Questo articolo ha lo scopo di descrivere un protocollo sistematico per ottenere fette orizzontali del cervello ippocampale nei topi. L’obiettivo di questa metodologia è preservare l’integrità delle vie della fibra ippocampale, come il percorso perforante e il tratto di fibra muschiata per valutare i processi neurologici correlati al giro dentato.
L’ippocampo è una struttura altamente organizzata nel cervello che fa parte del sistema limbico ed è coinvolto nella formazione e consolidamento della memoria, nonché nella manifestazione di gravi disturbi cerebrali, tra cui il morbo di Alzheimer e l’epilessia. L’ippocampo riceve un alto grado di intra- e inter-connettività, garantendo una corretta comunicazione con strutture cerebrali interne ed esterne. Questa connettività viene effettuata attraverso diversi flussi informativi sotto forma di percorsi in fibra. Le fette cerebrali sono una metodologia frequentemente utilizzata quando si esplorano le funzioni neurofisiologiche dell’ippocampo. Le fette cerebrali ippocampali possono essere utilizzate per diverse applicazioni, tra cui registrazioni elettrofisiologiche, misurazioni microscopiche leggere e diverse tecniche molecolari biologiche e istochimiche. Pertanto, le fette cerebrali rappresentano un sistema modello ideale per valutare le funzioni proteiche, per indagare i processi fisiopatologici coinvolti nei disturbi neurologici e per scopi di scoperta di farmaci.
Esistono diversi modi di tagliare i preparati. I preparati a fette cerebrali con vibratoma consentono una migliore conservazione della struttura tissutale e garantiscono un sufficiente apporto di ossigeno durante l’affettare, che presentano vantaggi rispetto all’uso tradizionale di un elicottero tissutale. Inoltre, diversi piani di taglio possono essere applicati per i preparati a fette cerebrali vibratome. Qui, viene fornito un protocollo dettagliato per una preparazione di successo di fette ippocampali orizzontali tagliate con vibratome di cervelli di topo. A differenza di altre preparazioni a fette, l’affettamento orizzontale consente di mantenere le fibre del percorso di input ippocampale (percorso perforante) in uno stato completamente intatto all’interno di una fetta, il che facilita l’indagine delle interazioni entorinale-ippocampale. Qui, forniamo un protocollo completo per la dissezione, l’estrazione e l’affezione orizzontale acuta del cervello murino e discutiamo le sfide e le potenziali insidie di questa tecnica. Infine, mostreremo alcuni esempi per l’uso di fette cerebrali in ulteriori applicazioni.
L’ampia esplorazione dell’ippocampo iniziò quando Scoville e Milner riportarono l’incapacità di un paziente (H.M.) di formare una nuova memoria dichiarativa dopo la rimozione chirurgica dell’ippocampo e delle vicine strutture del lobo temporale come trattamento per l’epilessia grave1. Da quel momento in poi, l’ippocampo è stato ampiamente studiato a partire dalle proprietà e dalle funzioni neuronali generali fino allo sviluppo di gravi disturbi cerebrali, come l’epilessia e il morbo di Alzheimer2,3,4,5. L’ippocampo fa parte del sistema limbico, costituito da un gruppo di strutture cerebrali correlate coinvolte nell’emozione e nella formazione dellamemoria 6,7. Una fitta rete di diversi percorsi in fibra realizza una stretta connettività ippocampale alle strutture cerebrali interne ed esterne. Questi percorsi includono il percorso perforante mediale e laterale (corteccia entorinale per dentare il giro, CA3 – CA1 e subicolo)8, il percorso della fibra muschiata (giro dentato a CA3)9 e il percorso commissurale collaterale / associativo schaffer (da CA3 a CA1)10 (Figura 1). L’ippocampo presenta una delle aree cerebrali più ampiamente esplorate finora a causa della sua organizzazione laminare altamente conservata della formazione di strati neuronali e della possibilità di ottenere culture neuronali vitali e fette cerebrali con relativa facilità5.
Figura 1: Cartone animato che illustra le diverse regioni ippocampali e i principali percorsi delle fibre. Le diverse regioni ippocampali sono indicate da linee di colore solido: corteccia entorinale (CE; nero), giro dentato (DG; arancione), Cornu Ammonis (CA) 3 (ciano), 2 (giallo) e 1 (magenta) e subicolo (verde). I percorsi in fibra sono mostrati con una linea tratteggiata colorata: il percorso mediale (MPP, rosso) e laterale perforante (LPP, blu) (dalla corteccia entorinale al giro dentato, CA3, CA1 e subicolo), la via della fibra muschiata (MF, viola) (dal giro dentato a CA3) e il collaterale schaffer (SC, marrone) (ipsilaterale da CA3 a CA1)/percorsi commissurali associativi (AC, verde chiaro) (contralto da CA3 a CA1). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
I protocolli brain slice spesso vengono utilizzati per la perdita di connessioni da aree cerebrali più distanti all’area diinteresse 5. Inoltre, i capillari non sono più funzionali5 e la circolazione sanguigna viene privata11. Nonostante questi limiti, le fette cerebrali sono ancora utilizzate principalmente per lo studio delle funzioni neurofisiofisioiche dell’ippocampo a causa di una serie di vantaggi. In primo luogo, l’estrazione dell’ippocampoè veloce 12 e non richiede molti materiali. Gli unici strumenti essenziali includono un kit di dissezione, un bagno d’acqua di laboratorio, l’accesso al carbogeno e un microtomo vibrante (vibratomo)13. Altre risorse della tecnica della fetta cerebrale sono l’elusione della barriera ematico-encefalica (BBB) e il lavaggio delle molecole rilasciate endogenamente primadell’inizio dell’esperimento 5, che consente di studiare l’effetto dei farmaci con controllo del dosaggio relativamente preciso14. Inoltre, le fette cerebrali preservano i circuiti cito-architettonici e sinaptici all’interno dell’ippocampo15,16,dove la neuroanatomia e l’ambiente locale con connettività neuronale e complesse interazioni neuronale-gliasono preservate 4,11,17. Inoltre, le connessioni in fibra ippocampale sono prevalentemente neuroni unidirezionali e ippocampali hanno un’alta plasticità sinaptica, che semplifica enormemente la raccolta e l’interpretazione di registrazioni elettrofisiotiche di alta qualità al fine di comprendere i processi neurologici18,19. È importante sottolineare che le fette cerebrali presentano una risorsa preziosa applicabile in una vasta gamma di diverse tecniche scientifiche, che vanno dalle tecniche biologiche molecolari alle registrazioni di imaging fino alle misurazioni elettrofisiologiche12,20,21,22,23,24,25,26.
Come accennato in precedenza, le fette cerebrali ippocampali presentano un potente strumento sperimentale per studiare le caratteristiche strutturali e funzionali della connettività sinaptica. Ciò offre l’opportunità di valutare gli effetti di sostanze chimiche o mutazioni sull’eccitabilità neuronale e sulla plasticità16.
I preparati acuti delle fette cerebrali presentano una tecnica relativamente sensibile e la qualità ottimale delle fette dipende fortemente dalle condizioni sperimentali ideali, tra cui l’età dell’animale, il metodo di eutanasia, la velocità di dissezione e affettare, le soluzioni e i parametri di affettare (ad esempio, la velocità di affettare) nonché le condizioni per il recupero dellefette 4. Pertanto, un protocollo ben progettato è della massima importanza e garantisce la riproducibilità tra diverse unità di ricerca13.
Qui, forniamo un protocollo dettagliato per i preparati acuti di fette ippocampali orizzontali, con l’obiettivo di preservare l’integrità del percorso laterale ippocampale e mediale perforante e della via della fibra muschiata, consentendo l’indagine dei processi correlati al giro dentato9. Descriveremo in dettaglio i passaggi chiave per sezionare, estrarre e tagliare orizzontalmente il cervello murino, seguiti dai risultati rappresentativi delle registrazioni calcio-microfluorimetriche e delle registrazioni del potenziale postinaptico eccitatorio sul campo (fEPSPs) in condizioni di base e durante i protocolli di induzione LTP in fette cerebrali di topi selvatici di tipo C57BL/ 6J.
Sebbene comunemente usati tra la comunità delle neuroscienze, i preparati per le fette cerebrali si trovano anche di fronte a diversi svantaggi. Ad esempio, le connessioni di input e output alle aree cerebrali di interesse non sono più collegate in una fetta cerebrale. Inoltre, una volta isolato, il tessuto inizia a degradarsi lentamente nel tempo e questo processo potrebbe alterare le condizioni fisiologiche della fetta cerebrale. Questo argomento in particolare è molto preoccupante perché la maggior parte delle registrazioni delle fette cerebrali durano diversi minuti o ore, il che si traduce in lunghi giorni sperimentali con registrazioni eseguite su tessuti che sono stati isolati fino a 6-8 ore prima dell’inizio dell’esperimento. Inoltre, il liquido cerebrospinale e la circolazione sanguigna vengono interrotti durante i preparati a fette, il che può portare alla mancanza di importanti composti endogeni all’interno di una fetta cerebrale. E, ovviamente, la procedura di affezione stessa può causare danni meccanici ai tessuti che potrebbero compromettere i risultati ottenuti. Tuttavia, i benefici effettivi dei preparati per le fette cerebrali stanno ancora superando i loro svantaggi, motivo per cui presentano una tecnica molto apprezzata e impiegata nella ricerca sulle neuroscienze.
Le fette cerebrali ippocampali acute presentano una tecnica potente e quindi ampiamente utilizzata per indagare i processi neuronali da un livello molecolare fino a complessi studi sul circuito cerebrale. Questo si basa sulla neuroanatomia ideale dell’ippocampo che può essere facilmente conservato in una preparazione di fette18. Di conseguenza, le fette cerebrali ippocampali sono utilizzate in un’ampia varietà di progetti di ricerca scientifica, tra cui screeningfarmacologici 17,studi sulle proprietà neuronali e sinaptiche coinvolte nelle funzioni cognitive40,41e indagini sulle condizioni patologiche delcervello 14,42,43. Tuttavia, un ampio spettro di applicazioni diverse causa anche una vasta gamma di protocolli di preparazione delle fette disponibili che possono differire in vari parametri, come le condizioni di dissezione e l’orientamento del piano di taglio, tra gli altri. Pertanto, l’esatta questione della ricerca di un progetto scientifico deve essere determinata al fine di scegliere un protocollo di preparazione delle sezioni appropriato.
L’elicottero tissutale presenta una delle più antiche tecniche utilizzate per preparare le fette cerebrali ippocampali44,45. I principali vantaggi di questo metodo di preparazione includono il basso costo dell’elicottero e l’uso rapido e facile46. Tuttavia, gli elicotteri tissutali causano stress meccanico che si traduce in alterazioni morfologiche e morte cellulare47. In confronto, il vibratomo è una macchina piuttosto costosa e il tempo per la preparazione delle fette è significativamente aumentato, il che potrebbe avere un impatto sulla qualità della fetta. Tuttavia, il vibratoma di solito offre un modo più delicato di separare le fette dal tessuto e consente di mantenere il cervello ben raffreddato e ossigenato durante l’intera procedura di isolamento, migliorando così le proprietà dellefette 46. Pertanto, diversi gruppi stanno impiegando standardmente questa tecnica e hanno portato avanti protocolli per la preparazione di fette cerebrali ippocampali acute utilizzando il vibratomo16,30,48. Mentre alcuni protocolli forniscono solo alcuni dettagli per l’affettare se stesso, ma piuttosto concentrarsi suun’applicazionespecifica di tale preparazione della fetta 48 , altri forniscono protocolli slice dettagliati che differiscono nel piano di taglio o in altri dettagli del protocollo (ad esempio, incorporamento di agarosio o soluzioni slice / recovery) fornite inquesto articolo 27,30.
Il protocollo qui descritto presenta un metodo semplice per preparare fette acute di cervello di topo ippocampale orizzontali di alta qualità da giovani animali. Il protocollo è particolarmente utile per preservare il percorso perforante (mediale e laterale) che presenta il percorso di input ippocampale, che proietta dalla corteccia entorinale all’ippocampo8,49,50. Le preparazioni di fette trasversali di ippocampo sagittale, coronale e isolate non preservano correttamente il percorso perforante, che proviene principalmente dagli strati II e V della corteccia entorinale e si proietta in diverse aree all’interno dell’ippocampo18. A causa del posizionamento anatomico della corteccia entorinale in relazione all’ippocampo, le fette cerebrali orizzontali sono una necessità per mantenere le fibre del percorso perforante completamente intatte all’interno della preparazione dellafetta 31. Inoltre, l’affezione orizzontale preserva idealmente le fibre muschiato che si proiettano dal giro dentato ai neuroni CA3 all’interno dell’ippocampo9,30,50. Pertanto, questo metodo di preparazione è di alto valore per gli studi che indagano i percorsi di input ippocampali e i processi relativi alla DG. Inoltre, questo protocollo consente l’indagine del percorso collaterale Schaffer50. Tuttavia, i preparati affetta cerebrale sagittale e coronale sono più comunemente usati quando si studiano le proiezioni di fibre da CA3 a CA1, presumibilmente a causa del loro tempo di preparazione leggermente più veloce che può aumentare la possibilità di ottenere fette di alta qualità. Tuttavia, i preparati orizzontali a fette ippocampali presentano un potente strumento di ricerca poiché consente la conservazione e l’indagine di tutte le vie della fibra ippocampale all’interno di un emisfero a una fetta. Ciò può essere particolarmente utile quando le risposte ai circuiti sono studiate, ad esempio, nelle registrazioni di saggi multielettro.
Una delle principali preoccupazioni quando si preparano le fette cerebrali è la corretta conservazione del tessuto cerebrale. Ciò si ottiene con diverse fasi critiche del nostro protocollo, tra cui una dissezione rapida, l’ossigenazione e il raffreddamento continui e sufficienti del tessuto e la protezione del tessuto cerebrale mediante l’uso del metodo di taglio protettivo con una soluzione di affezione a basso contenuto di sodio e ad alto saccarosio39,51. Nonostante il protocollo qui descritto produca un tasso di successo intorno al 90%, potrebbero essere necessarie misure protettive potenzialmente aggiuntive quando si lavora con tessuti derivati da animali più vecchi o geneticamente diversi o quando si cerca di preservare una specifica popolazione cellulare. Diversi metodi sono già stati segnalati per proteggere i preparati sensibili del tessuto cerebrale. Questi metodi includono l’uso di soluzioni di affettamento a base di NMDG per ridurre la permeazione del sodio52,l’uso di alti livelli di magnesio nella soluzione di affettamento al fine di bloccare l’attività del recettore NMDA53,e l’uso prolungato di soluzioni protettive anche durante il periododi recupero 23. Tutte queste misure si tradurranno in una ridotta eccitotossicità. Inoltre, una perfusione trans-cardiale con soluzioni ACSF protettive a freddo freddo viene spesso utilizzata e necessaria quando si lavora con animali più anziani27.
Le fette cerebrali ippocampali acute sono ideali e ampiamente utilizzate per studi elettrofisiologici per motivi come i segnali di ampiezza elevata che possono essere ottenuti da una fetta cerebrale acuta relativamente spessa (300-500 μm), che garantisce un alto rapporto segnale/rumore11. Le applicazioni elettrofisiotiche usate standard includono registrazioni di campi extracellulari e registrazioni intracellulari inter cellulari in modalità tensione o morsetto di corrente. Al fine di acquisire dati elettrofisiologici di alta qualità, la salute della fetta è di primaria importanza e può essere garantita seguendo rigorosamente il protocollo presentato. Tuttavia, poiché i preparati a fette presentano una tecnica altamente sensibile, prima dell’inizio di ogni esperimento dovrebbe essere regolarmente incluso un controllo di qualità. Diversi parametri possono essere utilizzati come controllo di qualità della fetta e vengono valutati standardmente tramite curve input-output e registrazioni fEPSP o EPSC di base19. Tuttavia, va notato che le proprietà elettrofisiologiche non ottimale possono derivare da errori sperimentali come il posizionamento degli elettrodi, l’orientamento o persino i danni e non rappresentano solo la salute della fetta preparata. Pertanto, è consigliabile eseguire ulteriori controlli di qualità come la semplice visualizzazione e valutazione delle cellule sotto un obiettivo 40x o una colorazione del nucleo DAPI. Tali controlli di qualità possono essere utilizzati per confermare l’integrità costante delle sezioni durante diverse sessioni di preparazione delle sezioni.
La microfluorimetria del calcio presenta una tecnica meno comunemente usata per studiare le fette cerebrali ippocampali. Tuttavia, questa tecnica è di valore aggiuntivo per le registrazioni standard di elettrodi extracellulari e intracellulari, in quanto consente di visualizzare e quantificare i flussi di calcio intracellulare, che sono di grande importanza nella segnalazione neuronale e sinaptica. I cambiamenti nelle concentrazioni intracellulari di calcio sono coinvolti nel rilascio di vescicola del neurotrasmettitore, nella generazione di potenziale postinaptico, nella regolazione della plasticità sinaptica e nella conduzione del nervo assonale54,55,56. Come illustrazione di questa tecnica (Figura 4), abbiamo fatto uso di un colorante al calcio disponibile in commercio. Indiscutibilmente, il trattamento delle fette di tessuto con coloranti di calcio può produrre difficoltà come un aumento dei tempi sperimentali e un carico inefficiente delle cellule neuronali situate più in basso. Tuttavia, le variazioni su questa tecnica potrebbero essere utilizzate per aggirare queste sfide tecniche. Ad esempio, è possibile combinare misurazioni del calcio e registrazioni di patch clamp in fette ippocampali. In questo modo, un colorante fluorescente al calcio potrebbe essere caricato in una cella specifica attraverso la pipetta patch, consentendo le misurazioni della dinamica del calcio in una specifica celladi interesse 57. In alternativa, potrebbero essere utilizzati animali geneticamente modificati che esprimono l’indicatore di calcio, GCaMP58, in tutto il cervello o guidati da un promotore specifico per cellule. È interessante notare che il tessuto cerebrale degli animali GCaMP con un linker diretto a una proteina di interesse potrebbe fornire l’opportunità di determinare il modello di espressione neuronale o indagare il coinvolgimento in scintille e onde di calcio.
Complessivamente, forniamo le linee guida per la preparazione di successo di fette cerebrali ippocampali orizzontali sane e vitali dai topi per registrazioni elettrofisiotiche e di imaging. Questa metodologia è molto utile per accedere ai cambiamenti neurologici che si verificano nelle patologie cerebrali descritte nel giro dentato.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo l’unità di elettrofisiologia del VIB-KU Leuven Center for Brain and Disease Research sotto la supervisione del Dr. Keimpe Wierda e del Prof. Inoltre, ringraziamo tutti i membri del Laboratorio di Ricerca del Canale ionico e del Laboratorio di Endometrio, Endometriosi e Medicina Riproduttiva presso il KU Leuven per le loro utili discussioni e commenti.
Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dalla Fondazione per la ricerca-Fiandre (G.084515N e G.0B1819N a J.V.) e dal Consiglio di ricerca del KU Leuven (C1-finanziamento C14/18/106 a J.V.). K.P. è una borsista di ricerca e innovazione FWO [PEGASUS]2 Marie Skłodowska-Curie e ha ricevuto finanziamenti dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell’Unione Europea nell’ambito dell’accordo di sovvenzione Marie Skłodowska-Curie (665501) con la Fondazione di ricerca Fiandre (FWO) (12T0317N). K.H. è post-dottorato della Fondazione per la ricerca fiandre, Belgio (12U7918N).
Anesthesia chamber | home made – Generic | N/A | plexiglas |
Anesthesia vaporizer | Dräger & MSS International Ltd | Isoflurane Vapor 19.3 & MSS Isoflurane | to vaporize isoflurane for rodent anesthetization |
Barrels for the perfusion system | TERUMO | Hypodermic syringes without needle | https://www.terumotmp.com/products/hypodermics/terumo-hypodermic-syringes-without-needle.html |
Bicuculline methiodide | hellobio | HB0893 | https://www.hellobio.com/bicuculline-methiodide.html |
Borosilcate glass capillaries | Science Products | GB150F-8P | https://science-products.com/en/shop/micropipette-fabrication-1/capillary-glass-for-micropipette-pullers/borosilicate-glass-capillaries/borosilicate-filament-polished |
Calcium chlorid dihydrate | Merck | 102382 | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Calcium-chloride-dihydrate,MDA_CHEM-102382?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Calcium Imaging software | Till Photonics | LiveAcquisition v2.3.0.18 | |
Carbogen tank | Air Liquide | Alphagaz mix B50 | Gasmixture CO2/O2: 5/95, purity 5 |
Cluster microelectrode | FHC | CE2C55 | https://www.fh-co.com/product/cluster-microelectrodes/ |
Culture dish (35 mm) | Corning Life Sciences | 353001 | https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2c/US/en/Cell-Culture/Cell-Culture-Vessels/Dishes%2C-Culture/Falcon®-Cell-Culture-Dishes/p/353001 |
Culture dish (90 mm) | Thermo Fisher Scientific | 101VR20 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/101R20#/101R20 |
Curved forceps | Fine Science tools | 11270-20 | https://www.finescience.de/de-DE/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-7b-Forceps/11270-20 |
D-AP5 | hellobio | HB0225 | https://www.hellobio.com/dap5.html |
D-(+)-Glucose monohydrate | Sigma Aldrich | 16301 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/16301?lang=en®ion=BE |
Digital CMOS camera | HAMAMATSU | ORCA-spark C11440-36U | https://www.hamamatsu.com/eu/en/product/type/C11440-36U/index.html |
Dissection scissors | Fine Science tools | 14058-09 | https://www.finescience.de/de-DE/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-ToughCut®/14058-09 |
DNQX | hellobio | HB0262 | https://www.hellobio.com/dnqx-disodium-salt.html |
EMCCD camera | Andor | iXon TM + DU-897E-CSO-#BV | https://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-cameras?gclid=CjwKCAjw97P5BRBQEiwAGflV6ULsKjXfhN2YZxtvsWAmF4QghyXZKuqYHVMa6KU9JyS80ATQkSKeBBoCIM0QAvD_BwE |
EPC10 USB Double Patch Clamp Amplifier | HEKA Elektronik | 895278 | https://www.heka.com/sales/brochures_down/bro_epc10usb.pdf |
Filter paper | VWR | 516-0818 | grade 413 |
Fine brush | Raphael Kaerell | 8204 | Size #1 |
18G needle | Henke Sass Wolf Fine-Ject | 18G X 1 1/2" 4710012040 | https://www.henkesasswolf.de/cms/de/veterinaer_produkte/produkte_vet/einmalkanuelen/hsw_henke_ject_einmalkanuelen/ |
Isoflurane | Dechra Veterinary Products | Iso-Vet 1000mg/g | 250 ml bottle |
Loctite 406 | Henkel Adhesive technologies | Loctite 406 | Super glue |
Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 105886 | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Magnesium-sulfate-heptahydrate,MDA_CHEM-105886?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Micromanipulator | Luigs & Neumann | SM-10 with SM-7 remote control system | https://www.luigs-neumann.org |
Microscope (for calcium imaging) | Olympus | BX51WI | https://www.olympus-lifescience.com/de/microscopes/upright/bx61wi/ |
Microscope (for ephys recordings) | Zeiss | Axio Examiner.A1 | https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/axio+examiner-axio+examiner.a1-aufrechte+mikroskope/10185/ |
Microscope light source | CAIRN Research | dual OptoLed power supply | https://www.cairn-research.co.uk/product/optoled/ |
Monochromator | Till Photonics | Polychrome V | |
N-Methyl-D-aspartic acid (NMDA) | Sigma Aldrich | M3262 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m3262?lang=en®ion=BE |
Oregon Green® 488 BAPTA-1 | Invitrogen Molecular Probes | #06807 | 10x50ug |
Osmometer | Wescor | 5500 vapor pressure osmometer | to verify osmolarity of salt solutions |
Peristaltic pump | Thermo Fisher Scientific | Masterflex C/L 77120-62 | https://www.fishersci.be/shop/products/masterflex-peristaltic-c-l-dual-channel-pump-2/p-8004229 |
pH meter | WTW | inoLab series pH 720 | https://www.geminibv.nl/wp-content/uploads/manuals/wtw-720-ph-meter/wtw-inolab-ph-720-manual-eng.pdf |
Pipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-1000.html |
Potassium chlorid | Chem-lab | CL00.1133 | https://www.chem-lab.be/#/en-gb/prod/1393528 |
Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Potassium-dihydrogen-phosphate,MDA_CHEM-104873?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Razor blade to prepare hemispheres | SPI supplies | Safety Cartridge Dispenser – Pkg/10 | GEM Scientific Single Edge Razor Blades |
Razor blade for vibratome | Ted Pella Inc | 121-6 | double edge breakable style razor blades (PTFE-coated stainless steel) |
Recovery chamber | home made – Generic | N/A | to collect and store brain slices in (see details in manuscript) |
Scissors | Any company | N/A | Blade should be well sharpened and at least 15 cm long for easy decapitation |
Silver electrode wire | Any company | for recording and reference electrodes | |
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Merck | 106342 | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Sodium-dihydrogen-phosphate-dihydrate,MDA_CHEM-106342?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Sodium hydrogen carbonate | Alfa Aesar | 14707 | https://www.alfa.com/en/catalog/014707/ |
Sodium chlorid | Fisher Scientific | S/3160/60 | https://www.fishersci.co.uk/shop/products/sodium-chloride-certified-ar-analysis-meets-analytical-specification-ph-eur/10428420 |
Software for field recordings | HEKA Elektronik | PatchMaster | https://www.heka.com/downloads/software/manual/m_patchmaster.pdf |
Spatula | Sigma Aldrich | S9147-12EA | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s9147?lang=en®ion=BE |
Stimulator | A.M.P.I | ISO-FLEX | http://www.ampi.co.il/isoflex.html |
Sucrose | VWR International Ltd. | 102745C | https://es.vwr-cmd.com/ex/downloads/magazine/lupc_userguide_uk.pdf |
Tubing for carbogen, perfusion and suction lines 1 | Warner Instruments | 64-0167 | Tygon tubing (TY-50) for standard valve systems |
Tubing for carbogen, perfusion and suction lines 2 | Fisher Scientific | 800/100/200 & 800/100/280 | Smiths Medical Portex Fine Bore LDPE Tubing |
Vacuum pump | home made – Generic | N/A | |
8 valve multi-barrel perfusion system | home made | N/A | consists of barrels, tubing and a self-made automated valve control (specifications of all purchased parts can be found in this Table) |
Magnetic valves (to control the perfusion lines) | NResearch Inc. | p/n 161P011 | https://nresearch.com/ |
Vibratome | Leica | 14912000001 | Semi-automatic vibrating blade microomei VT1200 |
Water bath | Memmert | WNB 7 | https://www.memmert.be/wp-content/uploads/2019/09/Memmert-Waterbath-WNB-7.en_.pdf |
Water purification system | Merck | Synergy millipore | to obtain highly purified water |
12-well plates | Greiner Bio-One | CELLSTAR, 665180 | http://www.greinerbioone.com/UserFiles/File/Catalogue%202010_11/UK/3680_005-Kapitel1_UK.pdf |