해상도 매개 변수를 사용하여 획득할 수 있습니다. 예를 들어, 미토콘드리아, 핵 및 마이크로빌리는 통계적으로 개선된방법(도 4Ei-iii)으로부터유익할 수 있다. 여러 개의 작고 드물게 분산된 구조물 500-1,000 nm 범위의 분석(추가 영화 1)이 시나리오에서는 저배율 개요 검사에서 ROI를 간단하게 식별할 수 없으며 고해상도 이미지가 필요합니다. 기존의 TEM 샘플에서는 필요한 피쳐가 발견될 때까지 섹션의 지루한 확대/축소가 필요합니다. 종종 여러 샘플에서 여러 독립적인 위치를 이미징하는 것은 단일 대량의 생성보다 통계적으로 더 관련성이 높습니다. 이러한 경우 수동 수집의 복잡성은 기하급수적으로 증가합니다. 여러 TEM 솔루션으로 자동 인수 또는 여러 그리드의 스크리닝을 가능하게 하지만 그리드 및 직렬 단면 문제의 크기는 많은 샘플에 대해 호환되지 않는 경우가 많습니다. 유사한 경우 관심 구조를 식별할 수 있는 해상도로 여러 섹션에서 전체 ROI의 전체 중간 해상도 맵을 생성합니다. 이 측면 검사 단계 동안, 무작위로 접근 할 때 관심구조의 적어도 일부를 공격하는 것을 목표로 한 번에 여러 섹션을 도약하는 것이 좋습니다. 이는 구조의 전체 치수에 크게 좌우됩니다: 예를 들어, 구조의 전체 크기가 500nm이고 단면이 50nm 두께인 경우, 적어도 9개의 순차적인 섹션이 연달아 관심 구조의 일부를 포함할 가능성이 높다. 이렇게 하면 6-7개의 단면을 건너뛰는 것이 여러 영역에서 다양한 종류의 구조물을 찾는 데 효율적입니다. 선택한 섹션의 해결된 모자이크 맵을 자동으로 획득하면 획득 후 이러한 섹션을 신중하게 선별할 수 있습니다. 이러한 고해상도 맵을 획득하면 여러 ROI를 잘라내거나 ROI(보조동영상 1)에서추가 로컬 이미징 영역을 정의하는 데 사용할 수 있습니다. 골기, 센트리올, 접합, 마이크로투룰, 다양한 유형의 소포는 이시나리오(보충 영화 1)로부터유익할 수 있는 구조의 좋은 예입니다. 큰 샘플에서 드물게 분포된 대형 ROI 분석(그림 4F-4H)이 시나리오에는 문제가 ROI 식별이 아니라 현지화에 있는 “건초 더미의 바늘”으로 자주 설명되는 드문 이벤트가 포함됩니다. 많은 샘플의 경우 상관 관계 접근 방식은 유효한 옵션이 아니지만 ROI는 노출되는 초구조를 가지며 국소화될 때 높은 신뢰성으로 식별할 수 있습니다. 이러한 샘플의 경우 중간 해상도에서 수십~수백 개의 섹션이 있는 사전 선별된 샘플부터 시작하여 다단계 인수를 적용하는 것이 필수적입니다. 여기에 사용되는 소프트웨어에는 여러 섹션의 이미지 집합을 얻기위한 두 가지 전략이 있습니다: 더 높은 해상도로 미리 보기 이미지를 기록하거나 적절한 설정으로 배열 타일세트(그림 4F)를획득합니다. Drosophila 창자에 있는 다른 특화된 세포 모형은 무작위로 분포됩니다 (예를 들면 줄기, 장내 분비 세포), 및 임의의 방향으로 단면얇은 단면. 그러나 단일 섹션에서 또는 직렬 이미지의 컬렉션으로 고해상도 매개 변수를 사용하여 얻은 이미지를 선별 한 후 시각적으로 구별 될 수 있습니다(그림 4G). 정렬 후 스택은 다른 소프트웨어 솔루션을 사용하여 렌더링할 수있습니다(그림 4H,보충 동영상 2). 시나리오 1: 장 내장 (그림 5A)오르가노이드는 현대 생명 과학의 가장 최첨단 도구 중 하나가 되고 있습니다. 이 거의 생리적인 3D 줄기 세포 유래 기관 모형은 조직 갱신, 약에 대한 반응 및 재생 의학을 포함하여 생체 내 생물학 프로세스의 범위에 대한 정확한 연구 결과 가능하게 합니다. 최근에 도입된 미니장관(34)은 생체 조직 생리학, 세포 형 조성 및 항상성을 밀접하게 닮은 차세대 오르가노이드 기술을 열어 질병 모델링, 숙주 미생물 상호 작용 및 약물 발견에 대한 광범위한 관점을 가능하게합니다. 그러나, 초구조적 특성화가 필요한 경우, 무작위 샘플을 이용한 이러한 큰 조직에서 상이한 세포 유형의 국소화가 어려울 수 있다. 또한, 가변 “감염”분석에서, 분석은 조직에 영향을 미치는 다른 발달 단계를 드러내는 것이 중요합니다. 이러한 연구에서는, 샘플의 통계적으로 유의한 범위는 중앙이지만 기존의 TEM 온 그리드 접근 방식을 사용하여 달성하기가 어렵습니다. AT-시나리오 1은 이러한 경우에 유익하다: 많은 순차적 섹션은 웨이퍼(그림5Aii)에서생성될 수 있으며, 저해상도 파라미터를 사용하여 심사하여 일반적인 관심 영역을 지역화할 수 있다(도5Aiii;arrows). 이러한 영역은 고급 획득 매개변수(그림 5Aiv 및 그림 5Av)를사용하여 추가 분석을 대상으로 할 수 있습니다. 관련 구조가 감지되면(일반적으로 100-300섹션마다 한 번씩 5~10개의 섹션의 클러스터)를 감지하면 관심 있는 각 구조에 집중하고 단일 이미지를 수동으로 수집하거나 자동화 기능을 사용하여 여러 섹션에서 이미지 볼륨을 획득하기 쉽습니다. 시나리오 2: 드로소필라 푸팔 노텀 (그림 5B)세포 분열과 세포 주기를 통해 진행을 통제하는 기계장치를 공부하는 것은 다세포 유기체에 있는 표준 및 변경된 프로세스 둘 다 이해하는 데 중요합니다. 존재하는 정보는 종종 단세포 시스템에서 파생됩니다. 그러나, 이 해결책은 조직에 있는 세포 사이 3D 상호 작용의 중요한 문맥이 결여됩니다. 노텀의 단일 세포 단층, 드로소필라 유충의 발전 후면은, 특히35에서상피 세포와 세포 분열 사이의 상호 작용을 위한 완벽한 모델이다. 그것은 형광 현미경 검사법과 유전 조작에 의해 유효한 데이터의 조합을 사용하여 분자 및 세포 상호 작용 연구를 위한 확립된 모형입니다. 세포 분열의 마지막 단계인 압착은 두 개의 분할 세포 사이의 최종 분리를 보장하고, 복근 중에 발생하는 구조적 변화를 특성화하는 것은 미토시스에 대한 우리의 이해에 필수적입니다. 그러나, 노텀내의 미토틱 분단은 초구조적 수준에서 국소화하기 쉽지 않다: 세포는 상대적으로 크고, 복근영역(도 5B)에비해. 복근 영역의 전체 크기와 커버할 단면의 표면 사이의 비율은크다(도 5Bi). TEM 또는 SBF-SEM메서드(36)를사용하여 임침근 영역을 현지화할 수 있더라도 작업이 힘들다. 이 시나리오에서는 20-40개의 단면의 도약에 대한 자동 중간 해상도 개요 이미지를 사용하여 분할셀(그림 5Bii)을국소화할 수 있다. 이러한 세포가 확인되면, 섹션은 부근의 단면을 면밀히 검사하기 위한 앵커 역할을 하며, 추가 분석을 위해 수많은 분할 세포를 찾아서 선택할 수 있다. 이러한 방식으로, 복근 영역은전체(그림 5Biii)에위치및 이미지화될 수 있다. 질문에 따라 단일 고해상도 이미지 또는 3-7 이미지 시퀀스를 수집하여 구조의깊이(도 5Biv)를커버할 수 있습니다. 시나리오 3: 마우스 타니사이클 뉴런 (그림 5C)마우스는 두뇌 발달을 위한 잘 확립된 모형을 제공하고 EM에 의해 포함하여 다른 수준에 잘 문서화됩니다. 다른 자동화 된 직렬 블록 얼굴 방법은 뇌 조직을 연구하기 위해 광범위하게 사용되었지만 AT가 필요한 데이터를 수집하기 위해 더 잘 적응되는 경우가 있습니다. 시상 하 부는 잘 설립 된 신경 과학 모델, 여러 신경 유형 기능을 포함 하는 뇌의 일부. 시상 하 부 타니 사이클은 제 3 심실의 바닥을 일렬로 세우는 ependymoglial 세포의 특정 하위 집합을 나타내며 비정상적으로 긴 과정 (최대 300 μm) 및 큰 끝점 (~5 μm)37을나타낸다. 이렇게 하면 TEM 또는 FIB 메서드로 분석하는 것이 불편합니다. 여러 개의 독립적인 타니사이클을 현지화하고 분석해야 할 때 작업이 더욱 복잡해질 수 있습니다. 이 작업을 용이하게 하기 위한 접근법 중 하나는 EM에 대한 고정 및 포함전에 형광 도가가 형광 표시 샘플로부터 얻어지는 반 상관 관계 타겟팅일 수 있다. 단면은 형광 시료 및 평면 임베디드 플라스틱 복제본으로부터의 위치 정보를 결합하여 캡처된 영역에서 수행됩니다. 그 후 AT 시나리오 3을 사용할 수 있습니다: 높은 수준의 개요 모자이크 이미지가 생성되어 타니시테 엔드피트 클러스터가 있는 영역을 드러냅니다. 그 후 소프트웨어의 자동화 기능은 단일 이미지 또는 타일 모드에서 하나 또는 여러 영역에서 이미지 시퀀스 의 수집을 설정하는 데 사용됩니다. 이러한 이미지는 정렬된 스택으로 개별적으로 분석하거나 그 후에 렌더링할 수 있습니다. AT 방법의 힘은 2D에서 3D로 데이터의 비교적 쉽게 “업그레이드”를 허용합니다: 맵은 기본 획득에서 사용할 수 있으며, 볼륨은 선택한 영역과 그 주변에서 얻을 수 있습니다. 결과 스택을 정렬하고 이후에 렌더링할 수 있습니다. ROI를 찾는 데 필요한 해상도와 이미지 품질을 미리 결정하는 것이 필수적입니다. 이미징은 ROI를 인식할 수 있어야 하지만 획득 시간이 픽셀 거주 시간과 픽셀 크기의 역 사각형에 비례적으로 확장되기 때문에 이 값을 넘어서는 것은 아닙니다. 그림 1: EM 샘플 제제 및 부피 획득의 과제. (A)샘플 준비 중 고중금속 농도 및 탈수로 인해 형광 및 수축의 손실이 발생합니다. (i) LM(ii) 하에서 관찰된 표본의 회로도도는 EM을 위해 준비된 동일한 시편으로, 이는 완전히 불투명해지고 부피의 약 10%를 잃는다. (B)샘플 포함은 전형적으로 에폭시 또는 아크릴 수지를 사용하여 수행됩니다. 기존 블록(i)은 특정 방향을 필요로 하지 않는 균일한 샘플에 성공적으로 사용될 수 있습니다. 플랫 블록 (ii)은 현미경, 예를 들어, 비 균일 한 샘플 또는 상관 현미경 절차에서 단면화를 목표로 정확한 영역, 현미경에서 대상 및 방향을 하는 것이 필수적일 때 도움이됩니다. (C)전체 샘플 부피 중, 제한된 분수만이 단일 50nm 섹션에 표시되어 3D 샘플의 2D 이미지를 제공하는 데 익숙하지 않은 방향으로 자주 나타난다. (D)정밀 타겟팅 대 지나치게 대량 의 기록 문제를 설명하기 위해, 우리는 1000, 500 및 50 μm의 면을 가진 세 개의 동심 큐브를 선택하여 가상 1000 x 500 x 500 μm 샘플 (다크 적갈색)을 포함하도록 조직되었습니다. 이러한 가상의 샘플 큐브가 전체 부피를 커버하기 위해 50 nm 슬라이스로 철저하게 절제된 경우 총 20,000, 10,000 슬라이스 및 1,000 개의 슬라이스, 800 tb, 100 tb 및 100gb가 필요합니다 (이미징 해상도 5 nm x 5 nm x 50 nm x 50 m 데이터) 이는 필요한 최소 볼륨을 획득하기 위해서만 EM 데이터 수집을 계획하는 것이 중요하다는 것을 보여줍니다. (E)고해상도로 큰 시료 표면적을 커버하는 것은 대용량과 유사한 문제점을 제시한다. 여러 고해상도 이미지를 하나에 배열하는 것은 이러한 문제에 대한 유용한 솔루션입니다. 그러나 10,000x 배율의 2024 x 1048 프레임을 사용하여 1mm x 1mm 표면을 커버하려면 많은 수의 타일이 필요하며, 이는 스티치에 도전이 될 수 있습니다. 또한 절단 중에 섹션이 다양하게 압축되거나 왜곡되면 결과 데이터 스택을 정렬하는 것이 거의 불가능해집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2: 큰 지지에 섹션의 배열의 직접 생성을위한 워크플로우. (A)트림 도구를 사용하여 꽉 트리밍의 경우, 블록은 마이크로 톤 홀더 내부에 고정된다. 이 단계는 블록의 평행면을 보장하고 샘플 주위의 빈 수지도 줄이는 데 도움이 됩니다. (B)AT 섹션 취득을 위한 변형된 칼. 대형 보트는 샘플 단면 화 및 지원에 전송하는 동안 섹션과 조작의 전송을 용이하게합니다. 큰 분지는 섹션의 조작을 가능하게한다; 배수 시스템은 배수 단계에서 리본의 움직임을 제한하고, 평평한 바닥은 지지체의 점진적 건조를 안정적으로 만듭니다. (C)칼은 분지 의 바닥에 배치 된 빛 배출 웨이퍼로 단면 할 준비가되어 있으며 물은 가장자리까지 수평됩니다. 칼의 구조는 지지에 방해하지 않고 바늘을 내장 유지합니다. (D)어레이 생성, 마이크로톤 단면 영역에서 의 상단 보기. (i) 첫 번째 섹션은 일반적으로 서로 붙어 일반 리본을 형성하기 때문에 쉽게 얻을 수 있습니다. (ii) 리본에 더 많은 섹션이 추가되고 더 길어지면 리본의 안정성이 상실되고 자주 곡선이 됩니다. 이미지 수집 단계에 대비하여 시퀀스 트랙을 순서대로 순서대로 정리하는 것이 중요합니다. (iii) 섹션리본이 원하는 길이에 도달하면 속눈썹을 사용하여 칼 가장자리에서 조심스럽게 분리됩니다. (iv) 물은 분지에서 배수된다; 웨이퍼는 완전히 공기가 건조 할 때까지 내부에 남아 있습니다. 이 단계는 섹션을 곧게 펴고 마이크로 폴드의 형성을 피하는 데 도움이되기 때문에 필수적입니다. 웨이퍼는 60°C의 오븐에 30분 이상 오븐에 배치되어 지지편을 부착합니다. (E)전송된 섹션의 예제 웨이퍼. 직선적이고 정확한 리본을 얻는 것이 편리하지만 실제 샘플은 대부분의 경우 이러한 이상적인 리본의 형성을 방지합니다. 그럼에도 불구하고, “조잡한”리본조차도 방대한 경우에 매우 유익하며, “깔끔한”리본의 중요성은 섹션이 수집되는 연구 전략에 달려 있습니다. 배율 막대 1cm.(F)일련 섹션이 있는 예제 슬롯 그리드. 하나의 그리드에서 많은 섹션이 수집되는 경우에도 단일 웨이퍼에서 수집할 수 있는 부분중 극히 일부에 불과합니다. 그리드(특히 슬롯 그리드)에서 섹션의 전달을 마스터하는 데 필요한 기술은 전자 현미경 샘플 준비를 마스터하는 데 상당한 병목 현상을 나타냈다. 스케일 바 500 μm.(G)어떤 섹션 수집 방법이 사용되든 AT 접근 방식의 강점은 온 그리드 컬렉션에 비해 순차적 섹션의 생성의 상대적 용이성입니다. 1000 μm x 500 μm 샘플 블록을 고려하는 경우 2cm x 4cm 웨이퍼 (i)에 약 100 개의 섹션에 맞는 것은 문제가 없습니다. 슬롯 그리드의 동일한 크기 섹션은 최대(ii)의 세 섹션/그리드에만 맞습니다. 그리드에서 직렬 섹션을 수집하는 데 어려움을 언급하지 않고 동일한 수의 섹션을 커버하는 데 필요한 그리드 수를 표시하는 확장된 이미지를 제공합니다. 배율 막대 = 1cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3: 배열 단층 촬영 워크플로의 중요한 단계입니다. 고해상도 이미지 스택의 무인 획득을 위한 워크플로의 회로도. 모든 준비 단계는 자동화되어 있으며(녹색 기어 기호)이며 섹션별로 수동으로 수행할 작업이 필요하지 않습니다. 이미지 스택은 자동 강성 또는 상체 정렬이 가능한 모든 이미지 분석 소프트웨어에 정렬할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 4: 드로소필라 성인 용기를 데모 모델로 삼는 시나리오. (A)전방, 중간 및 후방의 3개의 주요 지역이 서로 다른 색상으로 지정된 해부 된 드로소필라 미드구트의 그림. (B)직감이 횡방향 단면에 지향되는 플랫 블록을 다듬어 놓습니다. 빈 수지 량은 관심 영역(흰색 사각형)을 포함하는 조직 주위에 신중하게 균형을 잡습니다. (C)가로 직렬 섹션은 AT 칼의 분지 내부의 수면에 떠 있다. 모든 이미지는 역 대비를 가진 거울 검출기를 사용하여 보조 전자 SEM 모드에서 획득되었습니다. (D)웨이퍼에 횡연 직렬 섹션의 스티치 모자이크 이미지. 스케일 바는 1000 μm입니다.(E) 드로소필라 내장을 통해 단면. 스케일 바 20 μm. 이미지는 7 x 7 미드 레인지 이미지의 스티치 모자이크입니다. Inset – 관심있는 특정 영역의 높은 배율 및 해상도 이미지 : (ii) 핵, (iii) 브러시 테두리 및 (i) 미토콘드리아. 모두를 위한 배율 막대 5 μm. (F)발달 세포(square)의 위치를 목표로 하는 내장을 통해 횡방향 단면의 중간 범위 이미지. 스케일 바는 20 μm.(G)패널 F. Scale bar에 존재하는 섹션의 분석 중에 국소화된 영역에 기초하여 수집된 직렬 섹션의 표적 배열은 10 μm입니다.(H)3D 모델은 패널 G에서 표적 직렬 획득으로부터 얻은 50개의 섹션 스택 서열을 기반으로 렌더링된다. 그림 5: AT 적용 시나리오에 대한 사례 연구. (A)장 가구형내의 상이한 세포 구조의 국소화. (i) 임베디드 실리콘 마이크로칩. 스케일 바 = 200 μm. (ii) 칩의 중앙 부분을 통해 127 개의 단면의 스티치 모자이크 이미지. 스케일 바 = 1500 μm (iii) 장 오르가노이드의 일부를 통해 전체 횡방향 섹션의 4개의 저해상도 이미지. 화살표는 관심의 잠재적 인 사이트를 가리킵니다. 스케일 바는 20 μm. (iv) 다른 ROI이며, 추가 분석을 위해 선택된 저해상도 현미경 그래프를 대상으로 합니다. 스케일 바 = 10 μm. (v) 관심있는 감염된 세포의 고해상도 이미지. 인접한 섹션에서 동일한 영역을 분석하면 필요한 경우 대상 3D 정보를 제공할 수 있습니다. 스케일 바 = 5 μm.(B) 드로소필라 멜라노가스터 푸팔 노텀의 미드바디 국소화. (i) 해부된 드로소필라 푸파의 회로도. 노텀은 보호 큐티클(brown)의 일부를 제거한 후 해부(베이지)에 노출되었다. 검은색 선은 단면(ii) 다이어그램에 제시된 영역을 통과하는 단면의 방향을 지정합니다. 이 이미지는 3×7을 순차적으로 촬영한 고해상도 SEM 이미지를 하나의 모자이크 패널에 결합합니다. 검은색 사각형은 분할 셀이 포함된 영역을 해제합니다. 스케일 바는 15 μm. (iii) 패널 ii로부터 분할 셀의 확대 된 이미지입니다. 이 배율 및 해상도에서 중간체는 분명합니다 (흰색 화살표). 전체 단면은 분할 세포를 찾기 위해 분석된다. 측면 스크리닝 단계 동안 20-30 섹션 간격에서 섹션의 다른 리본 사이를 뛰어 오르는 것은 수많은 분할 세포 쌍을 국소화하는 스토를 허용합니다. 스케일 바는 5 μm(iv)으로 분할 셀이 국소화될 때, 패널(iii)의 노란색 사각형에 의해 분리된 중간체 주변의 4개 섹션에서 수집된 중간체의 순차적 이미지이다. 스케일 바는 마우스 시상 하부에서 1 μm.(C)타니사이클 엔드피트 국소화이다. (i) 진동 슬라이스의 형광 이미지. 타니사이클은 tdTomato 형광 단백질(빨간색)을 표현합니다. 흰색 사각형은 관심 영역을 구분합니다. 규모 막대 500 μm. (ii) EM을 위해 준비된 동일한 진동 섹션은 패널(i)으로부터 형광 정보의 간접 상관관계에 기초하여 관심 영역 을 중심으로 신중하게 손질된다. 점선 흰색 선은 초박형 단면 영역을 나타냅니다. 스케일 바는 두 패널 모두에 대해 50 μm입니다. (iii) 관심 영역에서 진동 조각을 통해 단면. SEM 모자이크 이미지는 75개의 스티치 이미지로 구성됩니다. 여러 섹션은 측면 스크리닝을 대상으로 하며 유사한 매개 변수로 이미지됩니다. 단면도 종발 – 섹션은 ROI를 찾기 위해 “오프라인”으로 분석됩니다. 검은색 사각형은 타니시테 끝발을 포함하는 영역을 나타냅니다. 이 섹션은 추가 분석을 위한 앵커 역할을 합니다. 스케일 바는 혈관을 둘러싼 타니시테 엔드피트의 고해상도, 고해상도, 고배율 이미지입니다. 한 섹션에서 ROI의 초기 지역화 후, z-시퀀스는 인접한 섹션에서 앵커 섹션(panel iii)까지 상류로 수집된다. 배율 막대 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 6: 초미세 절제술, 단면 수집 및 단면 저장 중 문제가 유물로 이어질 수 있습니다. 빈 수지의 대부분은 조직에서 분리하고 그 자체로 접혀 (세피아). 대선 된 블랙 박스는 전체 섹션을 포함하는 데 사용되는 영역을 지정합니다. 스케일 바 500 μm.(B)50nm 두께의 제브라피시 섹션의 표면에 작고 로컬 접힌다. 70nm 마우스 뇌 섹션의 표면에 비늘 바 1 μm.(C)칼 자국. 스케일 바 5 μm.(D)부분적으로 제브라피시 근육 섹션을 커버 웨이퍼의 표면에 머리카락 (별표). 노란색에서 조직은 분석을 대상으로합니다. 분홍색에서, 영향을받는 영역의 크기에 대한 참조 역할을하는 데 사용되는 세포. 스케일 바 50 μm.(E)얼룩말 피쉬 노토코드 오른쪽 아래 (검은 화살표)에 주름, 여기서 조밀 한 신경 조직 (파란색으로 그림자) 부드러운 근육 조직과 빈 수지 (검은 화살표)에 테두리. 스케일 바 10 μm.(F)E와 같이 50개의 이미지 스택의 볼륨 세분화는 이 영역이 대부분의 섹션에서 주름을 보였다는 것을 보여준다. 대시 다각형은 G. 스케일 바 10μm(G)XY 뷰가 F와 동일한 부피 세분화에 표시된 영역을 윤곽을 드러내며, 블록의 오른쪽 절반에 짧은 검은 색 스트로크로 주름을 나타낸다. 조직의 나머지 부분에 있는 스택의 정렬은 주름에 의해 영향을 받지 않습니다. G와 동일한 영역의 5 μm.(H)XZ 투영을 배율 막대 50개 섹션 모두에 주름을 나타낸다. 배율 막대 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 보조 영화 1: 드로소필라 전방 미드구트를 통과하는 단면의 고해상도 몽타주 이미지. 반전된 SE-MD SEM 이미지의 모자이크 이미지입니다. 352개의 별도의 이미지 타일은 자동으로 5nm 해상도로 획득되어 전체 단면을 제시하기 위해 스티치되었습니다. 동일한 이미지를 사용하여 자세한 내용을 확대하고 데이터의 철저한 커버리지를 얻을 수 있습니다. 좁은 접합, 마이크로튜부리, 다양한 유형의 소포는 확대할 때 가능합니다. 스케일 바는 10 μm입니다. 보조 영화 2: 드로소필라 내장 세포 렌더링. 장 세포를 나누는 영역에서 섹션의 50 개의 정렬 된 모자이크 이미지. 세포 테두리(파란색, 청록색 및 주황색) 및 핵(흰색)의 IMOD 렌더링. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 재료. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.