질량 광합성에 의한 항체 항원 선호도의 신속한 결정
Summary
우리는 질량 광합성(MP)을 사용하여 항원-항체 친화성 측정에 대한 단일 분자 접근법을 기술합니다. MP 기반 프로토콜은 빠르고 정확하며 매우 적은 양의 재료를 사용하며 단백질 변형이 필요하지 않습니다.
Abstract
항원-항체 상호 작용의 특이성 및 친화성의 측정은 의학 및 연구 응용 분야에서 매우 중요합니다. 이 프로토콜에서, 우리는 이 목적을 위해 새로운 단 하나 분자 기술, 질량 광측정법 (MP)의 구현을 설명합니다. MP는 단일 분자 수준에서 항체 및 항원 항체 복합체의 분자 질량 및 인구를 감지하고 정량화하는 라벨 및 고정되지 않은 기술입니다. MP는 몇 분 안에 항원 항체 샘플을 분석하여 결합 친화성의 정확한 측정을 허용하고 동시에 단백질의 스토이치오메트리 및 올리고메릭 상태에 대한 정보를 제공한다. 이것은 단백질의 피코몰 양과 고가의 소모품만을 필요로 하는 간단하고 간단한 기술입니다. 동일한 절차는 50 kDa보다 큰 분자 질량을 가진 단백질을 위한 단백질 단백질 결합을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다. 다발성 단백질 상호 작용을 위해, 다중 결합 부위의 친화력은 단일 측정에서 얻을 수 있다. 그러나 단일 분자 측정 모드와 라벨링부족은 몇 가지 실험적 한계를 가중시합니다. 이 방법은 서브 마이크로몰라 상호 작용 친화성, 20 kDa 이상의 분자 질량을 가진 항원 및 상대적으로 순수한 단백질 샘플의 측정에 적용될 때 최상의 결과를 제공합니다. 또한 기본 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 필요한 피팅 및 계산 단계를 수행하는 절차에 대해서도 설명합니다.
Introduction
항체는 분자 생물학의 유비쿼터스 공구가 되고 의학 및 연구 응용 둘 다에서 광범위하게 이용됩니다. 의학에서는 진단에서 매우 중요하지만 치료 응용 분야도 확장되고 있으며 새로운 항체 기반 치료법은지속적으로 1,2,3,4로개발되고 있습니다. 항체의 과학적 적용은 면역형성5,면역 절전6, 유동 세포측정법7,ELISA 및 서부 블로팅과 같은 많은 필수 불가결한 실험실 기술을 포함한다. 이러한 각 응용 분야에 대해 결합 친화성 및 특이성을 포함한 항체의 결합 특성의 정확한 측정을 얻는 것이 매우 중요합니다.
1990년 최초의 상업용 표면 플라스몬 공명(SPR) 기기가 도입된 이래, 광학 바이오센서는 항체 특성화의 “금본위제”가 되었지만, ELISA를 포함한 다른 기술도 항체 친화성8,9를측정하는 데 일상적으로 사용되고 있다. 이 방법은 일반적으로 잠재적으로 관심의 상호 작용에 영향을 미칠 수 있는 분석된 분자의 고정화 또는 표시를 요구합니다. 또한 데이터 분석을 위해 결과를 수집하기 전에 여러 분석 단계를 포함하는 비교적 느립니다. 최근에 개발된 단일 분자 방법, 질량 광측정법(MP)은 현미경 커버슬립10,11의표면에 착륙할 때 용액에서 직접 분자를 검출한다. MP가 사용하는 광 산란 기반 광학 검출은 단백질 라벨링 또는 변형이 필요하지 않습니다. 개별 단백질 분자는영상(도 1D)에나타나는 어두운 반점으로 간섭메트릭 산란 현미경에 의해 기록되며, 수천 개의 분자는 1분 데이터 수집12동안 검출될 수 있다. 각 개별 입자에 의해 생성된 신호는 정량화되고, 그 대비값(상대어둠)이 계산됩니다. 간섭 대비 값은 단백질의 분자 질량에 비례하여 항원-항체 혼합물에서 결합 및 자유 종의 식별을 가능하게 합니다. 동시에 분자 착륙 이벤트를 계산하여 MP는 종 인구를 직접 측정합니다. 이렇게 하면 MP 기반 메서드는 여러 바인딩 사이트의 친화성을 독립적으로 정량화할 수 있는 고유한 기능을 제공합니다.
항원(Ag)분자의 결합은 그대로항체(Ab)의2개의 결합 부위에 다음과 같이 설명될 수 있다.
평형 협회 상수 Ka1 및 Ka2로 정의 :
여기서 ci와 f는 각각 성분 i의농도 와 분수를 나타낸다. 토트에 대한 총 항원농도(cAg)토트는 다음과 같이 발현될 수 있다.
항체(cAb)토트 및 항원(cAg)의총농도가 알려져 있기 때문에, 이 방정식은 MP 측정에서 얻은 실험 성분 분획에 직접 맞고 평형 협회 상수 K a1 및 K a2를 계산하는 데 사용될 수 있다(보충 정보참조).
MP 데이터는 또한 두 항체 결합부위(11)사이의 쿠퍼성성을 추정하는 데 사용될 수 있다. 동일한 현미경 결합 상수를 가진 2개의 항체 파라토원의 경우, Ab·의집단의 과정을 설명하는 통계적 인자 아그와 Ab· Ag2 복합체는 명백한 거시적 평형 상수 Ka1 및 Ka2가 수치적으로 동일하지 않으며 Ka1 = 4Ka2를 지시합니다. 따라서, Ka1< 4K a2의 실험값은 두 항체 결합 부위 간의 양성 응고성을 나타낸다. 마찬가지로 Ka1 > 4Ka2는 부정적인 쿠퍼티를 나타냅니다.
항원-항체 결합 친화성의 MP 측정은 빠르며 소량의 물질이 필요합니다. 상량 계산에 사용되는 MP 질량 분포는 샘플 특성에 대한 추가 정보를 제공하고 단일 실험에서 샘플 순도, 올리고머화 및 집계의 평가를 가능하게 합니다. 동일한 방법은 높은 친화성 단백질 단백질 결합을 측정하는 데 사용할 수 있으며 MP는 다중 발렌트 단백질 상호 작용연구에 특히 유용합니다. 다중 단백질 복합체는 일반적으로 큰 분자 질량을 가지고 있으며, MP 검출에 최적이며, 단일 분자 데이터는 금식측정을 측정하고 동시에 다중 결합 부위의 친화성을 계산하는 데 사용될 수 있다. 이 정보는 일반적으로 대량 기반 방법을 사용하여 얻기가 어렵습니다.
수정없이, 현재 프로토콜은 20 kDa 이상의 분자 질량의 항원과의 상대적으로 높은 친화성, 하위 미세 몰라 상호 작용의 측정에 적합합니다. 최적의 결과를 위해 단백질 재고는 순도가 높어야 하지만 특정 완충 요건은 없습니다. MP를 사용하여, 항원-항체 결합은 5분 이내에 평가될 수 있다. 정확한 KD 계산에 필요한 데이터 수집 및 분석을 30분 이내에 수행할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 질량 광측정 기반 프로토콜은 항원-항체 결합 친화성을 측정하는 빠르고 정확한 방법을 제공한다. MP 분석은 매우 적은 양의 물질을 사용하며, 스토이치오메트리, 올리고머화 및 순도를 포함한 추가 정보는 동일한데이터(그림 5)로부터평가될 수 있다. 수정없이, 이 방법은 약 5 nM에서 500 nM 범위의 해리 상수의 측정에 적용되며, 약 20 kDa 이상의 분자 질량을 가진…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 원고의 그의 비판적 독서에 대한 키어 노이만 감사합니다. 이 작품은 NHLBI, NIH의 교내 프로그램에 의해 지원되었다.
Materials
| AcquireMP | Refeyn | MP data collection software | |
| Anti-human thrombin | Haematologic Technologies | AHT-5020 | RRID: AB_2864302 |
| Cotton-tipped applicators | Thorlabs | CTA10 | cotton optical swabs for lens cleaning |
| Coverslips 24×24 mm | Globe Scientific | 1405-10 | |
| Coverslips 24×50 mm | Fisher Scientific | 12-544-EP | |
| DiscoverMP | Refeyn | MP data processing software | |
| Forceps | Electron Microscopy Sciences | 78080-CF | soft-tipped forceps for coverslips handling |
| Human α-thrombin | Haematologic Technologies | HCT-0020 | |
| Immersion oil | Thorlabs | MOIL-30 | |
| Isopropanol | Alfa Aesar | 36644 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | spreadsheet | |
| OneMP | Refeyn | Mass Photometry instrument | |
| Origin | OriginLab | scientific graphing software | |
| PBS | Corning | 46-013-CM | 10x stock |
| Syringe filter | Millipore | SLGSR33SS | buffer and sample filtering |
Referencias
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