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Summary
Abstract
Introduction
Protocol
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Discussion
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Inmunología y contagio

Inyección intravítrea y cuantificación de parámetros de infección en un modelo de ratón de endoftlomitis bacteriana

Published: February 06, 2021
doi:
10.3791/61749
, , , , ,
1Department of Microbiology and Immunology,University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Ophthalmology,Dean McGee Eye Institute, 3Dean McGee Eye Institute, 4Department of Cell Biology and Department of Family and Preventive Medicine,University of Oklahoma Health Sciences Center

Summary

Aquí describimos un método de inyección intravítrea y posterior cuantificación bacteriana en el modelo de ratón de endoftalmitis bacteriana. Este protocolo se puede extender para medir las respuestas inmunitarias del huésped y la expresión génica bacteriana y del huésped.

Abstract

Las infecciones bacterianas intraoculares son un peligro para la visión. Los investigadores utilizan modelos animales para investigar los factores huésped y bacteriano y las vías de respuesta inmune asociadas con la infección para identificar dianas terapéuticas viables y para probar fármacos para prevenir la ceguera. La técnica de inyección intravítrea se utiliza para inyectar organismos, fármacos u otras sustancias directamente en la cavidad vítrea en el segmento posterior del ojo. Aquí, demostramos esta técnica de inyección para iniciar la infección en el ojo del ratón y la técnica de cuantificación de bacterias intraoculares. Bacillus cereus se creció en medios líquidos de infusión de corazón cerebral durante 18 horas y resuspended a una concentración de 100 unidades formadoras de colonias (CFU) / 0,5 l. Un ratón C57BL/6J fue anestesiado usando una combinación de ketamina y xilazina. Usando un microinyector picolitr y agujas capilares de vidrio, se inyectó 0,5 l de la suspensión de Bacillus en el vítreo medio del ojo del ratón. El ojo de control contralateral se inyectó con medios estériles (control quirúrgico) o no se inyectó (control absoluto). A las 10 horas después de la infección, los ratones fueron eutanasiados, y los ojos fueron cosechados usando pinzas quirúrgicas estériles y colocados en un tubo que contiene 400 l de PBS estéril y perlas de vidrio estériles de 1 mm. Para elISA o ensayos de mieloperoxidasa, se añadió inhibidor de la proteinasa a los tubos. Para la extracción de ARN, se agregó el búfer de lelisis adecuado. Los ojos se homogeneizaron en un homogeneizador de tejido durante 1-2 minutos. Los homogeneados se diluyeron en serie 10 veces en PBS y la pista se diluyó en placas de agar. El resto de los homogeneizas se almacenaron a -80 oC para ensayos adicionales. Las placas se incubaron durante 24 horas y se cuantificó la CFU por ojo. Estas técnicas resultan en infecciones reproducibles en los ojos del ratón y facilitan la cuantificación de bacterias viables, la respuesta inmune del huésped y la omica de la expresión génica del huésped y del bacteria.

Introduction

La endoftalmitis bacteriana es una infección devastadora que causa inflamación y, si no se trata adecuadamente, puede provocar pérdida de la visión o ceguera. La endoftalmitis es el resultado de la entrada de bacterias en el interior del ojo1,2,3,4,5. Una vez en el ojo, las bacterias se replican, producen toxinas y otros factores nocivos, y pueden causar daños irreversibles a las delicadas células y tejidos de la retina. El daño ocular también puede ser causado por inflamación, debido a la activación de vías inflamatorias que conducen a la entrada de células inflamatorias en el interior del ojo1,5,6. La endoftalmitis puede ocurrir después de una cirugía intraocular (postoperatoria), una lesión penetrante en el ojo (postraumático) o por propagación metastásica de bacterias en el ojo desde un sitio anatómico diferente (endógeno)7,8,9,10. Los tratamientos para la endoftalmitis bacteriana incluyen antibióticos, medicamentos antiinflamatorios o intervención quirúrgica3,4,11. Incluso con estos tratamientos, la visión o el propio ojo pueden perderse. El pronóstico visual después de la endoftalmitis bacteriana generalmente varía dependiendo de la eficacia del tratamiento, la agudeza visual en la presentación y la virulencia del organismo infectante.

Bacillus cereus (B. cereus) es uno de los principales patógenos bacterianos que causa endoftalmitis postraumática7,12. La mayoría de los casos de endoftalmitis de B. cereus tienen un curso rápido, lo que puede resultar en ceguera en pocos días. Las señas de identidad de B. cereus endophthalmitis incluyen inflamación intraocular en rápida evolución, dolor ocular, pérdida rápida de agudeza visual y fiebre. B. cereus crece rápidamente en el ojo en comparación con otras bacterias que comúnmente causan infecciones oculares2,4,12 y posee muchos factores de virulencia. Por lo tanto, la ventana para la intervención terapéutica exitosa es relativamente corta1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25. Los tratamientos para esta infección suelen tener éxito en el tratamiento de la endoftalmitis causada por otros patógenos menos virulentas, pero la endoftalmitis de B. cereus suele dar lugar a más del 70% de los pacientes que sufren de pérdida significativa de la visión. Alrededor del 50% de esos pacientes se someten a evisceración o enucleación del ojo infectado7,16,22,23. La naturaleza destructiva y rápida de B. cereus endophthalmitis requiere un tratamiento inmediato y adecuado. Los recientes progresos en el discernimiento de los mecanismos subyacentes del desarrollo de enfermedades han identificado objetivos potenciales para la intervención19,26,27. Los modelos experimentales de ratón de B. cereus endophthalmitis siguen siendo útiles para discernir los mecanismos de infección y probar posibles terapias que pueden prevenir la pérdida de la visión.

La infección intraocular experimental de ratones con B. cereus ha sido un modelo instrumental para comprender los factores bacterianos y de acogida, así como sus interacciones, durante la endoftalmitis28. Este modelo imita un evento postraumático o postoperatorio, en el que las bacterias se introducen en el ojo durante una lesión. Este modelo es altamente reproducible y ha sido útil para probar terapias experimentales y proporcionar datos para mejoras en el estándar de atención1,6,19,29,30. Al igual que muchos otros modelos de infección, este modelo permite el control independiente de muchos parámetros de infección y permite un examen eficiente y reproducible de los resultados de la infección. Los estudios en un modelo similar en conejos en las últimas décadas han examinado los efectos de los factores de virulencia de B. cereus en los ojos2,4,13,14,31. Mediante la inyección de cepas mutantes de B. cereus que carecen de factores de virulencia individuales o múltiples, la contribución de estos factores de virulencia a la gravedad de la enfermedad se puede medir mediante resultados tales como la concentración de bacterias en diferentes horas de postinfección o la pérdida de la función visual13,14,27,31,32. Además, los factores anfitriones se han examinado en este modelo infectando cepas de ratón knockout que carecen de factores de acogida inflamatorios específicos26,29,33,34,35. El modelo también es útil para probar posibles tratamientos para esta enfermedad mediante la inyección de nuevos compuestos en el ojo después de la infección30,36. En este manuscrito, describimos un protocolo detallado que incluye infectar un ojo de ratón con B. cereus,cosechar el ojo después de la infección, cuantificar la carga bacteriana intraocular y preservar muestras para ensayar parámetros adicionales de la gravedad de la enfermedad.

Protocol

Todos los procedimientos se realizaron siguiendo las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y la Declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología para el Uso de Animales en la Investigación Oftálmica y De la Visión. Los protocolos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Oklahoma (números de protocolo 15-103, 18-043 y 18-087). 1. Agujas de…

Representative Results

La generación de un inóculo reproducible y la precisión del procedimiento de inyección intravítrea son pasos clave en el desarrollo de modelos de endoftalmitis microbiana. Aquí, demostramos el procedimiento de inyección intravítrea usando Gram-positivo Bacillus cereus. Inyectamos 100 UFC/0,5 l de B. cereus en el medio vítreo de cinco ratones C57BL6. Después de 10 h postinfección, observamos crecimiento intraocular de B. cereus a aproximadamente 1,8 x 105 CFU/ojo. <strong c…

Discussion

Incluso con la disponibilidad de antibióticos potentes, medicamentos antiinflamatorios y cirugía de vitrectomía, la endoftalmitis bacteriana puede cegar a un paciente. Los estudios clínicos han sido útiles en el estudio de la endoftalmitis; sin embargo, los modelos experimentales de endoftalmitis proporcionan resultados rápidos y reproducibles que se pueden traducir al progreso en el estándar de atención, lo que resulta en un mejor resultado visual para los pacientes.

El volumen vítre…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen al Dr. Feng Li y Mark Dittmar (OUHSC P30 Live Animal Imaging Core, Dean A. McGee Eye Institute, Oklahoma City, OK, USA) por su ayuda. Nuestra investigación ha sido apoyada por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud R01EY028810, R01EY028066, R01EY025947 y R01EY024140. Nuestra investigación también ha sido apoyada por P30EY21725 (beca NIH CORE para imágenes y análisis de animales vivos, biología molecular e imágenes celulares). Nuestra investigación también ha sido apoyada por el programa de entrenamiento predoctoral NEI Vision Science 5T32EY023202, una beca de apoyo a la investigación de la Fundación Presbiteriana de Salud y una subvención sin restricciones al Dean A. McGee Eye Institute de Investigación para Prevenir la Ceguera.

Materials

2-20 µL pipette RANIN L0696003G NA
37oC Incubator Fisher Scientific 11-690-625D NA
Bacto Brain Heart Infusion BD 90003-032 NA
Cell Microinjector MicroData Instrument, Inc. PM2000 NA
Fine tip forceps Thermo Fisher Scientific 12-000-122 NA
Glass beads 1.0 mm BioSpec 11079110 NA
Incubator Shaker New Brunswick Scientific NB-I2400 NA
Microcapillary Pipets 5 Microliters Kimble 71900-5 NA
Micro-Pipette Beveler Sutter Instrument Co. BV-10 NA
Microscope Axiostar Plus Zeiss NA
Microscope OPMI Lumera Zeiss NA
Mini-Beadbeater-16 BioSpec Model 607 NA
Multichannel pipette 30-300 µL Biohit 15626090 NA
Multichannel pipette 5-100 µL Biohit 9143724 NA
Needle/Pipette Puller Kopf 730 NA
PBS GIBCO 1897315 Molecular grade
Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693159001 Molecular grade
Reverse action forceps Katena K5-8228 NA
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Mursalin, M. H., Livingston, E., Coburn, P. S., Miller, F. C., Astley, R., Callegan, M. C. Intravitreal Injection and Quantitation of Infection Parameters in a Mouse Model of Bacterial Endophthalmitis. J. Vis. Exp. (168), e61749, doi:10.3791/61749 (2021).
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