דגימה קריוגנית נטענת לתוך זווית קסם ספינינג ספקטרומטר תהודה מגנטית גרעינית המשמרת את הכדאיות התאית

1. תרבות והקפאה של תאי יונקים תרבות וקצירת תאי יונקים להפשיר aliquot של תאי כליה עוברית אנושית קפואה (HEK 293). תרבית HEK 293 תאים במדיה צמיחה (למשל, DMEM עם 10% סרום בקר עוברי ו 1% Pen-סטרפטוקוף) ב 37 °C עם 5% CO2 ב 100 מ”מ לוחות לשניים עד שלושה מעברים (7-10 ימים). לפצל את התאים ואת התרבות בצלחת 150 מ”מ עד התאים להשיג 90-95% השפעה.הערה: צלחת 150 מ”מ במפגש > 90% תספיק למילוי שני רוטורים ספיר בקוטר של 3.2 מ”מ. קציר תאים באמצעות 4 מ”ל של טריפסין (ראה טבלת חומרים) ו 10 מ”ל של מדיה. מעבירים את המתלים לחרוט סטרילי של 15 מ”ל וצנטריפוגה ב-673 x גרם (1000 סל”ד) למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את סופר-טבעי. לשטוף את גלולה התא עם תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS) (pH 7.4, −CaCl2, −MgCl2). קריוהגנה על תאים לאסוף גלולה תא 50 μL בצינור microcentrifuge. הכן תערובת של 50 μL של PBS ו 18 μL של גלילצל בצינור נפרד. מערבבים בעדינות את גלולה 50 μL תא עם 68 μL של תערובת גלצל-PBS על ידי הוספת תערובת גליצל-PBS לחלק העליון של הכדור ו שימוש חוזר את הכדור על ידי הקשה עדינה על הצד של הצינור עד שלא נותרו גושים.הערה: צנרת עדינה יכולה לשמש גם כדי resuspend התא, עם זאת, לוודא כי שלמות הסלולר אינו נפגע. 2. שימור קריופרציה של תאי יונקים ברוטור NMR העברת תאים לרוטור ספיר 3.2 מ”מ. כדי להפוך משפך, לחתוך קצה פיפטה 200 μL ולהכניס את הקצה הצר של קצה פיפטה לחתוך לתוך רוטור 3.2 מ”מ. מעבירים את התאים למשפך היושב על הרוטור. מניחים את הרוטור יחד עם המשפך בצינור microcentrifuge וכדור את התאים לתוך החלק התחתון של הרוטור על ידי צנטריפוגה ב 673 x g במשך 2-3 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את supernatant וכל דגימה עודפת מן הרוטור. חזור על שני שלבים אלה עד שהרוטור יהיה מלא בתאים.הערה: לחלופה, לקבוע את הכדאיות התאית של המדגם לפני הקפאה. Resuspend 10 μL של גלולה תא עודף ב 100 μL של DMEM ללא FBS. ערבבו 10 μL של המתלה עם פתרון כחול טריפן 0.4% ולהעריך מיד את הכדאיות באמצעות מונה תאים אוטומטי. השתמש רק במדיה ללא FBS כדי לדלל תאים כאשר סרום מפריע להכתמת כחול טריפן. אטמו את הרוטור באמצעות תקע סיליקון באמצעות כלי אריזה זמין מסחרית. סגור את הרוטור עם קצה כונן קרמי על ידי לחיצה אנכית כלפי מטה. הימנעו מלגעת בסנפירים העדינים בצד קצה הכונן. סמן חצי מהקצה התחתון של רוטור הספיר עם סמן קבוע כסוף ואת החצי השני של הקצה התחתון של הרוטור עם סמן קבוע שחור כדי לאפשר ניטור מדויק של ספינינג של הרוטור בתוך הספקטרומטר.הערה: פגמים בסימון הרוטור ימנעו ספירה מדויקת של תדר הסיבוב, וכתוצאה מכך הכישלון להשיג ספינינג יציב. מכיוון שסמנים לא יכתבו על רוטור קפוא והתחממות הרוטור פוגעת בשלמות המדגם, סימון הרוטור לפני ההקפאה הוא צעד קריטי. הקפאה של תאים בתוך רוטור ספיר 3.2 מ”מ. מניחים כרית המיוצרת על ידי פיסת טישו או מגבת נייר מתחת למכסה ובתחתית הקרבון הקריוגני (ראו שולחן חומרים).הערה: נייר הטישו מגן על סימון הרוטור מפני נזק שנגרם על ידי נתקל בצדדים של בקבוקונים קריוגניים. מניחים את רוטור הספיר 3.2 מ”מ לתוך הנקניקייה הקריוגנית מרופדת בנייר הטישו עם קצה מסומן הפונה לתחתית הנקניקייה הקריוגנית. להקפיא את הרוטור על ידי הצבת את הנקניקייה cryogenic לתוך קצב מבוקר (-1 °C/min) מיכל קירור ומניחים את המיכל במקפיא -80 °C למשך מינימום של 3 שעות. מעבירים את ההקמה הקריוגנית המכילה את הרוטור הקפוא לאחסון חנקן נוזלי. 3. העברה קריוגנית של דגימה קפואה לספקטרומטר NMR להעביר את הדגימה הקפואה למתקן NMR. מעבירים את ההמולה הקריוגנית המכילה את הרוטור הקפוא לערוע קטן מלא בחנקן נוזלי להובלה למתקן NMR. מעבירים רוטור קפוא לאמבט החנקן הנוזלי. מלאו קצף פה רחב יבש ומבודד תרמית עם 500 מ”ל – 1 ליטר של חנקן נוזלי. מעבירים את הרוטור מהביחון הקריוגני לקצף הפה הרחב מלא בחנקן נוזלי. קח את הגעיף הקריוגני מן dewar ההעברה ביד להחזיק אותו ממש מעל פני השטח של החנקן הנוזלי כדי להגן עליו מפני האטמוספירה. תוך כדי החזקת הגבעול הקריוגני כשהפה מצביע מעט כלפי מטה, פתחו את המכסה ותנו לרוטור להחליק לתוך אמבט החנקן הנוזלי.הערה: לאחר המכסה הוא פתח, הרוטור חייב ליפול מן הגבעול cryogenic לתוך אמבט חנקן נוזלי במהירות (מתחת 1 שנייה) כדי למנוע עיבוי מאיסוף על הרוטור. אידוי של חנקן נוזלי יוצר “ענן חנקן” בקצף הפה הרחב dewar ומונע עיבוי על הרוטור לפני שהוא שקוע לתוך החנקן הנוזלי. חשיפה ארוכה יותר של הרוטור לאוויר עלולה להוביל לעיבוי הלחות על קירות הרוטור אשר יתעבה מחדש לקרח. העברה קריוגנית של רוטור ללוכד מדגם NMR. Prechill צינור microcentrifuge 1.5 מ”ל על ידי טביעתו באמבט חנקן נוזלי. אל תסגור את הצינור.הערה: בדוק את הרוטור לפני ההעברה לתוך צינור microcentrifuge. באמצעות פינצטה, להחזיק את הרוטור ממש מתחת לפני השטח של החנקן הנוזלי ולבדוק כי סימוני הרוטור הם שלמים, כי אין מרבצי קרח נוצרו על קירותיו וכי קצה הכונן הוא שלם. מרבצי קריסטל קרח על קירות הרוטור מופיעים כאבקה לבנה. היזהר תמיד להחזיק את הרוטור על ידי גופו ולא על ידי קצה הכונן. אין לגרד את הסימון את הרוטור עם טיפים פינצטה. מתחת לפני השטח של אמבט החנקן הנוזלי, השתמש בפינצטה כדי להעביר את הרוטור לצינור microcentrifuge עם קצה הכונן הפונה לתחתית צינור microcentrifuge ואת הסימנים מול פתיחת הצינור.הערה: תמיד יבש פינצטה לפני שקוע בחנקן נוזלי או לגעת רוטור. באמצעות פינצטה, להחזיק את הצינור המכיל את הרוטור תחת חנקן נוזלי על ידי הצוואר שלה. עם זוג נוסף של פינצטה ביד, להיות מוכן להטביע את לוכד מדגם NMR באמבט חנקן נוזלי להחזיק אותו, כך שהוא נוטה בזווית חריפה ביחס צינור microcentrifuge.הערה: מזער את הזמן שבו לוכד הדגימה נמצא במגע עם החנקן הנוזלי כדי למנוע הקפאת טבעת ה- O. אם טבעת ה-O תקפא, יהיה קשה מאוד להכניס את התופס לספקטרומטר. העברת רוטור קריוגנית מתופס מדגם NMR לספקטרומטר NMRהערה: שלב זה דורש שני אנשים, אחד להפעיל את cryocabinet ואחד להעביר את המדגם מן החנקן הנוזלי לתוך הבדיקה. מקם את הקריוקאבינט במצב פליטה על-ידי לחיצה על ‘EJECT’ בארון.הערה: מצב הפליטה מטהר את זרימת גז החנקן היבש והקר בלחץ גבוה מהגשוש לאטמוספירה כדי למנוע כניסה של לחות אטמוספרית. העבר את הרוטור לתוך לוכד מדגם NMR. הכנס את הקצה הפתוח של לוכד מדגם NMR לתוך צינור microcentrifuge בעוד עדיין מתחת לפני השטח של החנקן הנוזלי. הרם הן את צינור microcentrifuge והן את לוכד מדגם NMR כדי לאפשר לרוטור ליפול לתוך לוכד הדגימה. לנער את לוכד מדגם NMR וצינור microcentrifuge במקרה הרוטור תקוע על שפתו של לוכד המדגם. השאירו את צינור microcentrifuge הריק על גבי לוכד מדגם NMR כדי להגן על הרוטור מהאוויר. הסר את לוכד מדגם NMR הריק האחר מהגשוש והנח אותו על הרצפה. העבר את לוכד מדגם NMR המכיל את הרוטור ליד החופשית שלך, להסיר את צינור microcentrifuge ולהכניס אותו מיד לתוך הבדיקה.הערה: אם טבעת O קופאת, יהיה קשה להדק את לוכד הדגימה. תמשיך להפעיל כוח עד שהוא יחליק למקומו. אותת לאדם המפעיל את הקריוקאבינט ל- ‘STOP EJECT’ ו- ‘INSERT’.הערה: מצב ההוספה מנחה את הרוטור מהתופס לדוגמה אל הגשוש. סובב את המדגם לקצב הסיבוב הרצוי (לדוגמה, 12 קילו-הרץ) על-ידי התאמת לחץ הזרימה והמסב ונשנה הנשלט על-ידי הקריוקאבינט. (למשל, הגדל באופן מיידי את הגז הנושא ל- ~ 200 mBar ואת גז הכונן ל 10 mBar. ברגע המדגם מסתובב, להגדיל את גז הנושא ל 1000 מ”ר ולהניע גז ל 200 mBar. כמו ספינינג מתייצב, להגדיל את המסבים ל 2400 mBar ולאחר מכן להגדיל את גז הכונן מ 200 mBar ל 1700 mBar על פני מספר דקות. VT גז קירור קבוע ב ~ 1070 L / h.)הערה: בעת הרמת צינור microcentrifuge ותופס מדגם NMR מתוך אמבט חנקן נוזלי, ודא כי צינור microcentrifuge יש מספיק חנקן נוזלי בתוכו כדי להקיף את הרוטור. מזער את הזמן בין העברת הרוטור לתוך לוכד מדגם NMR והכנסת לוכד מדגם NMR לתוך הספקטרומטר. כל השלבים ב-3.4 צריכים להסתיים בתוך 30. 4. הסרה קריוגנית של המדגם מספקטרומטר NMR הכנת אמבט החנקן הנוזלי והבינה הקריוגנית יוצקים 500 מ”ל – 1 ליטר של חנקן נוזלי לתוך קצף הפה הרחב dewar ומניחים את האמבטיה מתחת ספקטרומטר. תרגיע את הנקניקון הקריוגני. תטביעו את הנקניקייה הקריוגנית הריקה המכילה פיסת נייר טישו באמבט החנקן הנוזלי. העברה קריוגנית של רוטור מבדיקה לחקירה קריוגנית הפחת את קצב הסיבוב ל- 0 kHz על-ידי הרחבת זרימת הגז בנהיגה ונושאת ופלט את הרוטור על-ידי מעבר למצב הפליטה. שמור על מצב הפליטה על, להסיר את לוכד המדגם מן הבדיקה, טיפת רוטור ישירות לתוך dewar קצף הפה הרחב המכיל חנקן נוזלי. בעזרת פינצטה מצוננת מראש, מעבירים את הרוטור לחקירה קריוגנית מצוננת מראש מתחת לפני השטח של החנקן הנוזלי. תכובע את הנקניקון הקריוגני. הקדימו את מכסה הנקניקיון הקריוגני על ידי טבילתו בחנקן נוזלי. הסר את הקוקייה cryogenic המכיל את הרוטור וחנקן נוזלי מן האמבטיה ואת מכסה את הצינור עם כובע prechilled. אין להדק את המכסה כך שניתן יהיה לשחרר בבטחה חנקן מתאדה. תטביע מחדש את המכיין הקריוגני בחנקן נוזלי. המדגם יכול להיות מועבר לאחסון חנקן נוזלי לטווח ארוך יותר או לפרוק מיד לניתוח נוסף. 5. פרקת מדידות רוטור ותכשירות פרק רוטור ומדידת הכדאיות מדיה חופשית בסרום חם מראש (DMEM) או PBS ל 37 °C (7 °F). מוציאים רוטור מחנקן נוזלי. הסר קצה כונן ותקע סיליקון.הערה: ספיר הוא מוליך חום מעולה. הימנעו מלגעת ברוטור באצבעות מכיוון שהעברת חום עלולה לגרום לאירועי הפשרת הקפאה מקומיים שפוגעים ביכולות התאית. מדידת הכדאיות הוסף 20 μL של מדיה חמה לכדור התא הקפוא ברוטור ותאים resuspend. הסר מתלה עם pipette ולערבב את המתלים עם 100 μL של מדיה. הסר 10 μL של השעיית תא ולערבב עם נפח שווה של 0.4% פתרון כחול טריפן (v / v). דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 s עד 1 דקות. מדוד את הכדאיות באמצעות מונה תאים אוטומטי.