T- und B-Zell-Rezeptor-Immunrepertoireanalyse mittels Next-Generation-Sequencing
Summary
Das aktuelle Protokoll beschreibt eine Methode zur DNA-Isolierung aus Blutproben und Darmbiopsien, die Generierung von TCRβ- und IGH-PCR-Bibliotheken für die Sequenzierung der nächsten Generation, die Durchführung eines NGS-Laufs und die grundlegende Datenanalyse.
Abstract
Das immunologische Gedächtnis, das Kennzeichen der adaptiven Immunität, wird durch T- und B-Lymphozyten orchestriert. Im Kreislauf und in verschiedenen Organen gibt es Milliarden von einzigartigen T- und B-Zellklonen, und jeder kann ein spezifisches Antigen binden, was zu Proliferation, Differenzierung und / oder Zytokinsekretion führt. Die enorme Heterogenität in T- und B-Zellen wird durch zufällige Rekombination verschiedener genetischer Segmente erzeugt. Next-Generation-Sequencing-Technologien (NGS), die in den letzten zehn Jahren entwickelt wurden, ermöglichen einen beispiellosen detaillierten Einblick in das Immunrepertoire der T- und B-Zellrezeptoren. Studien zu verschiedenen entzündlichen Erkrankungen, Immundefekten, Infektionen und Malignomen zeigten deutliche Veränderungen der Klonalität, der Gennutzung und der biophysikalischen Eigenschaften des Immunrepertoires und lieferten wichtige Erkenntnisse über die Rolle adaptiver Immunantworten bei verschiedenen Erkrankungen.
Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für NGS des Immunrepertoires von T- und B-Zellen aus Blut und Gewebe zur Verfügung. Wir präsentieren eine Pipeline, die von der DNA-Isolierung über die Bibliotheksvorbereitung, die Sequenzierung auf NGS-Sequenzierern bis hin zu grundlegenden Analysen beginnt. Diese Methode ermöglicht die Erforschung spezifischer T- und B-Zellen auf Nukleotid- oder Aminosäureebene und kann so dynamische Veränderungen in Lymphozytenpopulationen und Diversitätsparametern bei verschiedenen Erkrankungen identifizieren. Diese Technik kommt langsam in die klinische Praxis und hat das Potenzial für die Identifizierung neuartiger Biomarker, Risikostratifizierung und Präzisionsmedizin.
Introduction
Das adaptive Immunsystem, bestehend aus T- und B-Lymphozyten, nutzt das immunologische Gedächtnis, um ein zuvor angetroffenes Antigen zu erkennen und eine schnelle Reaktion einzuleiten. Lymphozyten werden im Knochenmark erzeugt und reifen im Thymus (T-Zellen) oder Knochenmark (B-Zellen). Sowohl der T-Zell-Rezeptor (TCR) als auch der B-Zell-Rezeptor (BCR) weisen einzigartige Konfigurationen auf, die die Erkennung spezifischer Antigene ermöglichen. In der Homöostase zirkulieren T- und B-Zellen ständig und untersuchen die Billionen verschiedener Peptide, die auf Antigen-präsentierenden Zellen präsentiert werden. Die TCR- oder BCR-Ligatur eines spezifischen Antigens mit hoher Affinität führt zusammen mit einer geeigneten Co-Stimulation zur Zellaktivierung, was im Falle von B-Zellen zu Zytokinsekretion, klonaler Expansion und Generierung von Antikörpern führt.
Die enorme Vielfalt der verschiedenen T- oder B-Zellen wird zusammenfassend als Immunrepertoire bezeichnet und ermöglicht das Erkennen unzähliger verschiedener Epitope. Um ein so großes Repertoire zu generieren, findet ein komplexer Prozess der zufälligen Anordnung verschiedener Gensegmente statt, wodurch nahezu endlose Kombinationen von Rezeptoren entstehen, die einzigartige Antigene binden können1. Dieser Prozess, der als V(D)J-Rekombination bezeichnet wird, umfasst Umlagerungen verschiedener variabler (V), Diversität (D) und verbindende (J) Gene, begleitet von zufälligen Deletionen und Insertionen von Nukleotiden in den Verbindungen2.
Die Architektur des adaptiven Immunsystems interessiert Wissenschaftler in verschiedenen Bereichen seit vielen Jahrzehnten. In der Vergangenheit wurden Sanger-Sequenzierung, komplementär bestimmende Region 3 (CDR3) Spektrentypisierung und Durchflusszytometrie verwendet, um das Immunrepertoire zu charakterisieren, lieferten jedoch eine niedrige Auflösung. In den letzten zehn Jahren ermöglichten Fortschritte bei Next-Generation-Sequencing-Methoden (NGS) einen tiefen Einblick in die Eigenschaften und die Zusammensetzung der TCR- und BCR-Repertoires eines Individuums3,4. Diese Hochdurchsatzsysteme (HTS) sequenzieren und verarbeiten Millionen von neu angeordneten TCR- oder BCR-Produkten gleichzeitig und ermöglichen eine hochauflösende Analyse spezifischer T- und B-Zellen auf Nukleotid- oder Aminosäureebene. NGS bietet eine neue Strategie, um das Immunrepertoire sowohl in den Bereichen Gesundheit als auch Krankheit zu untersuchen. Studien mit HTS zeigten veränderte TCR- und BCR-Repertoires bei Autoimmunerkrankungen5, primären Immundefekten6,7und Malignomen, wie z. B. bei akuter myeloischer Leukämie8. Mit NGS haben wir und andere eine oligoklonale Expansion spezifischer T- und B-Zellklone bei Patienten mit entzündlichen Darmerkrankungen (IBD), einschließlich Colitis ulcerosa und Morbus Crohn,gezeigt 9,10,11,12,13,14. Insgesamt deuten Studien aus verschiedenen Bereichen darauf hin, dass Veränderungen im Repertoire eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese immunvermittelter Störungen spielen.
Das aktuelle Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von DNA aus Darmbiopsien und Blut, die Generierung von TCRβ- und IGH-PCR-Bibliotheken für NGS und die Durchführung des Sequenzierungslaufs. Wir bieten auch grundlegende Schritte in der Immunrepertoire-Datenanalyse. Dieses Protokoll kann auch für die Generierung von TCRα-, TCRγ- und IGL-Bibliotheken angewendet werden. Die Methode ist auch mit anderen Organen (z.B. Lymphknoten, Tumoren, Synovialflüssigkeit, Fettgewebe etc.) kompatibel, sofern gewebespezifische Verdauungsprotokolle verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Veränderungen in Der Häufigkeit und Funktion von B- und T-Lymphozyten treten häufig bei verschiedenen Malignomenauf 18, chronisch entzündlichen Erkrankungen (z. B. Colitis ulcerosa und rheumatoide Arthritis)10,19und in verschiedenen Immundefekten17,20. Die aktuelle Methode nutzt NGS, um einen detaillierten Überblick über TCR- und BCR-Repertoires zu ermöglichen, was den Nachw…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
nichts.
Materials
| 2-propanol | Sigma | I9516-500ML | |
| 1.7 mL micro-centrifuge tubes | Axygen | 8187631104051 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner | 188261 | |
| Absolute ethanol | Merck | 1.08543.0250 | |
| Amplitaq Gold | Thermo Fisher | N8080241 | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Heat block | Bioer | Not applicable | |
| High Sensitivity D1000 Sample Buffer | Agilent | 5067-5603 | For Tapestation |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | For Tapestation. Tubes sold seperately |
| Lymphotrack Assay kit | Invivoscribe | TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019 | Each includes 24 indexes |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | Includes standard flow cell type and all reagents required |
| MiSeq Sequencer | Illumina | SY-410-1003 | |
| PCR strips | 4titude | 4ti-0792 | |
| Proteinase K | Invitrogen | EO0491 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher | Q33226 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes |
| Shaker | Biosan | Not applicable | |
| Tapestation 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2940CA | |
| ultra pure water | Bio-lab | 7501 | |
| Wizard DNA isolation kit | Promega | A1120 | Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer |
Referencias
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