Aedes aegypti 모기에서 동물 유래 혈액 및 인공 식사 먹이주기 및 정량화

혈액 공급 절차는 살아있는 동물 또는 인간 호스트를 사용하여 수행되지 않았고 록펠러 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 및 기관 검토 위원회 (IRB)에 의해 설정 된 지침을 준수했다. 1. 식사 준비 충고 자극제의 준비, 아데노신 5′트리호스페이트 수성 NaHCO3 (분자량, MW = 84.006 g/ mol)의 25 mM 솔루션을 준비하십시오. 25m MM NaHCO3의100mL의 경우, 210 mg의 NaHCO3을 체적 플라스크에 넣고 이중 증류수(ddH2O)를 총 100mL에 채웁니다. 마그네틱 스터드 바를 사용하여 모든 NaHCO3이 용해될 때까지 용액을 철저히 혼합합니다. 수성 25m M M NaHCO3에서 ATP 디나트륨 염 수화물(MW = 551.14 g/mol)을 200mM ATP의 최종 농도로 재구성한다. 총 부피 10mL 의 200 mM ATP 25 mM NaHCO3 버퍼의 경우, 1.1 g의 ATP 디나트륨 염수염을 체적 플라스크에 넣고 총 부피 10mL에 25m M NaHCO3 버퍼로 채웁니다. 마그네틱 스터드 바를 사용하여 모든 ATP가 용해될 때까지 용액을 철저히 혼합합니다.참고: ATP의 가수분해를 최소화하려면 NaHCO3과같은 염용액에 의해 버퍼링되어야 합니다. ATP 용액을 알리쿼트하고 -20 °C에 저장합니다.참고: ATP의 이 스톡 솔루션은 일반적으로 6개월마다 신선하게 만들어지며 아래에 설명된 모든 식사에 사용됩니다. 저하를 방지하기 위해 ATP 알리쿼트는 여러 번의 동결 해동 주기를 거치거나 다른 식사 구성 요소와 함께 가열해서는 안됩니다. 형광 추적제 용액, 형광액의 준비 수성 형광액의 2 % (w / v) 재고 용액을 준비하십시오. 총 스톡 용액 부피 10mL의 경우, 실온에서 알루미늄 호일로 감싼 15mL 원뿔튜브에 10mL의 ddH 2 O와 형광디나트륨 소금0.2g을섞는다. 형광체의 이 주식 용액은 아래에 설명된 모든 식사에서 희석에 사용될 수 있습니다.참고: 형광은 빛에 민감하기 때문에 알루미늄 호일에 용기를 래핑하여 빛에 노출되지 마십시오. 동물 유래 혈액 식사 준비 모든 모기를 먹이는 데 필요한 식사 수를 계산합니다. 각 글리튜브는 2mL 식사를 하고 약 25마리의 모기를 먹이고 있습니다. 형광 측정값에 대한 표준 곡선을 보정하기 위해 한 끼 를 추가로 준비합니다. 달리 명시되지 않는 한, 이 섹션의 모든 단계는 최종 2mL의 한 끼를 준비하는 데 필요한 시약 금액을 설명합니다. 동물 유래 혈액 식사의 경우 1.98-2 mL의 양피를 15mL 원뿔 관으로 옮기십시오(원하는 혈액 부피의 경우 3.3단계 참조).참고: 양, 기니피그 및 인간을 포함한 상업적으로 무시된 척추혈액공급원은13마리를사용할 수 있다. 사용하기 전에 구입 한 혈액이 만료 날짜를 통과하지 않았는지 확인하고 병을 반전시켜 잘 섞는지 확인하십시오. 최적의 수유를 위해 양피가 수조에서 45°C로 따뜻해진 후 ATP를 1-2mM의 최종 농도에 추가하십시오. 1mM ATP의 최종 농도를 위해 200m ATP 스톡 용액의 10 μL을 1.99mL에 미리 데워진 혈액과 혼합에 추가합니다. 최종 농도 2m ATP의 경우 200m ATP 스톡의 20 μL을 1.98mL에 미리 데워진 혈액과 혼합을 추가합니다. ATP를 첨가하지 않으면, 2mL의 양피를 따뜻하게 한다. 식용 크기의 형광계 정량화가 이후에 수행될 경우, 최종 농도0.002%(2μL의 2μL 의 2μL 총 식사량)에 형광액용액을 첨가한다. 추가된 형광체와 동일한 양으로 혈액의 양을 감소시면 됩니다. 기준 표준 곡선을 생성하기 위해 0.002% 형광을 함유한 최종 식사 제형의 1mL을 유지한다. 유지 된 볼륨을 모기에 전달 되는 식사와 동일 하 게 치료; 실험 기간 동안 동일한 빛과 온도 조건에 노출시키고 전달된 식사와 함께 이를 동결합니다. 인공 혈액 식사 준비 모든 모기를 먹이는 데 필요한 식사 수를 계산합니다. 각 글리튜브는 2mL 식사를 하고 약 25마리의 모기를 먹이고 있습니다. 형광 측정값에 대한 표준 곡선을 보정하기 위해 한 끼 를 추가로 준비합니다. 달리 명시되지 않는 한, 이 섹션의 모든 단계는 1개의 2mL 식사를 준비하는 데 필요한 시약 양을 설명합니다. 표 1과같이 인공 혈액(코간(1990년)22개에서적응하여 먼저 400m MM NaHCO 3의 스톡 용액을만듭니다. 총 10mL의 400mM MM NaHCO3(MW = 84.006 g/mol)의 총 부피의 경우, 336 mg의 NaHCO3을 체적 플라스크에 넣고 이중 증류수(ddH2O)로 채워 총 10mL의 부피로 채웁니다. 마그네틱 스터드 바를 사용하여 모든 NaHCO3이 용해될 때까지 용액을 철저히 혼합합니다. 인공 혈액의 단백질 성분의 경우, 400m MM NaHCO3,ddH2O의 헤모글로빈 35 mg/mL, ddH2O. Protein 스톡 솔루션의 300 mg/mL에서 최대 2개월 동안 저장할 수 있는 γ 50 mg/mL의 스톡 솔루션을 준비합니다. 인공 혈액에서 총 인간 단백질의 최종 농도는 125 mg/mL입니다. 여기에는 15 mg/mL γ-글로불린, 8 mg/mL 헤모글로빈 및 102 mg/mL 알부민의 최종 농도가 포함됩니다. 각 2mL 식사에 대해, γ 글로불린600 μL, 헤모글로빈 460 μL, 알부민 680 μL, 표 1에나열된 재고 용액에서 ddH2O의 250 μL을 결합한다. 식사가 45 °C로 따뜻해질 때까지 200 m ATP 스톡 솔루션의 10 μL을 추가 하십시오. 식용 크기의 형광계 정량화가 이후에 수행될 경우, 최종 농도0.002%(2μL의 2μL 의 2μL 총 식사량)에 형광액용액을 첨가한다. ddH2O의부피를 4.4 단계에서 형광체첨가와 동일한 양으로 감소시다. 기준 표준 곡선을 생성하기 위해 0.002% 형광을 함유한 최종 식사 제제의 최소 1mL를 유지한다. 유지 된 볼륨을 모기에 전달 되는 식사와 동일 하 게 치료; 실험 기간 동안 동일한 빛과 온도 조건에 노출시키고 전달된 식사와 함께 이를 동결합니다. 예의 단백질없는 식염수 식사 준비 (듀발 등에서 적응) (2019)7)참고: 단백질이 없는 식염수 식사는7,27,32로여러 가지 방법으로 제조할 수 있다. 여기에 제시 된 식염수 식사는 위에서 설명 한 인공 혈액 조리법의 단백질이없는 버전입니다. 모든 모기를 먹이는 데 필요한 식사 수를 계산합니다. 각 Glytube는 2mL 식사를 보유하고 있으며 약 25마리의 모기에게 1개의 추가 식사를 공급하여 형광 측정을 위한 표준 곡선을 보정합니다. 달리 명시되지 않는 한, 이 섹션의 모든 단계는 1개의 2mL 식사를 준비하는 데 필요한 시약 양을 설명합니다. 식염수 식사를 준비하려면 400 mM NaHCO3의재고 용액을 만듭니다. 총 10mL의 400mM MM NaHCO3(MW = 84.006 g/mol)의 총 부피의 경우, 336 mg의 NaHCO3을 볼륨 플라스크에 넣고 총 10mL의 총 부피인 ddH2O로 채웁니다. 마그네틱 스터드 바를 사용하여 모든 NaHCO3이 용해될 때까지 용액을 철저히 혼합합니다. 2mL 식사당 400mM MM NaHCO3의 15mL 원문 튜브 600 μL에 ddH2O.의 1.39mL을 결합하여 식사 후 수조에서 45°C로 따뜻해질 때까지 200m ATP 스톡 솔루션의 10μL을 추가하십시오. 식용 크기의 형광계 정량화가 이후에 수행될 경우, 최종 농도0.002%(2μL의 2μL의 총 식수량 2mL)에 형광용액을 첨가한다. ddH2O의부피를 5.3 단계에서 형광체첨가와 동일한 양으로 감소시다. 기준 표준 곡선을 생성하기 위해 0.002% 형광을 함유한 최종 식사 제제의 최소 1mL를 유지한다. 유지 된 볼륨을 모기에 전달 되는 식사와 동일 하 게 치료; 실험 기간 동안 동일한 빛과 온도 조건에 노출시키고 전달된 식사와 함께 이를 동결합니다. 2. 모기에 식사 배달 수유를 위한 모기 용기 설치참고: 모기는 다음과 같은 기준을 충족하는 한 다양한 용기에서 공급될 수 있습니다. 용기가 모기가 날아다니기에 충분히 크지만 너무 크지 않아 모기가 메쉬 표면을 찾고 먹이를 주기 가 어렵습니다. 컨테이너를 덮는 데 사용되는 메쉬는 재료와 구멍 크기가 다를 수 있습니다. 구멍은 여성 모기의 스타일이 관통할 만큼 충분히 커야 하지만 모기가 탈출할 수 있는 것은 그리 크지 않습니다. 메쉬가 팽팽하게 유지되도록 단단히 고정하고 글리튜브는 먹이 주기 동안 표면에 안정적으로 휴식을 취할 수 있습니다. 예시용기(도 1)는수정된 946mL(32온스) 고밀도 폴리에틸렌(HDPE) 플라스틱 버킷이다. 이 설정을 복제하려면 면도날을 사용하여 버킷 뚜껑에서 직경 ~10cm의 중앙 구멍을 잘라냅니다. 모기에 의한 직업용 용기를 조립하려면 양동이 위에 0.8mm 폴리에스테르 모기 그물을 넣고 ~ 400cm2 평방 피스를 고정하여 천공 된 뚜껑을 단단히 밀어 단단히 스냅하십시오. 적어도 3 일 이상 인 여성 모기를 수집하여 혈액 공급에 충분히 성숙하도록 하십시오. 최적의 급식율은 7일33일후에 관찰된다. 여성 모기를 용기에 넣고 메쉬로 덮습니다. 용기가 모기로 채워지면 사용되는 글리튜브 의 수를 늘립니다. 최적의 수유는 ~25 마리의 모기 / 글리튜브로 달성됩니다. 이것은 먹이 막에 접근을 위한 경쟁을 감소시킵니다. 식사를 제공하지 않는 먹이없는 모기의 대조군을 따로 두십시오. 체중 측정 프로토콜에서, 별도로 공급되지 않은 그룹을 무게와 식사에 공급 실험 그룹에서 체중 증가를 추정하기 위해이 무게를 사용합니다. 형광 기반 정량화 프로토콜에서 표준 곡선 계산 및 음의 제어를 위해 유정에 공급되지 않은 모기 그룹을 추가합니다. 실험 군의 기준선 모기 조직 자동 형광과 일치하려면 표준 곡선 및 음성 제어 우물에 공급되지 않은 모기가 포함되어 있는지 확인하십시오. 글리튜브 구축 및 설정 (코스타 다 실바 등에서 적응) (2013)20) 도 1에묘사된 바와 같이, 열원을 생성하기 위해, 100% 글리세롤의 40mL로 50mL 원전관을 채우십시오. 5cm × 5cm 의 파라필름으로 열린 원문 튜브를 밀봉하고 5cm × 5cm 파라필름으로 반복하여 누출 가능성을 최소화합니다. 선택적으로, 파라필름은 고무 밴드를 사용하여 제자리에 고정될 수 있다. 튜브를 뒤집어 구멍이나 틈새가 없는지 확인합니다. 식사 배달 장치를 만들려면 날카로운 면도날을 사용하여 원적 튜브의 나사 캡에 직경 2.5cm의 중앙 구멍을 잘라 내거나, 더 나은 일관성을 위해 선반을 만듭니다. 5cm × 5cm의 파라필름을 고르게 펴서 크기가 두 배가 됩니다. 파라필름은 모기가 쉽게 관통할 수 있을 만큼 얇아야 하지만 누출은 없어야 합니다. 나사 캡의 바깥쪽 표면에 밀봉하여 구멍을 완전히 덮고 캡을 옆으로 놓습니다.참고: 패럴림픽을 스트레칭하기 전에 글리튜브에 대한 매력을 높이기 위해 화장품이 적용되지 않은 인간의 피부 패치에 부드럽게 문지르며 구멍이 만들어지지 않는 것을 주의하여 인간의 냄새로 향수를 피하십시오. 실험이 모기가 식사에 접근하는 데 필요한 감각 단서를 조사하기위한 것이 아니라면 권장됩니다. 글리세롤의 밀봉 된 튜브와 식사 (ATP를 제외한 모든 구성 요소 포함)를 42-45 °C 수조에서 적어도 15 분 동안 가열합니다. ATP를 예열하지 마십시오. 실험을 시작하기 직전에 추가합니다. 따뜻하게 데운 식사와 소용돌이에 ATP를 철저히 넣습니다. 파이펫 2 mL의 따뜻한 식사는 나사 캡의 내부 챔버에 넣고 반전되고 따뜻하며 글리세롤이 채워진 50 mL 원추형 튜브를 부드럽게 배치합니다. 식사와 함께 뚜껑을 글리세롤이 채워진 튜브에 부분적으로 나사로 끼워 서 식사 나 글리세롤의 누출을 방지 할 수 있습니다.참고: 사용되는 식사 량은 1mL에서 2.5mL 사이일 수 있습니다. 식사가 부족하거나 비싼 화합물을 제공하는 데 사용될 때 더 적은 볼륨이 특히 유용 할 수 있습니다. 식사가 주변 온도로 식히지 않고 최대 급수의 가능성을 감소시키지 않도록이 단계에서 신속하게 작업하는 것이 중요합니다. 냉각 속도는 이러한 단계가 수행되는 실내의 주변 온도에 따라 다르지만 일반적으로 25 °C에서 5 분 이내에 완료해야합니다. 조립된 글리튜브를 모기 용기 위에 놓고 모기가 최대 급식률을 달성하기 위해 최소 15분 동안 먹이를 먹을 수 있도록 합니다. 최적의 수유를 위해 CO2 패드가 장착된 챔버 내부에 모기 용기를 놓고 식사 전에 25-28°C 및 70-80% 습도에서 최소 15분 이상의 적응을 허용하십시오. 여기에 사용되는 분석 챔버는 이전에 게시 된 설정(16)의간단하고 저렴한 비용 수정이다. 36cm L × 31cm W × 32cm H의 반투명 폴리프로필렌 수납 박스를 탈착식 뚜껑을 사용합니다. 챔버 벽에 만들어진 직경 1.5cm의 구멍은 실리콘 튜브를 통해 CO2 전달을 허용합니다. CO2 확산 패드는 정제된 공기및CO2의 전달을 위해 뚜껑의 내부 중앙에 부착되어 시험 기간 동안 챔버 분위기를 조절한다.참고: 모기가 멤브레인 피더에 끌리도록 호스트 큐(열 및 CO2,선택적 숙주 냄새16)가있는지 확인하십시오. 글리튜브 아래에 모기가 몰려들지 않는 경우 CO2가 제대로 전달되고 식사와 글리튜브가 충분히 따뜻하다는 것을 확인하십시오. 외부 CO2 소스를 사용할 수없는 경우, CO2는 숨을 내쉬는 인간의 호흡의 퍼프를 통해 전달 될 수있다. 먹이를 얻은 후 글리튜브 캡은 생체 위험 폐기물로 폐기하거나 낮은 비율의 표백제 용액에 담그고 물에 완전히 헹구면 재사용할 수 있습니다. 3. 소비된 식사의 정량화 추가 실험에 사용할 모기 의 계량참고: 모기를 계량하여 식사 크기를 정량화하면 더 생생한 실험을 위해 사용할 수 있지만이 방법은 5 마리의 모기 그룹에서 체중 측정을 받아야합니다. 개별 모기의 무게는 대부분의 실험실 균형을 사용하여 정확하게 측정하기 어렵기 때문에, 개별 식사 크기의 가변성은 무게를 측정하여 쉽게 정량화 될 수 없습니다. 계량은 여성이 눈에 띄게 식사에 engorge 하는 상황에서만 권장 됩니다. 차가운 마취는 용기를 4°C 의 차가운 방으로 옮기거나 얼음 위에 놓아 모기를 마취시합니다. 공급되지 않은 코호트 (즉, 식사를 제공하지 않은 모기)에서 5 명의 여성의 그룹을 계량하고 “사전 먹이”체중의 추정치로 평균 체중을 계산합니다. 미혼 모기의 평균 무게는 유전자형, 성별 및 양육 조건에 달려 있습니다. 자당에 대한 광고 리비툼 액세스로 사육 된 여성 Ae. aegypti 모기는 일반적으로 약 2 mg의 무게를 달았다. 실험 코호트(즉, 식사를 제공한 모기)에서 여성은 눈으로 관찰할 수 있는 복부 팽팽을 기반으로 “먹이기”와 “먹이지 않는” 더미로분류한다. 각각의 “먹이”와 “먹이지 않는” 더미를 각각 5마리의 모기 그룹으로 나누어 계량합니다. 5의 각 단 내의 모기는 그룹 체중 측정을 취하기위한 동일한 실험 코호트에서 파생되어야한다. 실험 군의 각 “먹이”와 “먹이지 않음” 더미에서 여성당 평균 중량을 계산합니다. 엔드포인트 분석을 위한 형광 측정7,27,34참고: 더 이상 살아있는 실험을 위해 더 이상 필요하지 않은 개별 모기로부터 정확한 식사 크기 측정을 얻으려면, 모기와 0.002% 형광을 함유한 나머지 1mL의 식사를 먹이 직후 -20°C에 보관하십시오. 실험은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 이 메서드는 그림 2.기준 표준 곡선을 생성하려면, 모기의 실험 그룹에 제공된 0.002% 형광체를 포함하는 동일한 식사의 직렬 희석을 준비한다. 총 8개의 표준 곡선 솔루션이 있을 것입니다. 이러한 각 솔루션에서 0.002% 형광을 함유한 최종 식사량은 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125, 0.15625, 0.078125 또는 0 μL, 각각 100 μL(예:, 5 μL)의 총 부피에 대해 1x 인산염 완충식식염(PBS)에 있을 것이다(예: 0.002%의 PBL). 표준 곡선의 첫 번째 용액을 만들기 위해 0.002% 형광을 함유한 50μL을 1x PBS의 950 μL에 950 μL에 추가하고 소용돌이를 철저히 추가하십시오(최종 부피: 1x PBS의 95 μL에서 0.002% 형광을 함유한 식사5 μL). 표준 곡선 용액의 나머지 부분을 만들기 위해 이전 튜브에서 500 μL을 복용하고 1x PBS의 500 μL을 포함하는 새로운 튜브에 추가하여 각 단계에 대해 2 배 희석을 수행합니다. 다음 2 배 희석을 준비하기 전에 소용돌이. 기준 표준 곡선을 생성하는 데 사용되는 웰을 준비하기 위해 각 표준 곡선 솔루션의 파이펫 100 μL을 96웰 PCR 플레이트의 첫 번째 열에 있는 8개의 우물에 각각 들어올 수 있습니다. 플레이트의 첫 번째 열에 동일한 8 개의 우물 각각에 1 개의 미공급 제어 모기를 추가합니다. 복제 측정을 위해 플레이트의 두 번째 열에서 반복합니다.참고: 실험 그룹이 서로 다른 식사 유형을 제공하는 경우 각 식사 유형에 대해 별도의 기준 표준 곡선을 준비해야 합니다. 남은 1x PBS 100 μL을 추가하여 미공급 제어 및 실험 그룹을 위해 잘 남아 있습니다. 비드 밀 균질화 또는 소용돌이를 사용하여 후속 단계에서 조직이 중단되는 경우, 각 우물에 1 3mm borosilicate 고체 유리 구슬을 추가합니다. 음의 대조군으로서, 접시의 다음 2개의 열에 있는 각 우물에 1개의 미공급 모기를 추가합니다. 이 그룹에서 측정된 형광은 조직 자동 형광을 설명하기 위해 기준선 차단을 설정하고 식사에 공급된 실험 군에서 모기가 있는지 여부를 결정하는 데 사용될 것입니다. 식사를 제공 한 실험 그룹에서 나머지 우물에 잘 당 1 모기를 추가합니다. 플레이트를 조심스럽게 밀봉하고 수동 연삭으로 조직을 방해합니다. 복부는 철저하게 균질화하여 식사를 풀어주어야합니다. 조직을 방해하는 방법에는 3mm borosilicate 고체 유리 구슬 (30 초 동안 30 Hz) 구슬을 사용하는 구슬 밀 균질화증, 3mm borosilicate 고체 유리 구슬, 또는 구슬이없는 유봉 분쇄기를 포함하는 방법이 포함됩니다. 2000 rpm에서 1-2 분 동안 플레이트를 원심 분리하여 lysate를 수집합니다. 각 우물에 1x PBS180 μL로 검은색 96웰 플레이트를 준비합니다. 1x PBS의 180 μL로 각각 의 20 μL을 각각 잘 옮기고 혼합합니다. 사용 가능한 경우 이 단계에서 다중 채널 파이펫을 사용하여 속도와 일관성을 향상시킵니다. 485/520 여기/방출 채널의 플레이트 리더를 사용하여 각 우물의 형광 강도를 측정합니다. 해당 형광 강도 측정에 대해 알려진 양의 식사량을 플로팅하여 기준 표준 곡선을 생성합니다. 생성된 기준 표준 곡선을 사용하여 각 실험군 모기에 의해 섭취되는 식사 량을 추정한다. 각 실험군 개인의 형광 강도 판독에서 미혼 모기의 음성 대조군의 평균 형광 강도 판독을 빼서 기준선 조직 자동 형광을 교정한다.