التحليل الطيفي للارتباط الفلوري للتباين الموضعي لتحليل الانتشار الجزيئي في الغشاء البلازمي للخلايا الحية
Summary
تهدف هذه المقالة إلى تقديم بروتوكول حول كيفية بناء مجهر التحليل الطيفي للارتباط الفلوري (svFCS) لقياس الانتشار الجزيئي في الغشاء البلازمي للخلايا الحية.
Abstract
تحدث العمليات البيولوجية الديناميكية في الخلايا الحية ، بما في ذلك تلك المرتبطة بتنظيم غشاء البلازما ، على نطاقات مكانية وزمنية مختلفة ، تتراوح من نانومتر إلى ميكرومتر وميكروثانية إلى دقائق ، على التوالي. مثل هذه المجموعة الواسعة من العمليات البيولوجية تتحدى نهج الفحص المجهري التقليدية. هنا ، نفصل الإجراء الخاص بتنفيذ قياسات التحليل الطيفي لارتباط التألق الموضعي (svFCS) باستخدام مجهر فلوري كلاسيكي تم تخصيصه. يتضمن البروتوكول فحصا محددا لأداء إعداد svFCS والمبادئ التوجيهية لقياسات الانتشار الجزيئي بواسطة svFCS على الغشاء البلازمي للخلايا الحية في ظل الظروف الفسيولوجية. بالإضافة إلى ذلك ، نحن نقدم إجراء لتعطيل المجالات النانوية لطوف غشاء البلازما عن طريق علاج أوكسيديز الكوليسترول ونوضح كيف يمكن الكشف عن هذه التغييرات في التنظيم الجانبي لغشاء البلازما من خلال تحليل svFCS. في الختام ، يمكن لهذه الطريقة القائمة على التألق أن توفر تفاصيل غير مسبوقة حول التنظيم الجانبي لغشاء البلازما بدقة مكانية وزمنية مناسبة.
Introduction
تعقيد تنظيم غشاء البلازما
يجب أن يأخذ الفهم الحالي لتنظيم غشاء الخلية في الاعتبار عدة جوانب1. أولا ، يختلف تكوين الدهون المعقدة ليس فقط بين أنواع الخلايا ، ولكن أيضا داخل خلية واحدة (عضيات الغشاء / غشاء البلازما). إلى جانب ذلك ، يتم تنظيم بروتينات الغشاء المرتبطة أو الجوهرية في الغالب في مجمعات ديناميكية متعددة الوسائط ، مع نطاقات كبيرة تمتد خارج الغشاء ، وهو ما يمثل مساحة أكبر بكثير من تلك الموجودة في المجالات عبر الغشاء وحدها. علاوة على ذلك ، تظهر البروتينات المرتبطة بالأغشية قدرات محددة على ربط الدهون أو تفاعل الدهون تلعب أدوارا في تنظيم وظيفة البروتين. هذه تعتمد بشكل مباشر على التركيب المحلي وإمكانية الوصول إلى الدهون2.
أخيرا ، لوحظ وجود مستوى كبير من عدم التماثل بين منشورين غشائيين بسبب البنية غير المتماثلة الجوهرية لبروتينات الغشاء وتوزيع الدهون. في الواقع ، فإن التوازن الأيضي للدهون بين التوليف والتحلل المائي ، جنبا إلى جنب مع الوجه الدهني بين المنشورات ، يولد مثل هذا التوزيع غير المتماثل. نظرا لأن أي نقل عبر الطبقة الثنائية مقيد بالطاقة الحرة اللازمة لتحريك مجموعة الرأس القطبية عبر الجزء الداخلي الكارهة للماء من الأغشية ، فإنه عادة ما يتم مساعدته بواسطة ناقلات انتقائية. لكل نوع من أنواع الخلايا ، يميل عدم التماثل إلى الحفاظ عليه بقوة. إجمالا ، تساهم هذه العوامل في عدم التجانس الجانبي أو تجزئة غشاء البلازما 3,4.
نحن نثري هذا التمثيل لغشاء البلازما من خلال مراعاة الانتشار الجزيئي الجوهري داخل الطبقة الثنائية وعبرها ، مما يساهم في عدم التجانس الجانبي الديناميكي على مقياس من أعشار إلى مئات النانومترات وميكروثانية إلى ثوان. على سبيل المثال ، تساهم المجالات النانوية الغشائية المعتمدة على الدهون – ما يسمى طوافات الدهون ، التي تعرف بأنها الكوليسترول ، ومنصات الإشارات الغنية بالدهون السفينغولية – في تجزئة غشاء البلازما 5,6. ومع ذلك ، فإن وجهة النظر الحالية لتنظيم الأغشية لا تقتصر على طوافات الدهون وحدها. المجالات النانوية الغشائية أكثر تعقيدا وغير متجانسة في التركيب والأصل والوظيفة. ومع ذلك ، يجب تنسيق وجودها في غشاء البلازما بإحكام ، ويبدو أن التفاعلات الديناميكية بين البروتينات والدهون مهمة في التوزيع المكاني والتعديل الكيميائي للمجالات النانوية الغشائية1،3،7،8.
مبدأ svFCS وتطبيقه للتحقيق في تنظيم غشاء البلازما
وعلى الرغم من إحراز تقدم كبير في تحليل مجالات الأغشية، وذلك أساسا من خلال التقنيات البيوفيزيائية، فإن المحددات التي تملي التنظيم المحلي للغشاء البلازمي تحتاج إلى تنقيح بدقة مكانية وزمنية مناسبة. توفر المحددات القائمة على تتبع الجزيئات الفردية دقة مكانية ممتازة وتسمح بتوصيف أوضاع مختلفة من الحركة9،10،11،12 ، ولكن لها دقة زمنية محدودة مع معدلات إطارات الكاميرا المنخفضة الكلاسيكية وتتطلب المزيد من الجهد التجريبي لتسجيل عدد كبير من المسارات. بدلا من ذلك ، يمكن تقييم معامل انتشار مكونات الغشاء بواسطة Fluorescence Recovery After Photoblaching (FRAP)13 أو Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)14. وقد حظي هذا الأخير بمزيد من الاهتمام ، ويرجع ذلك أساسا إلى حساسيته العالية وانتقائيته ، وحجم الكشف المجهري ، وانخفاض الغزو ، والنطاق الديناميكي الواسع15.
تم تقديم الأساس المفاهيمي ل FCS من قبل Magde وزملاؤه منذ حوالي 50 عاما16,17. وهو يعتمد على تسجيل تذبذب انبعاثات التألق بدقة زمنية عالية (من μs إلى s)18. في نسخته الحديثة ، يتم إجراء القياسات في الخلايا الحية بواسطة حجم إثارة صغير متحد البؤرة (~ 0.3 فيمتولتر) يتم وضعه داخل منطقة ذات أهمية (على سبيل المثال ، في غشاء البلازما) ؛ يتم جمع إشارة التألق الناتجة عن نشر جزيئات الفلورسنت الداخلة والخارجة من حجم الملاحظة بدقة زمنية عالية جدا (أي وقت وصول كل فوتون على الكاشف). بعد ذلك ، يتم حساب الإشارة لتوليد دالة الارتباط الذاتي (ACF) ، والتي يتم من خلالها استخراج متوسط الوقت td (وقت الانتشار) الذي يبقى فيه الجزيء داخل الحجم البؤري ، إلى جانب متوسط عدد الجسيمات ، (N) ، الموجود في حجم الملاحظة ، والذي يتناسب عكسيا مع سعة ACF. قد تكون هذه المعلمة الأخيرة معلومات مفيدة عن تركيز الجزيء داخل حجم الملاحظة.
ومنذ ذلك الحين، تم تنفيذ عدد متزايد من طرائق FCS بفضل الأجهزة سريعة التطور في الضوئيات الحيوية، مما يسمح بوصف الظواهر الديناميكية التي تحدث في النظم الحية. ومع ذلك ، فإن الأنواع الجزيئية ستشهد توزيعا أكثر تداخلا لقيم معامل الانتشار ، والذي ينعكس عادة من خلال خاصية الانتشار الشاذة ، حيث تنتشر الجزيئات بعلاقة غير خطية في الوقت19 ، وصعوبة في تحديد المعنى البيولوجي لهذا الانتشار الفرعي الشاذ. في الماضي ، تم التغلب على هذه الصعوبة إلى حد ما عن طريق تسجيل الانتشار الجزيئي بواسطة FRAP من مناطق ذات أحجام مختلفة ، بدلا من منطقة واحدة فقط ، وبالتالي توفير معلومات مكانية إضافية. وقد مكن ذلك ، على سبيل المثال ، من تصور المجالات الدقيقة الغشائية20،21،22.
وقد أنشئت ترجمة لهذه الاستراتيجية إلى قياسات FCS (أي ما يسمى بالتحليل الطيفي للارتباط الفلوري للتباين الموضعي (svFCS)) عن طريق تغيير حجم الحجم البؤري للرصد، مما يسمح بتسجيل التذبذب في التألق على مقاييس مكانية مختلفة23. وبالتالي ، يوفر نهج svFCS معلومات مكانية غير مباشرة تسمح بتحديد وتحديد أنماط الانتشار الجزيئي ونوع تقسيم الغشاء (المجالات المعزولة مقابل المجالات المتجاورة24) للجزيئات المدروسة. من خلال رسم زمن الانتشار td كدالة لمختلف المقاييس المكانية المحددة بقيمة الخصر (ω) ، والتي تتوافق مع حجم نصف قطر شعاع الكشف في هذه الحالة23,25 ، يمكن للمرء أن يميز قانون الانتشار لجزيء معين في حالة فسيولوجية معينة. وبالتالي ، فإن svFCS هو تناظرية مثالية لتتبع الجسيمات المفردة في المجال الزمني26. في ظل قيود الانتشار البراوني ، ينبغي للمرء أن يتوقع علاقة خطية صارمة بين وقت الانتشار td والخصر ω (الشكل 1)23,25. يمكن أن يعزى أصل انحراف قانون الانتشار عن هذا المخطط إلى أسباب غير حصرية ، مثل شبكة الهيكل الخلوي ، أو الازدحام الجزيئي ، أو التقسيم الديناميكي في المجالات النانوية ، أو أي مزيج من هذه التأثيرات وغيرها (الشكل 1) ، ويجب اختبارها تجريبيا25.
هنا نقدم جميع نقاط التفتيش اللازمة للتحكم للاستخدام اليومي لنظام بصري svFCS مخصص مبني من الصفر ، والذي يكمل مراجعات البروتوكول السابقةلدينا 27,28 على هذا النهج التجريبي. علاوة على ذلك ، كدليل على المفهوم ، نقدم إرشادات بشأن معايرة الإعداد ، وإعداد الخلايا ، والحصول على البيانات ، وتحليلها لإنشاء قانون انتشار svFCS (DL) ل Thy1-GFP ، وهو بروتين مثبت على غشاء البلازما glycosylphosphatidylinositol ، والذي يعرف بأنه موضعي في المجالات النانوية لطوافة الدهون29. أخيرا ، نوضح كيف يؤثر زعزعة الاستقرار الجزئي للمجالات النانوية لطوافة الدهون بواسطة علاج أوكسيديز الكوليسترول على خصائص انتشار Thy1-GFP. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير وصف مفصل لبناء إعداد svFCS من الصفر في المواد التكميلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، وصفنا تنفيذ وحدة svFCS على مجهر فلورسنت قياسي ، وهو نهج تجريبي قوي لفك رموز ديناميكيات تنظيم غشاء البلازما في الخلايا الحية بفضل تحليل قانون انتشار FCS. من الناحية المفاهيمية ، يعتمد svFCS على مبدأ بسيط: قياسات الارتباط للتألق في المجال الزمني مع تغيير حجم منطقة الإضاءة23. كانت هذه الاستراتيجية مفيدة في استنتاج المعلومات النانوية من القياسات المجهرية ، مما يساعد على فك رموز العناصر الفيزيائية والكيميائية الرئيسية التي تساهم في تنظيم غشاء البلازما في حالة ثابتة25 والعمليات الفسيولوجية30،31،32،33. وإجمالا، تظهر تحليلات svFCS هذه بشكل لا لبس فيه وجود مجالات نانوية تعتمد على الدهون في أنواع مختلفة من الخلايا وتأثيرها المباشر في ضبط أحداث الإشارات المختلفة.
في هذا الإطار ، هناك بعض الجوانب البصرية التي يجب مراعاتها أثناء بناء إعداد svFCS لتحسين ميزانية الفوتون وتقليل الانحرافات البصرية. وبالتالي ، نوصي باستخدام المجهر الذي يمكن من خلاله إزالة عدسة الأنبوب عند إجراء قياس svFCS. علاوة على ذلك ، تلعب قزحية واحدة دورا رئيسيا في إعداد svFCS: فهي تغير حجم الشعاع في الفتحة الخلفية للهدف ، وبالتالي تغير بشكل مباشر حجم الخصر الفعال (أي حجم الإثارة الفعال). يجب أن يتناسب قطر الشعاع مع بؤبؤ العين الخلفي الهدف للحصول على أصغر حجم خصر34. هذا الخيار ، الذي يساعد على ضبط حجم الخصر ، يضمن تحسين ميزانية الفوتون وسهل التنفيذ. أخيرا ، يتم استخدام الحد الأدنى من الأجزاء البصرية على طول مسار الضوء. كلما كان النظام أقل تعقيدا ، قل عدد الفوتونات المفقودة. كل هذه الخيارات تحسن بشكل كبير من متانة تجارب svFCS.
وفيما يتعلق بالبروتوكول نفسه، لا بد من النظر في بضع خطوات حاسمة. الأهم من ذلك هو المحاذاة المناسبة للمسارات البصرية التي تعتبر حاسمة لقياسات svFCS الناجحة (البروتوكول ، القسم 2). من السهل التحقق من ذلك من خلال تحليل إشارة التألق من محلول 2 نانومتر Rh6G ، والذي يجب أن يكون ~ 200 كيلو هرتز تحت إضاءة ليزر 300 ميكروواط. يجب فتح جميع القزحية ، ويجب أن يكون ل ACFs سعة مهمة (عادة G0 ~ 1.5-2.0). نقطة حرجة أخرى تتعلق بالخلايا وإعدادها لتحليل svFCS (البروتوكول ، الأقسام 4-8). يجب تكييف كثافتها بحيث تكون الخلايا المعزولة التي يجب ملاحظتها متاحة للتحليل. يجب تجميد الخلايا غير الملتصقة على غطاء زجاجي حجري باستخدام محلول poly-L-lysine. لا ينبغي أن تكون إشارة التألق من وضع العلامات على الخلايا قوية جدا ، أو أنها ستؤدي إلى ACFs مسطحة للغاية يصعب ملاءمتها ، ومعلمات الملاءمة مثقلة بخطأ مهم. بالإضافة إلى ذلك ، فإن وضع العلامات غير المتجانسة ومجاميع التألق في الخلايا يجعل من الصعب للغاية تفسير قياسات svFCS. أخيرا ، يؤثر علاج أوكسيديز الكوليسترول على صلاحية الخلايا ، ويجب ألا يتجاوز تحليل svFCS ساعة واحدة بعد العلاج. من الأفضل أيضا تسجيل تقلبات التألق من غشاء البلازما العلوي لأنه غير متصل بالدعم ، وليس هناك خطر من إعاقة انتشار الجزيئات بسبب التفاعلات الفيزيائية مع الدعم.
وقد أحرز تقدم كاف في تقنية svFCS لاستخدامها في نهج مختلفة بسبب تنوع طرائق تعديل حجم الكشف، مما يجعل من الممكن دراسة مختلف العمليات البيولوجية في الخلايا الحية. بديل لضبط حجم حجم الإثارة هو استخدام موسع شعاع متغير35. من الممكن أيضا ببساطة تعديل حجم منطقة الإضاءة عن طريق تسجيل إشارة الفلورسنت من اعتراض غشاء البلازما على طول الاتجاه z36. يمكن القيام بذلك على المجهر البؤري القياسي الذي تم تطوير إطار نظري له لاشتقاق قانون الانتشار37,38.
على الرغم من أن طريقة svFCS توفر دقة مكانية زمانية ، وهو أمر ضروري لتوصيف التنظيم الجانبي غير المتجانس لغشاء البلازما ، إلا أن الأنماط الهندسية للحبس لا تستبعد بعضها البعض. يكشف انحراف t0 في اتجاه واحد أو آخر حصريا عن نمط مهيمن للحبس25. علاوة على ذلك ، هناك قيد مهم آخر لطريقة svFCS الحالية ينتج عن حد الحيود البصري الكلاسيكي (~ 200 نانومتر). هذا بلا شك أكبر من المجالات التي تحصر الجزيئات داخل غشاء البلازما الخلوي. لذلك ، يتم استنتاج تحليل الحبس من قيمة t0 ، مستنبطة من قانون الانتشار.
وقد تم التغلب على هذا العيب من خلال تنفيذ أساليب بديلة. في البداية، أتاح استخدام الأفلام المعدنية المحفورة بفتحات نانوية إمكانية إضاءة منطقة غشاء صغيرة جدا (أي أقل من حد الحيود البصري لفتحات نانومترية مفردة ذات نصف قطر يتراوح بين 75 و 250 نانومتر)39. وهكذا تم الإبلاغ عن النظام الانتقالي الذي تنبأ به قانون الانتشار النظري لتنظيم المجال المعزول ، وسمح بتحسين الحجم المميز لعدم تجانس الغشاء النانومتري وتقدير كمي للمساحة السطحية التي تشغلها المجالات النانوية المعتمدة على الدهون39. بدلا من ذلك ، تم تطوير الإضاءة النانومترية أيضا باستخدام المجهر الضوئي المسح الضوئي القريب من المجال40 أو الهوائيات النانوية البصرية المستوية41. وفي الآونة الأخيرة، وفر الجمع بين استنفاد الانبعاثات المحفزة (STED) و FCS أداة قوية وحساسة لتوثيق قانون الانتشار بدقة مكانية عالية جدا. يتيح هذا STED-FCS الوصول إلى خصائص الانتشار الجزيئي على نطاق نانوي يحدث في غضون فترة زمنية قصيرة ، مما يسمح بدراسة التنظيم الديناميكي لمجسات الدهون في غشاء البلازما42,43. ومع ذلك ، فإن القمع غير الكامل للتألق في عملية STED يتحدى تحليل منحنيات الارتباط التلقائي في FCS.
تم تطوير نموذج تركيب جديد للتغلب على هذه الصعوبة ، وتحسين دقة أوقات الانتشار ومتوسط أعداد الجزيئات قياسات44. أخيرا ، بالنسبة للانتشار الجزيئي البطيء في غشاء البلازما ، يمكن تطبيق مبدأ svFCS على البيانات المسجلة بواسطة التحليل الطيفي لارتباط الصورة45. في الآونة الأخيرة ، ثبت أن الجمع بين مجهر القوة الذرية (AFM) والتصوير الكلي للانعكاس الداخلي – FCS (ITIR-FCS) يساهم في تحسين طبيعة الآلية التي تعيق الانتشار الجزيئي في غشاء البلازما ، خاصة بالقرب من تكوين غشاء عتبة التسرب بسبب الكثافة العالية للمجالات النانوية46.
في الختام ، فإن إنشاء قانون الانتشار بواسطة svFCS قد وفر الأدلة التجريبية لاستنتاج عدم التجانس المحلي الناتج عن الدهون الجماعية الديناميكية وارتباطات البروتينات الغشائية. وكما ذكر وولاند وزملاؤه في العمل46، “يظل تحليل قانون نشر FCS أداة قيمة لاستنتاج السمات الهيكلية والتنظيمية دون حد الدقة من المعلومات الديناميكية”. ومع ذلك، نحن بحاجة إلى تطوير نماذج جديدة لتحسين تفسير قانون الانتشار الذي يجب أن يسمح بفهم أفضل لديناميكيات الأحداث الجزيئية التي تحدث في غشاء البلازما.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم SB و SM و DM بتمويل مؤسسي من CNRS و Inserm و Aix-Marseille University ومنح برامج من الوكالة الوطنية الفرنسية للبحوث (ANR-17-CE15-0032-01 و ANR-18-CE15-0021-02) و “Investissement d’Avenir” الفرنسية (ANR-10-INBS-04 France-BioImaging, ANR-11-LABX-054 labex INFORM). تعترف KW ب “BioTechNan” ، وهو برنامج لدراسات الدكتوراه البيئية متعددة التخصصات KNOW في مجال التكنولوجيا الحيوية وتكنولوجيا النانو. تقر EB بالدعم المالي المقدم من المركز الوطني للعلوم في بولندا (NCN) في إطار المشروع رقم 2016/21/D/NZ1/00285 ، وكذلك الحكومة الفرنسية وسفارة فرنسا في بولندا. تقر MŁ بالدعم المالي المقدم من وزارة التنمية البولندية (CBR POIR.02.01.00-00-0159/15-00/19) والمركز الوطني للبحث والتطوير (Innochem POIR.01.02.00-00-00-0064/17). تعترف TT بالدعم المالي المقدم من المركز الوطني للعلوم في بولندا (NCN) في إطار المشروع رقم 2016/21/B/NZ3/00343 ومن مركز فروتسواف للتكنولوجيا الحيوية (KNOW).
Materials
| Aligment tool | Spanner Wrench for SM1-Threaded Retaining Rings | Thorlabs | SPW602 |
| Avalanche Photodiode and Single Photon Counting Module (SPCM) | Single-Photon Counting Module, Avalanche Photodiode | Excelitas | SPCM-AQRH-15 |
| BNC 50 Ω plug to 50 Ω plug lead 2 m | RS Components | 742-4315 | |
| Coaxial cable 415 Cinch Connectors, RG-316, 50 Ω With connector, 1.22 m, RoHS2 | RS Components | 885-8172 | |
| Tee 50Ω RF Adapter BNC Plug to BNC Socket 0 → 1GHz | RS Components | 546-4948 | |
| Brennenstuhl 2.5 m, 8 Socket Type E – French Extension Lead, 230 V | RS Components | 768-5500 | |
| Mascot, 6W Plug In Power Supply 5V dc, 1.2A, 1 Output Switched Mode Power Supply, Type C | RS Components | 452-8394 | |
| Crystek CCSMACL-MC-24 Reference Oscillator Power Cable RF Adapter | RS Components | 792-4079 | |
| Fluorescence filtering | 535/70 ET Bandpass, AOI 0° Chroma Diameter 25 mm | AHF filter | F47-539 |
| Laser Beamsplitter zt488 RDC, AOI 45° Chroma 25.5 x 36 x 1 mm | AHF filter | F43-088 | |
| 496/LP BrightLine HC Longpass Filter, AOI 0° Chroma Diameter 25 | AHF filter | F37-496 | |
| Hardware correlator | 80 MHz Digital Correlator | Correlator.com | Flex02-12D |
| Laser | LASER LASOS LDM-XT fiber coupled, 488 nm, 65 mW | Lasos | BLD-XT 488100 |
| Laser safety | High-Performance Black Masking Tape, 1" x 180' (25 mm x 55 m) Roll | Thorlabs | T743-2.0 |
| Lens Tissues, 25 Sheets per Booklet, 5 Booklets | Thorlabs | MC-5 | |
| Laser Safety Glasses, Light Orange Lenses, 48% Visible Light Transmission | Thorlabs | LG3B | |
| Microscope | Zeiss Axiovert 200M Motorized Inverted Fluorescence Microscope Fine and coarse focusing, reflector turret rotation, objective nosepiece rotation, switching camera ports, and internal light shutters |
Carl Zeiss | |
| C-Apochromat 40x/1,2 W Korr.selected for FCS (D=0.14-0.19 mm) (WD=0.28 mm at D=0.17 mm), UV-VIS-IR |
Carl Zeiss | 421767-9971-711 | |
| Adapter W0.8 / M27x0.75 H "5" | Carl Zeiss | 000000-1698-345 | |
| Middle ring W0.8 – W0.8 H "5" | Carl Zeiss | 000000-1698-347 | |
| Optical path | D25.4mm Mirror, Protected Silver | Thorlabs | PF10-03-P01 |
| D25.4mm, F=60.0.mm, Visible Achromat | Thorlabs | AC254-060-A | |
| D25.4mm, F=35.0.mm, Visible Achromat | Thorlabs | AC254-035-A | |
| 25 µm mounted pinhole | Thorlabs | P25S I | |
| 25.4mm Mounted Zero, Order 1/2 Waveplate 488 nm | Thorlabs | WPH10M-488 (HWP) | |
| 20mm Polarizing Beamsplitter Cube 420-680 nm | Thorlabs | PBS201 | |
| Rotation Stage 56 mm x 26 mm Threaded ID | Thorlabs | RSP1/M | |
| 52 mm x 52 mm Kinematic Platform Mount | Thorlabs | KM100B/M | |
| Adjustable Prism Clamp | Thorlabs | PM3/M | |
| Beam block – active area 19 mm x 38 mm | Thorlabs | LB1/M | |
| Iris Diaphragm 1 mm to 25 mm Aperture | Thorlabs | ID25/M | |
| Left-Handed Kinematic Cylindrical Lens Mount | Thorlabs | KM100CL | |
| 1" Optic Holder, M4 Tap | Thorlabs | MFF101/M | |
| 1" Stackable Lens Tube | Thorlabs | SM1L03 | |
| Stackable Lens Mount for 1" optic-usable depth ½ | Thorlabs | SM1L05 | |
| Stackable Lens Mount For 1"Optic-usable Depth 2" | Thorlabs | SM1L20 | |
| Small Optical Rails 600mm, metric | Thorlabs | RLA600/M | |
| Small Optical Rails 75mm, metric | Thorlabs | RLA075/M | |
| Small Optical Rails 150mm, metric | Thorlabs | RLA150/M | |
| Rail Carrier, Counterbored Hole 1"x 1" | Thorlabs | RC1 | |
| Rail Carrier, Perpendicular Dovetail | Thorlabs | RC3 | |
| High Precision Translating Lens Mount for 1 inch | Thorlabs | LM1XY/M | |
| ½ " (12mm) Dovetail Translation Stage | Thorlabs | DT12/M | |
| Rail Clamps | Thorlabs | CL6 | |
| Metric XYZ Translation Stage (Includes PT102) | Thorlabs | PT3/M | |
| Black Rubberized Fabric | Thorlabs | BK5 | |
| Ball Driver kit/ 6 tools | Thorlabs | BD-KIT/M | |
| Adapter with External M6 x 1.0 Threads and External M4 x 0.7 Threads | Thorlabs | AP6M4M | |
| Mounting Base, 25 mm x 58 mm x 10 mm, 5 Pack | Thorlabs | BA1S/M-P5 | |
| Lens Mount for 25.4mm optic | Thorlabs | LMR1/M | |
| SM1 FC/APC Adapter | Thorlabs | SM1FCA | |
| Kinematic Mirror Mount For 1 inch Optics | Thorlabs | KM100 | |
| Silicon Power Head, 400-1100nm, 50mW | Thorlabs | S120C | |
| 12.7 mm Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L=50 mm, 5 Pack |
Thorlabs | PH50/M-P5 | |
| Post Holder with Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L=20 mm | Thorlabs | PH20/M | |
| 12.7 mm x 50 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, M6-Tapped Hole, 5 Pack |
Thorlabs | TR50/M-P5 | |
| 12.7 mm x 75 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, M6-Tapped Hole, 5 Pack |
Thorlabs | TR75/M-P5 | |
| USB Power and Energy Meter Interface | Thorlabs | PM100USB | |
| 12.7 mm x 30 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, M6-Tapped Hole |
Thorlabs | TR30/M | |
| 12.7 mm x 20 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, M6-Tapped Hole |
Thorlabs | TR20/M | |
| 750 mm long Structural Rail (detection box) | Thorlabs | XE25L750/M | |
| 350 mm long Structural Rail (detection box) | Thorlabs | XE25L350/M | |
| Quick Corner Cube for 25 mm Rails | Thorlabs | XE25W3 | |
| Right-Angle Bracket for 25 mm Rails | Thorlabs | XE25A90 | |
| Black posterboard 20" x 30" (508 mm x 762 mm), 1/16" (1.6 mm) Thick, 5 Sheets | Thorlabs | TB5 | |
| Hinge for 25 mm Rail Enclosures | Thorlabs | XE25H | |
| Lid Stop for 25 mm Rail Enclosures | Thorlabs | XE25LS | |
| M4 Cap Screw Kit | Thorlabs | HW-KIT1/M | |
| M6 Cap Screw Kit and Hardware kit | Thorlabs | HW-KIT2/M | |
| Table Clamp, L-Shape, 5 Pack | Thorlabs | CL5-P5 | |
| SM1 Ring-Actuated Iris Diaphragm (Ø0.8 – Ø12 mm) | Thorlabs | SM1D12D | |
| Ø1" SM1-Mounted Frosted Glass Alignment Disk w/Ø1 mm Hole | Thorlabs | DG10-1500-H1-MD | |
| Honeycomb Optical Table Top, Standa | Standa | 1HB10-15-12 | |
| Optical Table support, Standa | Standa | 1TS05-12-06-AR | |
| Sample nano-positionning | Precision XYZ Nanopositioning | Physik Instrumente | PI P527-3.CD |
| Digital Multi-Channel Piezo Co, 3 Channels, -30 to 130 V Sub- D Connector(s), Capacitive Sensors, |
Physik Instrumente | PI E727-3.CD | |
| Temperature chamber | Zeiss 200M Inverted Microscope Incubator System MATT BLK | Digital Pixel | |
| Dual Channel Microprocessor Temperature Controller | Digital Pixel | DP_MTC_2000_DUO | |
| Two Vibration Free Heater Modules | Digital Pixel | DP_150_VF | |
| PT100 Temperature Sensor | Digital Pixel | DP_P100_TS | |
| Biological Reagents and Materials | |||
| Cell culture and transfection | Cos7 cells | ATCC® | CRL-1651™ |
| 8- well Lab-Tek chambers | Thermo Fisher Scientific | 155411PK | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| PBS buffer | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| PenStrep | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| PolyJet Transfection Reagent | SignaGen Laboratories | SL100688 | |
| Cholesterol content measurement | Amplex Red Cholesterol Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A12216 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 87786 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78420 | |
| ROTI Nanoquant Working Solution | Roth | K880 | |
| GloMax Discover Microplate Reader | Promega | GM3000 | |
| svFCS measurements | HBSS buffer | Thermo Fisher Scientific | 14025092 |
| Hepes buffer | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| Cholesterol oxidase | Sigma-Aldrich | C8868 | |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 83697-1G |
Referencias
- Engelman, D. M. Membranes are more mosaic than fluid. Nature. 438 (7068), 578-580 (2005).
- Newton, A. C. Regulation of the ABC kinases by phosphorylation: protein kinase C as a paradigm. The Biochemical Journal. 370, 361-371 (2003).
- Marguet, D., Lenne, P. F., Rigneault, H., He, H. T. Dynamics in the plasma membrane: how to combine fluidity and order. The EMBO Journal. 25 (15), 3446-3457 (2006).
- Edidin, M. The state of lipid rafts: From model membranes to cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. , (2003).
- Lingwood, D., Simons, K. Lipid rafts as a membrane-organizing principle. Science. , (2010).
- He, H. T., Marguet, D. Detecting nanodomains in living cell membrane by fluorescence correlation spectroscopy. Annual Reviews of Physical Chemistry. 62, 417-436 (2011).
- Rossy, J., Ma, Y., Gaus, K. The organisation of the cell membrane: Do proteins rule lipids. Current Opinion in Chemical Biology. 20 (1), 54-59 (2014).
- Nicolson, G. L. The Fluid – Mosaic Model of Membrane Structure: Still relevant to understanding the structure, function and dynamics of biological membranes after more than 40 years. Biochimica et Biophysica Acta – Biomembranes. 1838 (6), 1451-1466 (2014).
- Fujiwara, T., Ritchie, K., Murakoshi, H., Jacobson, K., Kusumi, A. Phospholipids undergo hop diffusion in compartmentalized cell membrane. The Journal of Cell Biology. 157 (6), 1071-1081 (2002).
- Kusumi, A., et al. Paradigm shift of the plasma membrane concept from the two-dimensional continuum fluid to the partitioned fluid: high-speed single-molecule tracking of membrane molecules. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 34, 351-378 (2005).
- Destainville, N., Salomé, L. Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments. Biophysical Journal. 90 (2), 17-19 (2006).
- Wieser, S., Moertelmaier, M., Fuertbauer, E., Stockinger, H., Schütz, G. J. Un)confined diffusion of CD59 in the plasma membrane determined by high-resolution single molecule microscopy. Biophysical Journal. 92 (10), 3719-3728 (2007).
- Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophysical Journal. , (1976).
- Petrášek, Z., Schwille, P. Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical Journal. , (2008).
- Elson, E. L. 40 Years of FCS: How it all began. Methods in Enzymology. , (2013).
- Elson, E. L., Magde, D. Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis and theory. Biopolymers. , (1974).
- Magde, D., Elson, E. L., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization. Biopolymers. , (1974).
- Schwille, P., Haupts, U., Maiti, S., Webb, W. W. Molecular dynamics in living cells observed by fluorescence correlation spectroscopy with one- and two-photon excitation. Biophysical Journal. , (1999).
- Bouchaud, J. P., Georges, A. Anomalous diffusion in disordered media: Statistical mechanisms, models and physical applications. Physics Reports. , (1990).
- Yechiel, E., Edidin, M. Micrometer-scale domains in fibroblast plasma membranes. Journal of Cell Biology. 105 (2), 755-760 (1987).
- Salomé, L., Cazeils, J. L., Lopez, A., Tocanne, J. F. Characterization of membrane domains by FRAP experiments at variable observation areas. European Biophysics Journal. 27 (4), 391-402 (1998).
- Niv, H., Gutman, O., Kloog, Y., Henis, Y. I. Activated K-Ras and H-Ras display different interactions with saturable nonraft sites at the surface of live cells. The Journal of Cell Biology. 157 (5), 865-872 (2002).
- Wawrezinieck, L., Rigneault, H., Marguet, D., Lenne, P. F. Fluorescence correlation spectroscopy diffusion laws to probe the submicron cell membrane organization. Biophysical Journal. 89 (6), 4029-4042 (2005).
- Saxton, M. J. Fluorescence corralation spectroscopy. Biophysical Journal. , (2005).
- Lenne, P. F., et al. Dynamic molecular confinement in the plasma membrane by microdomains and the cytoskeleton meshwork. EMBO Journal. 25 (14), 3245-3256 (2006).
- Ruprecht, V., et al. Cortical contractility triggers a stochastic switch to fast amoeboid cell motility. Cell. , (2015).
- Billaudeau, C., et al. Probing the plasma membrane organization in living cells by spot variation fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Enzymology. 519, 277-302 (2013).
- Mailfert, S., Hamon, Y., Bertaux, N., He, H. T., Marguet, D. A user’s guide for characterizing plasma membrane subdomains in living cells by spot variation fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Cell Biology. 139, 1-22 (2017).
- Rege, T. A., Hagood, J. S. Thy-1, a versatile modulator of signaling affecting cellular adhesion, proliferation, survival, and cytokine/growth factor responses. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Cell Research. , (2006).
- Cahuzac, N., et al. Fas ligand is localized to membrane rafts, where it displays increased cell death-inducing activity. Blood. , (2006).
- Guia, S., et al. Confinement of activating receptors at the plasma membrane controls natural killer cell tolerance. Science Signaling. 4 (167), 21 (2011).
- Blouin, C. M., et al. Glycosylation-dependent IFN-γR partitioning in lipid and actin nanodomains is critical for JAK activation. Cell. 166 (4), 920-934 (2016).
- Chouaki-Benmansour, N., et al. Phosphoinositides regulate the TCR/CD3 complex membrane dynamics and activation. Scientific Reports. , (2018).
- Wawrezinieck, L., Lenne, P. F., Marguet, D., Rigneault, H. Fluorescence correlation spectroscopy to determine diffusion laws: application to live cell membranes. Biophotonics Micro- and Nano-Imaging. , (2004).
- Masuda, A., Ushida, K., Okamoto, T. New fluorescence correlation spectroscopy enabling direct observation of spatiotemporal dependence of diffusion constants as an evidence of anomalous transport in extracellular matrices. Biophysical Journal. , (2005).
- Humpolíčková, J., et al. Probing diffusion laws within cellular membranes by Z-scan fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical Journal. , (2006).
- Benda, A., et al. How to determine diffusion coefficients in planar phospholipid systems by confocal fluorescence correlation spectroscopy. Langmuir. , (2003).
- Ganguly, S., Chattopadhyay, A. Cholesterol depletion mimics the effect of cytoskeletal destabilization on membrane dynamics of the serotonin1A receptor: A zFCS study. Biophysical Journal. , (2010).
- Wenger, J., et al. Diffusion analysis within single nanometric apertures reveals the ultrafine cell membrane organization. Biophysical Journal. 92 (3), 913-919 (2007).
- Manzo, C., Van Zanten, T. S., Garcia-Parajo, M. F. Nanoscale fluorescence correlation spectroscopy on intact living cell membranes with NSOM probes. Biophysical Journal. , (2011).
- Regmi, R., et al. Planar optical nanoantennas resolve cholesterol-dependent nanoscale heterogeneities in the plasma membrane of living cells. Nano Letters. , (2017).
- Mueller, V., et al. FCS in STED microscopy: Studying the nanoscale of lipid membrane dynamics. Methods in Enzymology. , (2013).
- Sezgin, E., et al. Measuring nanoscale diffusion dynamics in cellular membranes with super-resolution STED-FCS. Nature Protocols. , (2019).
- Wang, R., et al. A straightforward STED-background corrected fitting model for unbiased STED-FCS analyses. Methods. , (2018).
- Veerapathiran, S., Wohland, T. The imaging FCS diffusion law in the presence of multiple diffusive modes. Methods. , (2018).
- Gupta, A., Phang, I. Y., Wohland, T. To hop or not to hop: exceptions in the FCS diffusion law. Biophysical Journal. , (2020).
