Neutron Radiography and Computed Tomography of Biological Systems at the Oak Ridge National Laboratory's High Flux Isotope Reactor

Hassina  Z. Bilheux; Maria Cekanova; Jeffrey  M. Warren; Matthew  J. Meagher; Ryan D. Ross; Jean  C. Bilheux; Singanallur Venkatakrishnan; Jiao  Y.Y. Lin; Yuxuan Zhang; Matthew  R. Pearson; Erik Stringfellow

doi:10.3791/61688

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Biología

Radiografía de neutrones y tomografía computarizada de sistemas biológicos en el reactor de isótopos de alto flujo del Laboratorio Nacional de Oak Ridge

Published: May 07, 2021

doi:

10.3791/61688

Hassina Z. Bilheux*¹, Maria Cekanova*^2,3,4, Jeffrey M. Warren*⁵, Matthew J. Meagher⁶, Ryan D. Ross⁶, Jean C. Bilheux^1,7, Singanallur Venkatakrishnan⁸, Jiao Y.Y. Lin^1,9, Yuxuan Zhang¹, Matthew R. Pearson^9,10, Erik Stringfellow¹

¹Neutron Scattering Division,Oak Ridge National Laboratory, ²College of Veterinary Medicine,The University of Tennessee, ³UT-ORNL Graduate School of Genome, Science and Technology,The University of Tennessee, ⁴Integrity Laboratories, ⁵Environmental Sciences Division,Oak Ridge National Laboratory, ⁶Department of Cell & Molecular Medicine, Rush Medical College,Rush University, ⁷Computer Science and Mathematics Division,Oak Ridge National Laboratory, ⁸Electrification and Energy Infrastructures Division,Oak Ridge National Laboratory, ⁹Now at Second Target Station Project,Oak Ridge National Laboratory, ¹⁰Neutron Technologies Division,Oak Ridge National Laboratory

Summary

Este manuscrito describe un protocolo para la radiografía de neutrones y la tomografía computarizada de muestras biológicas utilizando una línea de luz CG-1D del reactor de isótopos de alto flujo (HFIR) para medir un implante metálico en un fémur de rata, un pulmón de ratón y un sistema de raíces / suelo de plantas herbáceas.

Abstract

Los neutrones se han utilizado históricamente para una amplia gama de aplicaciones biológicas empleando técnicas como la dispersión de neutrones de ángulo pequeño, el eco de espín de neutrones, la difracción y la dispersión inelástica. A diferencia de las técnicas de dispersión de neutrones que obtienen información en el espacio recíproco, las imágenes de neutrones basadas en la atenuación miden una señal en el espacio real que se resuelve en el orden de decenas de micrómetros. El principio de la imagen de neutrones sigue la ley de Beer-Lambert y se basa en la medición de la atenuación de neutrones a granel a través de una muestra. Una mayor atenuación es exhibida por algunos elementos ligeros (en particular, hidrógeno), que son componentes principales de las muestras biológicas. Los agentes de contraste como el deuterio, el gadolinio o los compuestos de litio se pueden usar para mejorar el contraste de manera similar a como se hace en las imágenes médicas, incluidas técnicas como imágenes ópticas, imágenes por resonancia magnética, rayos X y tomografía por emisión de positrones. Para los sistemas biológicos, la radiografía de neutrones y la tomografía computarizada se han utilizado cada vez más para investigar la complejidad de la red de raíces de plantas subterráneas, su interacción con los suelos y la dinámica del flujo de agua in situ. Además, se han explorado los esfuerzos para comprender los detalles de contraste en muestras de animales, como tejidos blandos y huesos. Este manuscrito se centra en los avances en bioimagen de neutrones, como la preparación de muestras, instrumentación, estrategia de adquisición de datos y análisis de datos utilizando la línea de haz de imágenes de neutrones CG-1D del reactor de isótopos de alto flujo. Las capacidades antes mencionadas se ilustrarán utilizando una selección de ejemplos en fisiología vegetal (planta herbácea / sistema de raíces / suelo) y aplicaciones biomédicas (fémur de rata y pulmón de ratón).

Introduction

El principio de la radiografía de neutrones (nR) se basa en la atenuación de los neutrones a través de la materia que atraviesan. A diferencia de los rayos X que son dispersados por la nube de electrones de un átomo, los neutrones pueden ser absorbidos o dispersados por su núcleo. Los neutrones son sensibles a los elementos ligeros, como el hidrógeno (H), y en consecuencia pueden utilizarse para aplicaciones biológicas radiográficas como tejidos animales 1,2,3,4,5,6,7 o humanos ^8,9 y sistemas subterráneos de suelo/raíces 10,11,12,13,14 ^,¹⁵. La imagen de neutrones es una técnica complementaria a la imagen de rayos X, que es capaz de detectar elementos pesados^16,17,18. El nR basado en la atenuación se rige por los coeficientes de atenuación lineal de los materiales dentro de la muestra y por el espesor de la muestra, como se describe en la ley de Beer-Lambert, que establece que el haz transmitido es directamente proporcional a la cantidad de material y la longitud del camino a través del material. Por lo tanto, la transmitancia, T, se puede calcular como:

(1)

donde I ₀ e I son, respectivamente, las intensidades del haz incidente y transmitido; μ y x son el coeficiente de atenuación lineal y el espesor de una muestra homogénea, respectivamente. El coeficiente de atenuación μ viene dado por:

(2)

donde σ es la sección transversal de atenuación de neutrones de la muestra (tanto dispersión como absorción), ρ es su densidad, N_A es el número de Avogadro y M es su masa molar.

El contraste en la radiografía de muestras biológicas que utilizan neutrones de baja energía (es decir, energías inferiores a 0,5 eV) se debe principalmente a un cambio en la densidad de H (para un espesor de muestra fijo). Esto se debe a la probabilidad de interacción de un neutrón con el núcleo H, que es mayor que con otros núcleos presentes en muestras biológicas, y al hecho de que la densidad del átomo de H es primordial ya que es el átomo más abundante en muestras biológicas.

Desde sus primeras etapas, nR y la tomografía computarizada de neutrones (nCT) se han utilizado ampliamente para aplicaciones de materiales e ingeniería 19,20,21,22,23. Los primeros experimentos de demostración de sensibilidad neutrónica al H en muestras biológicas comenzaron a mediados de la década de 1950²⁴ con las mediciones de especímenes de plantas. El trabajo continuó durante la década de 1960 con, por ejemplo, la radiografía de un tórax humano²⁵ o ratas²⁶, en la que se exploró el uso de agentes de contraste, como el óxido de gadolinio (Gd₂O₃). Además, se planteó la hipótesis de que el contraste en el tejido tumoral humano frente al tejido normal se debía a un aumento local en el contenido de H. Durante estos ensayos iniciales, se concluyó que el aumento del flujo de neutrones y la resolución espacial mejoraría la calidad de nR y probablemente aumentaría su popularidad como técnica complementaria para aplicaciones industriales o biomédicas. Los estudios más recientes comprenden mediciones de nR y nCT realizadas en muestras de tejido canceroso¹ y secciones de órganos animales ^2,3,27 para aplicaciones biomédicas y forenses.

Ubicado en el Laboratorio Nacional de Oak Ridge, Oak Ridge, TN, el Reactor de Isótopos de Alto Flujo (HFIR) es una poderosa fuente de neutrones que produce neutrones por reacción de fisión. Estos neutrones tienen energías del orden de 2 MeV y son “enfriados” en la piscina del reactor por reacciones cinéticas con agua pesada para alcanzar energías del orden de 100-300 eV. La optimización de un experimento de neutrones, ya sea dispersión o imagen, comienza con la comprensión de la fuente de neutrones y las propiedades de la línea de luz, como la intensidad del haz, la distribución de energía y el efecto del fondo (neutrones rápidos, neutrones retardados, rayos gamma). En la sala de guía fría HFIR donde se encuentra la línea de luz de imágenes, los neutrones se “enfrían” aún más por interacciones cinéticas con un moderador H líquido. Luego se transportan en un sistema de guía curvo lejos de la línea de visión de la fuente, eliminando así los neutrones rápidos y la contaminación gamma. Como se ilustra en la Figura 1, la línea de haz de imágenes de neutrones^{CG-1D 28,29} se coloca en una guía fría, lo que implica que el rango de energía de neutrones varía de unos pocos meV a unas pocas decenas de eV (en este caso^, la longitud de onda de neutrones utilizable correspondiente varía de 0.8 a 10 Å) con un flujo en el rango de 10⁷ n / (cm²∙s) en la posición de la muestra. Un sistema motorizado de apertura/difusor define la geometría estenopeica del instrumento de imagen. Los neutrones viajan una distancia de 6,59 m en un tubo de vuelo lleno de helio (He) con ventanas de aluminio (Al) en cada extremo. Los tubos de vuelo se utilizan para transportar neutrones al tiempo que limitan la dispersión del aire de tal manera que la pérdida en la intensidad del haz sea mínima. Para las mediciones descritas en este manuscrito, el difusor está hecho de un nanopolvo de óxido de aluminio de 50 nm (Al₂O₃) de 1 mm de espesor encerrado en un recipiente de Al. El difusor reduce los artefactos del haz provenientes de la guía de neutrones (que se magnifican por la geometría estenopeica de una línea de luz de imagen), de lo contrario, las fluctuaciones de intensidad horizontales y verticales agudas son visibles en la radiografía y la normalización de los datos se vuelve un desafío. Para los experimentos ilustrados aquí, los neutrones se convierten en luz utilizando un fluoruro de litio-6 de 25 μm de espesor / fósforo de sulfuro de zinc (⁶LiF / ZnS: Ag).

La optimización de la colimación depende de la posición de la muestra al detector, la resolución espacial requerida y el tiempo de adquisición. Cuando la muestra se encuentra a pocos cm del centelleador, las colimaciones altas (L / D por encima de 800, donde L es la distancia desde la apertura del agujero de alfiler del diámetro, D y el detector) producen una mejor resolución espacial a costa del flujo de neutrones. La baja colimación (L/D por debajo de 800) es preferible para estudios dinámicos in situ cuando la resolución temporal prevalece sobre la resolución espacial. Para las mediciones descritas en este manuscrito, L/D y resolución espacial fueron aproximadamente 355 y 75 μm, respectivamente. La resolución temporal varió en función de la relación señal-ruido (SNR). La muestra se colocó lo más cerca posible del centelleador para reducir la distorsión geométrica, como el desenfoque. Las etapas de traslación y rotación están disponibles para colocar la muestra cerca de los detectores y realizar la tomografía computarizada (TC). CG-1D ofrece tres tipos de detectores: un dispositivo de carga acoplada (CCD) con 2048 píxeles x 2048 píxeles con un paso de píxeles de 13,5 μm, un detector científico complementario de semiconductores de óxido metálico (sCMOS) con 2560 píxeles x 2160 píxeles con un paso de píxeles de 6,5 μm, y un detector de placa de microcanal (MCP)^30,31 con 512 píxeles x 512 píxeles con un tamaño de píxel de 55 μm. Los neutrones dispersos se absorben con goma de boro de ~ 5 mm de espesor para proteger el chip detector de ver neutrones. Esta absorción genera rayos gamma que pueden ser detenidos por el plomo (Pb) colocado entre la goma de boro y el detector. Cada detector está optimizado para un campo de visión (FOV) diferente, así como para resoluciones espaciales y temporales. Para las mediciones del fémur de rata y el pulmón del ratón, se utilizó el detector CCD por su gran capacidad FOV (~ 7 cm x 7 cm) y una resolución espacial razonable de aproximadamente 75 μm. La nCT del sistema radicular/suelo de la planta se realizó con el sCMOS, ya que el objetivo era adquirir nCT lo más rápido posible a costa del campo de visión (que se limitó a ~ 5 cm x 4,2 cm); Por lo tanto, la resolución espacial evidentemente sufrió. En estos detectores, los neutrones se convierten en luz o en una partícula alfa para fines de detección. La rotación de la muestra alrededor de su eje vertical y la adquisición de radiografías en ángulos de rotación consecutivos permite la adquisición de nCT. El modelo de renderizado volumétrico tridimensional de la muestra bajo investigación se obtiene utilizando el portátil interno de retroproyección filtrada (FBP) Jupyter basado en python iMARS3D, pyMBIR o un software comercial, todo lo cual se describe a continuación.

Finalmente, los neutrones que no han interactuado con la muestra o el detector se recogen en una posición de parada del haz aproximadamente 1 m aguas abajo del sistema detector para minimizar el ruido de fondo. El tope de viga CG-1D tiene 0,75 m de ancho, 0,5 m de alto y 35 mm de grosor y está hecho de B₄C en epoxi. El tope del haz está reforzado con 10 mm de carbonato de litio enriquecido al 95% (6 Li₂CO₃) en un epoxi resistente al fuego donde el haz de neutrones golpea, con una cavidad revestida con ⁶Li, plomo (Pb) y acero diseñado para contener la alta tasa de rayos gamma secundarios. El tope de la viga está directamente unido a la pared de blindaje de acero de la línea de luz. Una fotografía de la línea de luz CG-1D se da en la Figura 2.

Se utilizaron tres programas de reconstrucción para reconstruir los tres datos experimentales en 3D, respectivamente. La reconstrucción de la muestra de pulmón de ratón se realizó utilizando Octopus³², un software de reconstrucción comercial que utiliza FBP. El software Octopus se encuentra en una PC servidor y se puede utilizar para reconstruir los datos recopilados en la línea de luz. Un software de reconstrucción, llamado iMARS3D, está disponible en CG-1D. Se basa en el código fuente abierto TomoPY³³ con características añadidas como corrección automática de inclinación, filtros de post-procesamiento, etc. iMARS3D incluye el preprocesamiento de los datos (resta del fondo y el ruido), el recorte, el filtrado de medianas (para corregir los rayos gamma y los píxeles muertos), la corrección automatizada de la fluctuación de la intensidad del haz y la corrección de la inclinación de la muestra. Una vez que se crean los sinogramas, el procesamiento adicional de datos, como la eliminación de artefactos de anillo y el suavizado, son una opción. Los diferentes pasos de la reconstrucción se guardan en el servidor de análisis (y luego se mueven en la carpeta compartida de la propuesta), mientras que los segmentos 2D finales se almacenan inmediatamente en la carpeta compartida de la propuesta. El fémur de la rata fue reconstruido usando iMARS3D. La muestra de raíz / suelo de la planta se procesó previamente mediante el filtrado mediano de los datos utilizando TomoPY seguido de la corrección del eje de inclinación utilizando la biblioteca SciPy de Python. La reconstrucción se llevó a cabo utilizando un paquete de Python desarrollado internamente denominado pyMBIR (construido con kernels de la caja de herramientas ASTRA³⁴) que implementa un conjunto de algoritmos tomográficos desde la línea de base FBP hasta técnicas avanzadas de reconstrucción iterativa basadas en modelos³⁵ que pueden obtener reconstrucciones de alta calidad a partir de conjuntos de datos de neutrones extremadamente dispersos y ruidosos. Todos los volúmenes renderizados basados en las herramientas de reconstrucción mencionadas anteriormente se representan en contraste de atenuación. Toda la visualización se realizó utilizando el paquete de software comercial de visualización, segmentación y análisis de datos AMIRA³⁶.

Este manuscrito tiene como objetivo demostrar el procedimiento de uso de imágenes de neutrones (nR y nCT) en la línea de luz HFIR CG-1D. Este estudio también ilustra las capacidades actuales de nR y nCT de vanguardia para muestras biológicas, específicamente un pulmón de ratón, un hueso de rata y sistemas de raíces / suelo de plantas. El pulmón de ratón fue elegido para ilustrar la complementariedad de los neutrones para medir el tejido pulmonar, mientras que los rayos X son principalmente sensibles a los huesos. La muestra ósea, un fémur de rata, tenía un implante de titanio (Ti), lo que ilustra el contraste entre el hueso y el metal, y la oportunidad de ver la interfaz hueso/metal (que es difícil de medir con rayos X ya que los metales los atenúan fuertemente⁴). Finalmente, el sistema de agua planta-raíz ilustra la capacidad tridimensional (3D) de nCT para medir los sistemas de raíces / suelo in situ. Además, muestra las ventajas / desventajas de usar nR para muestras biológicas. Evidentemente, este método puede usarse con seguridad para medir la dinámica del agua en un sistema planta-raíz, pero no puede considerarse como una técnica de imagen animal o humana viva debido a los riesgos asociados con la exposición a la radiación, limitando así los estudios a ratones (muertos) o mediciones similares a la patología en las que, por ejemplo, una muestra de tejido se reseca de un paciente (animal o humano) y se prepara por fijación antes de medirse en un haz de neutrones.

Protocol

1. Configuración del instrumento (ver Figura 3, sección 3) En el equipo beamline, abra una ventana de terminal, escriba css y, a continuación, presione Entrar para iniciar la interfaz de usuario. Si no se abre de forma predeterminada, elija la opción Inicio de usuario en la pestaña Menú para abrir la interfaz de imágenes del Sistema de control industrial y de física experimental (EPICS). Usando la primera pestaña (llamada Propuesta / Cámara / Dispositivo SE) de la interfaz, seleccione la óptica de la línea de luz haciendo clic en el botón Óptica junto a Cámara / Detectores, es decir, el tamaño de apertura estenopeica y la apertura del sistema de hendidura haciendo clic en el botón Rendijas . Atornille la etapa de rotación en las etapas XY, donde se colocará la muestra, y coloque el detector (sCMOS o CCD).Para el CCD o el detector sCMOS, seleccione la lente con el aumento que proporcione la resolución espacial y la distancia focal deseadas, en consulta con el equipo del instrumento. Usando primero la luz, enfoca la cámara moviendo el detector más cerca o más lejos del espejo, o ajustando manualmente la lente en una posición fija del detector. Enfoque la imagen en la ubicación del centelleador de neutrones. Para el CCD o el detector sCMOS, ajuste el enfoque de la lente con neutrones utilizando una máscara de resolución absorbente de neutrones37 colocada contra el centelleador del detector. Recopile radiografías sucesivas utilizando diferentes configuraciones (es decir, diferentes posiciones del detector desde el espejo automatizado moviendo el motor del detector en EPICS). Compare radiografías evaluando pares de líneas en ImageJ/Fiji39 o una herramienta de software de imagen similar. Cuando proceda, fije la muestra en un recipiente adecuado (recipiente de Al y/o lámina de servicio pesado Al), colocando la muestra en la etapa de rotación lo más cerca posible del detector. Proteja el detector y el equipo utilizando blindaje de neutrones (caucho de boro) y gamma (ladrillos de Pb). Mida la distancia muestra-detector y retire la muestra. Reemplácelo con la máscara de resolución para evaluar el tamaño de píxel en la posición de la muestra en esta configuración de línea de luz. Utilizando una dimensión de entidad conocida, evalúe el número de píxeles en la entidad para determinar el tamaño de píxel. Vuelva a colocar la muestra en la etapa de rotación. Mediante la interfaz EPICS y la ficha Alinear muestra, alinee la muestra con el haz de neutrones tomando radiografías rápidas sucesivas (ms a 1 s) mientras la muestra se mueve hasta que esté a la vista del detector. Guarde el archivo de alineación de ejemplo como un archivo .csv, que se reutilizará antes de que comience la tomografía computarizada. Antes de iniciar la tomografía computarizada, utilice la opción Comprobación automática de la alineación por TC (en la ficha Alineación ) para verificar que la muestra permanezca en el campo de visión en diferentes ángulos mediante la evaluación de radiografías a medida que se generan en diferentes orientaciones de muestra con el haz. 2. Preparación de muestras y estrategia de adquisición de datos NOTA: Los protocolos de muestras de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Tennessee para el pulmón de ratón y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro Médico de la Universidad de Rush para el fémur de rata. Fémures de rataImplante varillas Ti6Al4V (1,5 mm de diámetro y 15 mm de longitud) en los fémures de ratas Sprague-Dawley macho, colocándolas dentro del espacio intramedular a través de los cóndilos femorales distales. Sacrificar las ratas después de 12 semanas, y cosechar los fémures. Retire todo el tejido blando (que contribuye a la atenuación de neutrones) y congele los fémures con implantes en una gasa empapada en solución salina. Sumerja completamente las esponjas de gasa cuadrada de 2 pulgadas en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y envuelva cada muestra completamente en estas esponjas empapadas (consulte la Tabla de materiales). Descongele los fémures a temperatura ambiente para las microtomografías computarizadas basadas en rayos X38, antes de transportarlos en estado congelado al HFIR.Antes de nCT, vuelva a colocar la muestra y llévela a temperatura ambiente en el laboratorio HFIR Biohazard Safety Level 2 (BSL2) ubicado cerca de la línea de luz de imágenes de neutrones CG-1D. Una vez a temperatura ambiente, envuelva la muestra en una lámina de Al de alta resistencia y colóquela en un cilindro de Al. Coloque el cilindro verticalmente en la etapa de rotación en la línea de luz y escanee el fémur en la línea de luz a temperatura ambiente de 0 a 360°, con un ángulo de paso de 0,25°. Adquiera cada radiografía durante 50 s.NOTA: Considerando el tiempo muerto para el movimiento de la etapa de rotación y la transferencia de cada radiografía desde el CCD a la computadora de adquisición de datos, el tiempo total de la exploración fue de aproximadamente 24 h. Una vez que se complete el nCT y se haya autorizado la extracción de la muestra de la línea de luz, lleve la muestra al laboratorio BSL2, retire la contención y vuelva a congelar la muestra para preservarla para futuras mediciones experimentales. Pulmones de ratónResecar el tejido pulmonar de un ratón muerto utilizado para experimentos no relacionados con este estudio. Fijar la muestra en una solución de etanol al 70% antes de los experimentos de neutrones. Envuelva el tejido en una lámina de Al de alta resistencia y llévelo desde el laboratorio BSL2 directamente a la línea de luz CG-1D. Inserte la muestra en un cilindro de Al para doble contención y para mantener la posición de la muestra en el haz durante la exploración nCT. Coloque la muestra cerca del CCD y realice el escaneo durante la noche a temperatura ambiente.NOTA: Cada radiografía fue de 150 s, y el ángulo de paso de rotación fue de 0.5°, de 0 a 182°. El tiempo total para el escaneo fue de alrededor de 16 h. Sistema de raíces/suelo de plantas herbáceasNOTA: Al igual que con otras muestras biológicas, los sistemas planta-suelo tienen un tamaño limitado debido a la fuerte atenuación del hidrógeno, particularmente el agua en el suelo o las raíces de las plantas. Las semillas o ramets se pueden plantar en contenedores (Al o cuarzo, ambos con secciones transversales de baja atenuación de neutrones), o una planta más madura se puede trasplantar en un contenedor.Excave cuidadosamente y transplante una hierba local que crece en el sitio (aquí, hierba de morera (Fatoua villosa (Thunb.) Nakai) en un contenedor Al de sección transversal de 2,38 cm x 2,58 cm, una altura de 6,3 cm, un espesor de pared de 0,055 cm, y que contiene arena pura (SiO2). Enjuague las raíces de las plantas con agua desionizada y muéstrelas cuidadosamente dentro del recipiente de Al mientras llena el recipiente con una suspensión de arena húmeda.NOTA: Al llenar recipientes con tierra, es importante utilizar tierra húmeda, ya que la tierra seca se separará por tamaño de partícula y creará artefactos de textura en los contenedores12,13. Después de plantar, mida el peso saturado del sistema de plantas y pese el sistema de plantas todos los días para evaluar la tasa de uso de agua. Aplique agua en la superficie superior del suelo o a través de un puerto o orificio en la parte inferior del recipiente con un tubo o jeringa.NOTA: Aquí, el sistema de la planta se colocó en una báscula, y el agua se aplicó a la parte superior cada día para reemplazar el uso diario de agua en función del peso. El agua se puede retener antes de la obtención de imágenes para reducir el contenido de agua del suelo y mejorar el contraste en las raíces. Propagar el sistema de la planta en una cámara de crecimiento in situ con temperatura y luz controladas12. Mantenga el sistema de la planta durante 1 semana antes de la obtención de imágenes para permitir la aclimatación de la raíz de la planta al recipiente de Al.NOTA: Una vez que comiencen las imágenes, no riegue la planta. Realice las exploraciones nCT en ~ 1.75 h cada una, y escanee continuamente durante un período de 2.5 días para mapear los cambios dinámicos en 3D en el contenido de agua del suelo y la planta. Para estas mediciones, disminuya la resolución espacial a unos pocos cientos de μm a favor de la resolución de tiempo (es decir, un tiempo de adquisición más rápido para cada proyección).NOTA: Cada tomografía computarizada se realizó con un ángulo de rotación de 0,93° y un tiempo de adquisición de 10 s por proyección. Para el propósito de este manuscrito, solo se presenta la primera tomografía computarizada. 3. Adquisición de datos NOTA: El sistema de adquisición de datos en CG-1D utiliza el software EPICS40. EPICS está desarrollado para guiar el protocolo experimental y minimizar el error humano; esta interfaz lógicamente pasa por los diferentes pasos necesarios antes de medir una muestra, como se ilustra en la Figura 3. El protocolo de adquisición de datos EPICS es el siguiente (Figura 3). La sección izquierda proporciona un estado del experimento en curso, junto con las posiciones motoras y los detalles del experimento (información de muestra, número de propuesta y miembros del equipo). Cada experimento está asociado con un número de propuesta y una o varias muestras. La información de la propuesta, como los miembros del equipo y el nombre de la muestra seleccionada, también está disponible en el lado derecho (primera pestaña llamada “Propuesta/cámara/dispositivo de entorno de muestra”). La sección central comprendía la radiografía actual con una barra de escala de rango dinámico en el lateral, junto con información de estado y registro debajo de la imagen. Seleccione la primera pestaña EPICS titulada Propuesta/Cámara/Dispositivo SE. Haga clic en el botón Cambiar propuesta o Muestra . Seleccione el número de proyecto y el ID de muestra# que se medirán en la Lista de propuestas (izquierda) y Muestra (derecha) que han reemplazado la pestaña anterior. Utilice la flecha hacia atrás para volver a la interfaz principal de EPICS. Seleccione el detector que desea utilizar (sCMOS o CCD) eligiendo uno de los cuatro detectores disponibles (Andor CCD, Andor sCMOS, SBIG CCD o MCP) en la lista de opciones Cámara/Detector .NOTA: El CCD SBIG se utiliza para la prueba del instrumento y puede ser ignorado para el presente manuscrito. Seleccione la etapa de rotación que se utilizará en la sección Dispositivo de entorno de ejemplo .Primero, haga clic en Etapa de rotación (tomografía computarizada) en la lista Dispositivo de entorno de muestra . A continuación, seleccione una de las etapas de rotación (que corresponde a la muestra a escanear). Finalmente, en la parte inferior de la pestaña, seleccione el Modo de adquisición de datos. En este caso, seleccione la primera opción, White Beam.NOTA: El modo de adquisición es haz blanco (tomando todo el rango de longitud de onda de neutrones) o monocromático en la línea de luz CG-1D. Seleccione la segunda pestaña EPICS titulada Alinear muestra. Escriba un nombre de archivo de ejemplo y presione Entrar. Repita el proceso para el nombre de la subcarpeta.NOTA: La interfaz EPICS está programada para guardar automáticamente los datos en los directorios experimentales adecuados, que el software de reconstrucción interno utiliza para producir cortes bidimensionales (2D) del objeto 3D bajo investigación. La segunda pestaña, Alinear muestra, permite la alineación de la muestra utilizando radiografías que son solo unos segundos, ya que estas radiografías no se utilizan más tarde para el procesamiento y análisis de datos. Una vez que todos los motores están colocados correctamente, sus posiciones se pueden guardar en un formato de archivo .csv; por lo tanto, cada alineación de muestra tiene su archivo de .csv correspondiente al que se puede volver a llamar para colocar las muestras para las tomografías computarizadas en un momento posterior. Omita la alineación de los tres motores, es decir, suponga que la muestra está alineada y lista para CT. Seleccione un tiempo de adquisición deseado y haga clic en el botón Tomar imágenes rápidas . Recoger una serie de radiografías con diferentes tiempos de adquisición para evaluar la SNR. Abrir ImageJ/Fiji; Arrastre y suelte las diferentes radiografías. Trazar un perfil que vaya de la muestra a un área abierta; evaluar SNR. Si se establecen varias muestras en la etapa XY (varias etapas de rotación, cada una para una muestra), registre cada posición de muestra después de la alineación y guarde los datos como archivo .cvs haciendo clic en el botón Guardar en un archivo . Seleccione la tercera pestaña EPICS titulada Recopilar datos para configurar los parámetros de la tomografía computarizada. Escriba un nombre de archivo en la primera línea grabable y presione Entrar. Repita el procedimiento para el nombre de la subcarpeta.NOTA: El diseño de la ficha Recopilar datos depende de la selección de una serie de radiografías transcurridas (sin EE) o tomografías computarizadas (selección de una etapa de rotación) en la primera ficha. En la sección Alinear muestra mediante el archivo guardado, seleccione el archivo que registró previamente las posiciones del motor de muestra (paso 1.8). Utilice los archivos guardados recientemente para examinar los archivos de alineación de ejemplo guardados recientemente . Haga clic en Alinear usando archivo para que la muestra vuelva a su posición en el haz de neutrones. Calcular el número de proyecciones requeridas para la TC basándose en el teorema de muestreo de Nyquist. Calcule el número de píxeles en la dimensión horizontal de la muestra y multiplíquelo por 1,5 para obtener el número de proyecciones necesarias para cumplir con el muestreo de Nyquist. Introduzca el ángulo de inicio de rotación (normalmente 0°), el ángulo final de rotación (normalmente 180°), el tamaño del paso de rotación, el número de imágenes por paso (normalmente establecido en 1) y el tiempo de exposición de cada imagen. Inicie la tomografía computarizada haciendo clic en el botón Recopilar datos . 4. Reconstrucción de volúmenes y procesamiento/análisis de datos NOTA: Todas las herramientas de software CG-1D para la normalización, reconstrucción y análisis de datos están disponibles en el repositorio Python de la instalación ORNL y en los servidores de análisis de la instalación. Para mediciones 2D, el preprocesamiento se puede realizar con Jupyter Pythonnotebooks 41. Una ilustración de un cuaderno está disponible en la Figura 4. Uno puede cargar y previsualizar sus datos antes de seleccionar una región de interés fuera de la muestra que se utiliza para normalizar a 1 (o 100%) transmisión cualquier fluctuación del haz. Estos cuadernos se pueden adaptar a cada medición, lo que hace que el preprocesamiento sea un esfuerzo sencillo. Además, el análisis 2D se puede realizar en el mismo cuaderno, como el seguimiento de los cambios cinéticos (es decir, la absorción de agua en una muestra) en una muestra a través del tiempo. Inicie sesión en el servidor de análisis de Linux con el nombre de usuario y la contraseña. Abra el navegador web y escriba jupyter.sns.gov. Abra el bloc de notas de Python Jupyter denominado iMARS3D. Ejecute las primeras líneas del código (que carga las herramientas necesarias para ejecutar iMARS3D). Cargar datos, plano y campo oscuro. Compruebe que los tres conjuntos de datos están cargados correctamente. Continúe con el recorte de los datos, el filtrado (según sea necesario), la normalización (con corrección automática de la inclinación de la muestra) y la reconstrucción volumétrica (un proceso largo). Guarde los datos en la carpeta de número de proyecto denominada Shared. Después de activar AMIRA36, que también está disponible en los servidores de análisis de instalaciones, cargue los segmentos reconstruidos en el software y continúe con la visualización, el filtrado adicional y el análisis.

Representative Results

La figura 5A es una fotografía de un fémur de rata representativo de tamaño similar al medido; La figura 5B,C representa el nCT del fémur de una rata con el implante Ti. La Figura 5B muestra la falsa atenuación del color basada en nCT del fémur, mientras que la Figura 5C representa un corte diagonal a través del hueso con la misma orientación que en la Figura 5B para revelar el implante Ti (en escala de grises) que se asemeja a una TC médica de rayos X. Este implante no interactúa con los neutrones tanto como el material óseo; Por lo tanto, su atenuación es mínima, y parece más oscuro (es decir, menos atenuante) que el hueso circundante. El hueso trabecular, que está presente dentro del espacio medular del fémur, es claramente visible en el extremo proximal de la muestra (flechas rojas en la figura 5B). La Figura 6A,B muestra fotografías representativas del pulmón de ratón fijado en etanol, en dos posiciones diferentes, utilizado para nCT para demostrar la capacidad de los neutrones para detectar muestras de tejidos blandos. El volumen reconstruido del pulmón de ratón obtenido de nCT se muestra en la Figura 6C,D, posicionado de manera similar a la Figura 6A,B. Un corte a través del lóbulo derecho del pulmón se ilustra en la Figura 6E. A pesar del tamaño relativamente pequeño de la muestra, la sensibilidad neutrónica se demuestra claramente mediante una detección de la estructura del pulmón a una resolución espacial de ~75 μm. Como era de esperar, el rango de atenuación es bastante amplio, con una gran porción correspondiente a una atenuación de neutrones de baja a media, ya que los pulmones tienen una estructura similar a una esponja que contiene aire. La Figura 7A muestra una fotografía de la muestra de la planta, mientras que la Figura 7B representa la representación volumétrica de color falso del sistema raíz / suelo de la planta en un contenedor rectangular de Al (que no es visible porque Al es mayormente transparente a los neutrones). En comparación con los conjuntos de datos anteriores, SNR es más pobre, como se esperaba, ya que los datos se adquirieron más rápido para rastrear los movimientos dinámicos de absorción de agua en la raíz en 3D durante 2,5 días. Por lo tanto, cada tomografía computarizada se optimizó para medirse dentro de una ventana de ~ 1.75 h. A pesar de la SNR deficiente, el sistema radicular en el suelo es claramente visible en los cortes verticales de la muestra que se muestra en la Figura 7C, D en color falso. Figura 1: Dibujo esquemático de la línea de haz de imágenes de neutrones HFIR CG-1D. El haz de imágenes está definido por el sistema de apertura que define una geometría de haz cónico. El haz se transporta a través de un tubo de vuelo lleno de He con raspadores de haz para eliminar los neutrones perdidos no deseados. Un revestimiento de goma borada dentro del tubo de vuelo disminuye el fondo de las líneas de luz vecinas. Abreviaturas: HFIR = reactor de isótopos de alto flujo; He = helio; L = distancia desde la abertura estenopeica del diámetro, D y el detector. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: La instalación de imágenes de neutrones CG-1D en el reactor de isótopos de alto flujo. La fotografía muestra, de frente de derecha a izquierda, los tubos de vuelo, el área de muestra y el tope del haz. El haz de neutrones proviene del lado derecho de la fotografía. El tubo de vuelo ha sido firmado por las comunidades científicas y de investigación de la industria que utilizan el instrumento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Interfaz EPICS. La interfaz CG-1D EPICS se divide en tres secciones: la sección de estado (izquierda), el área de visualización (en este ejemplo, una radiografía en bruto de un reloj de sol náutico de latón) y la entrada de parámetros para imágenes 2D y 3D. Abreviaturas: EPICS = Física Experimental y Sistema de Control Industrial; 2D = bidimensional; 3D = tridimensional. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Una captura de pantalla de un cuaderno de Jupyter. Este cuaderno se utiliza para obtener una vista previa de un conjunto de radiografías antes de normalizarlas. En este ejemplo, se visualiza el mismo reloj de sol náutico de latón que se muestra en la Figura 3 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: Fémur de rata con implante de titanio. (A) Fotografía de un fémur de rata representativo. (B) Volumen renderizado en 3D del fémur de rata obtenido de nCT. (C) Corte diagonal que muestra la varilla de titanio dentro del fémur. Las flechas rojas muestran el hueso trabecular. Las barras de escala se presentan por los ejes x e y, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6: Lung de ratón nCT . (A) y (B) Fotografías representativas de pulmón de ratón. (C) y (D) Volumen renderizado 3D basado en atenuación del ratón utilizando la misma posición que (A) y (B). (E) Corte representativo a través del lóbulo derecho del pulmón del ratón (D) que muestra una estructura de pulmón obtenida con un gradiente diferente de atenuación de neutrones (principalmente baja atenuación). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 7: Tomografía computarizada de neutrones y cortes a través del sistema de raíces/suelo de la planta. (A) Fotografía de la muestra de la planta. (B) Volumen renderizado en 3D a partir de la tomografía computarizada de neutrones de la planta que muestra el tallo sobre el suelo y el sistema del suelo con agua (en rojo). (C) y (D) son cortes a través de la muestra en ángulo para mostrar el tallo y las raíces en el suelo (flechas rojas). Las áreas azules más oscuras en el suelo indican la presencia de agua. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

La radiografía de neutrones y la TC de muestras biológicas son técnicas de imagen prometedoras que complementan las imágenes de rayos X o las imágenes por resonancia magnética. Los pasos críticos para realizar un experimento de imágenes de neutrones de una muestra biológica están relacionados con su preparación y su contención en la línea de luz. La optimización de un experimento es impulsada por la pregunta científica a responder. Si la pregunta científica requiere una alta resolución espacial para observar un fenómeno, entonces se requieren largos tiempos de adquisición, y el inconveniente de nCT (con campo de visión de tamaño cm) es que lleva horas realizar un escaneo. Esto se debe principalmente a la diferencia en el flujo total de neutrones disponible en un reactor en comparación con una fuente de sincrotrón, donde las tomografías computarizadas de rayos X pueden tomar de segundos a minutos para un campo de visión de unos pocos mm² . Aunque el método puede aplicarse a muestras de tejido ex vivo extraídas de animales, no puede extenderse in vivo a animales vivos o humanos debido al riesgo de exposición a la radiación (como los rayos gamma producidos por neutrones y las interacciones de neutrones con los átomos de la muestra). Sin embargo, es muy adecuado para la obtención de imágenes de las interacciones entre la raíz y el suelo de la planta (Figura 7), como la dinámica de absorción de agua.

La ventaja de usar nCT rápido para la dinámica de la planta es la sensibilidad al H en el agua y la ausencia de daño por radiación a la planta, a diferencia de la TC de rayos X. Además, se puede observar un contraste único del uso de neutrones en muestras de hueso / metal como un fémur de rata donde el metal es relativamente transparente en comparación con los tejidos circundantes (Figura 5), evitando potencialmente los artefactos metálicos inducidos por la TC³⁹ de rayos X. Los tejidos animales, como el pulmón de ratón (Figura 6), muestran una detección impresionante de la estructura de los tejidos blandos porque los neutrones son sensibles al H, pero la resolución espacial es un factor limitante en estas mediciones. El contraste es proporcionado por los átomos de H presentes en muestras biológicas^19,39.

Con los avances de técnicas novedosas como la interferometría de rejilla de neutrones y la mejora en la resolución espacial (recientemente se han reportado algunas micras^42,43), las imágenes de neutrones pueden ofrecer nuevos mecanismos de contraste para los tejidos biológicos con una resolución espacial mejorada. La exploración de neutrones de mayor energía (para permitir las mediciones de muestras gruesas) también promete la capacidad de medir secciones más grandes de un tejido animal, como un ratón intacto, ofreciendo así nuevas posibilidades para la investigación biomédica.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Parte de esta investigación utilizó recursos en el Reactor de Isótopos de Alto Flujo, operado por ORNL, y patrocinado por el Departamento de Energía de los Estados Unidos, Oficina de Ciencia, Instalaciones de Usuario, bajo el contrato DE-AC05-00OR22725 con UT-Battelle, LLC. Parte de esta investigación fue apoyada por ORNL a través del programa Eugene Wigner Distinguished Staff Fellowship. Esta investigación también fue patrocinada por la Oficina de Ciencia del DOE, Oficina de Investigación Biológica y Ambiental. Las muestras femorales de rata se obtuvieron de experimentos realizados en colaboración con el Dr. Rick Sumner en el Centro Médico de la Universidad de Rush con fondos obtenidos del NIH (R01AR066562) y del premio Smith and Nephew de la Fundación de Investigación y Educación Ortopédica. El equipo quiere agradecer a los equipos de apoyo HFIR que permiten el uso de las líneas de haz de dispersión de neutrones.

Materials

Aluminum containers	custom		Made from aluminum plates or tubing (alternate is quartz), plant and mouse sample
Aluminum foil	Fisher	01-213-100	Mouse lung sample containment
Deionized water or deuterium oxide			Water or D₂O can be used to enhance contrast, plant sample
Ethanol	Fisher	04-355-223	Mouse lung sample
Gauze sponges	CardinalHealth		Fully submerged in phosphate-buffered saline (PBS) and used to wrap samples, rat femur sample
Growth chamber	Conviron	A1000	Any growth chamber or greenhouse with controlled conditions would work, plant sample
Laboratory balance			Weighing plant system can be used to measure actual water content in the soils, plant sample
Pure silica sand	US Silica Co.	Flint#13	Pure SiO₂ provides low neutron attenuation compared to soils, plant sample
Sprague-Dawley Rats	Harlan	Order Code: 002-US	Rat femur sample
Titanium Rod	Goodfellow	TI007905	Rat femur sample

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Citar este artículo

Bilheux, H. Z., Cekanova, M., Warren, J. M., Meagher, M. J., Ross, R. D., Bilheux, J. C., Venkatakrishnan, S., Lin, J. Y., Zhang, Y., Pearson, M. R., Stringfellow, E. Neutron Radiography and Computed Tomography of Biological Systems at the Oak Ridge National Laboratory’s High Flux Isotope Reactor. J. Vis. Exp. (171), e61688, doi:10.3791/61688 (2021).