JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

단일 분자 물고기에 의한 전사 활성 알레일의 단일 세포 분석

Published: September 20, 2020
doi:
10.3791/61680
, , , ,
1GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics, 2Department of Molecular and Cellular Biology,Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Cancer Research, Institute of Biosciences and Technology,Texas A&M University, 4Department of Pharmacology and Chemical Biology,Baylor College of Medicine

Summary

단일 분자 RNA 형광은 시투 혼성화(smFISH)에서 단일 세포 수준에서 특정 RNA의 수준 및 국소화를 정확하게 정량화하는 방법이다. 여기서는 특정 RNA의 단일 세포 정량화를 위한 습식 벤치 처리, 이미징 및 이미지 분석을 위한 검증된 실험실 프로토콜을 보고합니다.

Abstract

유전자 전사는 세포 생물학에 필수적인 프로세스이고, 세포가 내부 및 외부 단서를 해석하고 반응할 수 있습니다. mRNA 수준을 측정하는 전통적인 벌크 인구 방법 (북부 얼룩, PCR 및 RNAeq)는 반응에 있는 세포 대 세포 변이에 정보를 제공하는 기능이 부족합니다. 정확한 단일 세포 및 동종 가시화 및 정량화는 시상 혼성화(smFISH)에서 단일 분자 RNA 형광을 통해 가능하다. RNA-FISH는 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 가진 표적 RNA를 혼성화하여 수행됩니다. 이들은 중간/고 처리량 양식으로 이미지될 수 있으며, 이미지 분석 파이프라인을 통해 성숙및 초기 RNA 모두에 대한 정량적 데이터를 단일 셀 수준에서 제공할 수 있습니다. 고정, 투과성, 혼성화 및 이미징 단계는 여기에 설명된 모델 시스템을 사용하여 수년 동안 실험실에서 최적화되어 왔으며, 이로 인해 smFISH 라벨링의 성공적이고 견고한 단일 셀 분석이 초래됩니다. 샘플 준비 및 처리의 주요 목표는 높은 신호 대 잡음 비율을 특징으로 하는 고품질 이미지를 생성하여 거짓 긍정을 줄이고 보다 정확한 데이터를 제공하는 것입니다. 여기서는 특정 샘플에 맞게 조정하기 위한 제안 및 최적화 단계와 함께 샘플 준비에서 데이터 분석에 이르는 파이프라인을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

Introduction

유전자 전사 및 번역은 DNA 서열에서 RNA로 단백질 1로 가는 생물학의 중앙 교리에 관여하는 2개의 중요한프로세스입니다. 이 연구에서는 전사 중에 메신저 RNA (mRNA)의 생산에 중점을 둡니다. 초기 RNA 분자는 비 코딩 인트론과 코딩 엑손을 모두 포함한다. 인트론은 mRNA가 리보솜2,3에서번역을 위해 세포질로 이동하기 전에 공동 전사적으로 접합된다.

전통적으로, mRNA의 측정은 RT-qPCR 또는 북부 블로팅과 같은 고전적인 소사와 세포의 대량 인구 (수억)에서 수행됩니다. 매우 강력하지만, 이러한 방법은 세포 간 변이(phenotypic 이질성), 전사 활성 적 진상화 수의 식별, 그리고 아마도 더 중요한 것은 공간 정보가 부족하기 때문에 제한적입니다. 최근에는 단세포 RNA 염기서열분석(RNA)을 허용하는 게놈 와이드 기술이 이미징 방법과 시퀀싱4사이의 격차를 해소하기 시작했다. 그러나, RNAseq는 상대적으로 낮은 검출 효율성으로 고통받고 처리 단계는 공간 정보의 완전한 손실을초래5. 단하나 세포 RNAEq는 동종 세포의 인구 들 사이에서 표현성 이질성에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 시투 혼성화 (RNA-FISH)에서 RNA 형광은 공간 수준에서 표적 유전자 발현의 보다 완전한 탐구를 용이하게 할 수 있으며, 골자별 기준6,7.

RNA FISH는 고정 된 세포에서 표적 RNA 분자의 검출 및 국소화를 허용하는 기술이다. 이전, 고된 방법과 는 달리, 현재의 최첨단 RNA-FISH는 표적 RNA 서열에 상보적인 상업적으로 이용가능한 핵산 프로브를 이용하고, 이들 프로브는 왓슨 크릭 베이스 페어링8에의해 그들의 표적에 혼성화된다. 초기 시투 혼성화 기술은 1969년에 Gall 및 Pardue에 의해 확립된 유사한 프로토콜을 포함했으며, 시료는 표적 RNA9에특별히 혼성화된 핵산 프로브로 처리되었다. 원래 분석은 방사성 또는 색탐지를 사용하여 수행되었다; 그러나, 1980년대에, DNA FISH 및 이후 RNA FISH에 대한 시투 혼성화(FISH) 프로토콜의 형광개발은 보다 민감한 검출을 향한 경로를 열어,10,11을멀티플렉스화할 수 있는 가능성을 열어놓았다.

RNA FISH의 추가 발달은 단일 RNA 분자(smFISH)12,13을검출하고 정량화하는 능력을 주도하였다. 직접 검출은 프로브 자체가 형광으로 표시되는 방법입니다. smFISH의 과제는 형광 신호의 검출을 구별되는 회절 제한 반점으로 쉽게 감지할 수 있는 충분한 혼성 화 프로브/대상이 필요하다는 것입니다. 이 문제를 해결하기 위해,표적 RNA8,12,14의다양한 부위에 보편화된 짧은 단하나 좌초 DNA 올리고뉴클레오티드의 프로브 세트를 사용할 수 있다. 여러 프로브의 결합은 국소 형광 밀도를 증가시켜 RNA를 형광 현미경 검사법에 의한 뚜렷한 고강도 지점으로 볼 수 있게 합니다. 이 방법은 프로브 세트 풀에서 올리고뉴클레오티드의 오프타겟 결합이 실제 신호와 스퓨리어스 올리고뉴클레오티드 결합을 구별하기 위해 스팟 크기와 강도를 정량적으로 분석함으로써 진정한 RNA 스팟 신호와 구별될 수 있기 때문에 유리하다12.

mRNA를 검출하는 대체 방법은 고전적인 BAC 클론 기반닉 번역 방법 및 최근에 개발된 분기 DNA 시스템이다. BAC-복제, 닉 번역 방법에서, 표지되는 DNA는 효소-별명이 있고 새로운 뉴클레오티드가 노출된 3’끝에 추가된다. DNA 중합체의 활성은 원하는프로브(15,16)의결과로 표지된 뉴클레오티드를 추가한다. 분지 된 DNA 기술은 RNA 표적에 쌍으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하고 이 프로브는 다중 신호 증폭 분자를 사용하여 증폭된다. 이 방법은 신호 대 잡음 비율을 크게 향상시킬 수 있지만 형광 반점이 크기와강도(17)에서격렬하게 다를 수 있기 때문에 증폭이 정확한 수량을 왜곡할 수 있다.

이 프로토콜의 모델 시스템으로, 이는 칼리프 슈퍼펀드 연구 프로그램 참여의 일환으로 갤버스턴 베이/휴스턴 선박 채널에서 내분비 방해 화학물질의 효과를 정량화하기 위해, ER 작용제, 17β-estradiol(E2)7,18, 189로하룻밤 치료된 에스트로겐 수용체(ER) 양성 유방암 세포주 MCF-7을 사용하였다. E2는 프로토타입 ER 표적 유전자, GREB17,20,21,22를포함하는 많은 ER 표적유전자를조절한다. 여기에 설명된 smFISH 프로토콜은 GREB1을 대상으로 하는 두 개의 스펙트럼 분리 프로브 세트 세트를 활용합니다. 하나는 엑손과 다른 인트론에 혼성화하여 성숙하고 초기 RNA7을측정할 수 있게 한다. 그런 다음 에피플루오레이션 현미경 검사법을 사용하여 감쇠가 부착된 샘플을 이미지smFISH에 사용한 다음 이미지 분석 루틴을 적용하여 활성 알레및 성숙한 RNA의 수를 정량화합니다.

Protocol

최적의 결과를 보장하기 위해 이 프로토콜의 습식 실험실 부분에는 모든 단계에서 표준 RNase 가 없는 주의해야 합니다. 예를 들어, 여과 된 파이펫 팁, 멸균 용기 및 RNase 가없는 버퍼의 사용은 매우 권장됩니다. 바나딜 리보뉴클레오시드 복합체와 같은 RNase 억제제도 사용하며, 특히 낮은 풍부도 표적 RNA를 위해 제안된다. 1. 세포 배양 및 실험 설정 Fhenol-red ?…

Representative Results

예를 들어, smFISH를 통한 호르몬 반응을 분석하기 위해, NIEHS 슈퍼펀드 연구 프로그램7에참여하는 맥락에서 환경재해에 내분비가 화학물질을 방해하는 내분비의 존재를 결정하기 위해 높은 처리량 분석에서 사용되는 에스트로겐 수용체(ER) 모델을 선택했다. 본 실험에서, 신봉성 MCF-7 유방암 세포는 ER 작용제 17β-estradiol (E2, 10 nM) 또는 차량(DMSO)으로 24시간 동안 치료되었다. GREB1 내?…

Discussion

설명된 smFISH 방법론은 이전에 게시된 프로토콜7,12,14를기반으로 합니다. 이 프로토콜에서, 우리는 습식 실험실에서 최적화 된 중요한 단계를 설명 (파종 밀도 포함, 고정 시간, 과구화, 및 프로브 농도), 이미징 및 이미지 분석에, 유전자 전사의 단일 세포 분석을 수행에 관심이 실험실을위한 전체 실험 파이프 라인을 제공.

<p…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

MAM, FS 및 MGM은 NIEHS (프로젝트 4, P42ES027704, PI, Rusyn)에 의해 투자됩니다. MAM, FS, RMM, MGM 및 PKS는 고급 현미경 및 이미지 정보학을 위한 CPRIT 자금GCC 센터(RP170719)에 의해 지원됩니다. 이미징은 또한 NIH (DK56338, CA125123), CPRIT (RP150578), 댄 L. 던컨 포괄적 인 암 센터, 화학 유전체학을위한 존 S. 던 걸프 해안 컨소시엄의 자금조달과 베일러 의과 대학의 통합 현미경 코어에 의해 지원됩니다.

Materials

17β Estradiol Sigma-Aldrich E2257 CAS Number 50-28-2
Ambion SSC (20X) Buffer, Rnase-free ThermoFisher Scientific AM9770
Corning DMEM with L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose Fisher Scientific MT10017CV Manufactured by Invitrogen
DAPI Sigma-Aldrich D8417 Without sodium pyruvate
Dextran Sulfate, 50% Solution Sterile Sigma-Aldrich 3730-100ML
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Ca++/Mg++ Corning 21030CV Manufactured by Calbiochem
Ethanol, 200 Proof (100%) Fisher Scientific 07-678-005
Falcon 24-Well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate Corning 353047 Manufactured by Decon Laboratories
Fetal Bovine Serum (FBS), 500 mL Fisher Scientific 50-753-2978 Manufactured by Gemini Bio Products
GE Healthcare DeltaVision LIVE High Resolution Deconvolution Microscope GE Healthcare
Hyclone Water, Molecular Biology Grade Fisher Scientific SH3053802
Immersion Oil 1.516 GE Healthcare Life Sciences 29162940 Manufactured by GE Healthcare Bio-Science
L-glutamine Solution Fisher Scientific MT25005Cl Manufactured by Corning
MCF-7 cells ATCC HTB-22
Molecular Grade Formamide Promega PAH5051
Olympus 60x/1.42 NA Objective Olympus
Parafilm Bemis Company, Inc. 52858-076 Distributed by VWR
Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade Electron Microscopy Sciences 15710
Penicilin-Streptomycin Solution Fisher Scientific MT3001Cl Manufactured by Corning
Ribonucleoside Vanadyl Complex VWR 101229-716 Manufactured by New England Biosciences
RNase Away Ambion 9780
Sodium pyruvate, 100 mM Fisher Scientific 11-360-070 Manufactured by Gibco
Thermo Scientific Glass Coverslips, #1.5 Fisher Scientific 12-545-81P
Triton X-100, 100 mL Fisher Scientific BP151-100 Manufactured by Fisher BioReagents
Trypsin-EDTA Solution 0.25% Sigma-Aldrich T4049-500ML
Vectashield Antifade Mounting Medium 10 mL Fisher Scientific NC9265087 Manufactured by Vector Laboratories
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Russell, P. J. Gene Expression: Transcription. iGenetics: A Mendelian Approach. , 331-352 (2006).
  2. Darnell, J. E. Variety in the level of gene control in eukaryotic cells. Nature. 297, 365-371 (1982).
  3. Köhler, A., Hurt, E. Exporting RNA from the nucleus to the cytoplasm. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 761-773 (2007).
  4. Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing. Molecular Cell. 58, 610-620 (2015).
  5. Shah, S., Lubeck, E., Zhou, W., Cai, L. In situ Transcription Profiling of Single Cells Reveals Spatial Organization of Cells in the Mouse Hippocampus. Neuron. 92, 342-357 (2016).
  6. Halpern, K. B., et al. Bursty Gene Expression in the Intact Mammalian Liver. Molecular Cell. 58, 147-156 (2015).
  7. Stossi, F., et al. Estrogen-induced transcription at individual alleles is independent of receptor level and active conformation but can be modulated by coactivators activity. Nucleic Acids Research. 48, 1800-1810 (2020).
  8. Coassin, S. R., Orjalo, A. V., Semaan, S. J., Johansson, H. E. Simultaneous Detection of Nuclear and Cytoplasmic RNA Variants Utilizing Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1211, 189-199 (2014).
  9. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 63, 378-383 (1969).
  10. Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van Duijn, P. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochrome labelled RNA. Experimental Cell Research. 128, 485-490 (1980).
  11. Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with biotinated nucleotide analog. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 79, 7331-7335 (1982).
  12. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
  13. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5, 877-879 (2008).
  14. Orjalo, A. V., Johansson, H. E. Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization for the Simultaneous Detection of Immature and Mature Long Noncoding RNAs in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1402, 119-134 (2016).
  15. Johnson, C. V., Singer, R. H., Lawrence, J. B. Chapter 3 Fluorescent Detection of Nuclear RNA and DNA: Implications for Genome Organization. Methods in Cell Biology. 35, 73-99 (1991).
  16. Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: Past, present and future. Journal of Cell Science. 116, 2833-2838 (2003).
  17. Wang, F., et al. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
  18. Stossi, F., et al. Defining estrogenic mechanisms of bisphenol A analogs through high throughput microscopy-based contextual assays. Chemistry and Biology. 21, 743-753 (2014).
  19. Szafran, A. T., Stossi, F., Mancini, M. G., Walker, C. L., Mancini, M. A. Characterizing properties of non-estrogenic substituted bisphenol analogs using high throughput microscopy and image analysis. PLoS One. 12, 1-19 (2017).
  20. Rae, J. M., et al. GREB1 is a critical regulator of hormone dependent breast cancer growth. Breast Cancer Research and Treatment. 92, 141-149 (2005).
  21. Heldring, N., et al. Estrogen receptors: How do they signal and what are their targets. Physiological Reviews. 87, 905-931 (2007).
  22. Hah, N., et al. A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells. Cell. 145, 622-634 (2011).
  23. Kadam, P., Bhalerao, S. Sample size calculation. International Journal of Ayurveda Research. 1, 55-57 (2010).
  24. Kocanova, S., et al. Activation of estrogen-responsive genes does not require their nuclear co-localization. PLoS Genetics. 6, (2010).
  25. Shaffer, S. M., Wu, M. T., Levesque, M. J., Raj, A. Turbo FISH: A Method for Rapid Single Molecule RNA FISH. PLoS One. 8, (2013).
  26. Kim, S. O., Kim, J., Okajima, T., Cho, N. J. Mechanical properties of paraformaldehyde-treated individual cells investigated by atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy. Nano Convergence. 4, (2017).
  27. Shieh, T. M., et al. Application of ribonucleoside vanadyl complex (RVC) for developing a multifunctional tissue preservative solution. PLoS One. 13, 1-14 (2018).
  28. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).
  29. Vinegoni, C., Feruglio, P. F., Weissleder, R. High dynamic range fluorescence imaging. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25, (2019).
  30. Tam, R., Shopland, L. S., Johnson, C. V., McNeil, J. A., Lawrence, J. B. Application of RNA FISH for visualizing gene expression and nuclear architecture. FISH: A Practical Approach. , 93-117 (2002).
  31. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. , (2020).
  32. Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nature Protocols. 7, 408-419 (2012).
  33. Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Reports. 46, 65-72 (2013).
  34. Sibarita, J. B. Deconvolution microscopy. Advcances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 201-243 (2005).
  35. Takei, Y., Shah, S., Harvey, S., Qi, L. S., Cai, L. Multiplexed Dynamic Imaging of Genomic Loci by Combined CRISPR Imaging and DNA Sequential FISH. Biophysical Journal. 112, 1773-1776 (2017).
  36. Moffitt, J. R., Zhuang, X. RNA Imaging with Multiplexed Error-Robust Fluorescence in situ Hybridization (MERFISH). Methods in Enzymology. 572, 1-49 (2016).
  37. Shah, S., et al. Dynamics and Spatial Genomics of the Nascent Transcriptome by Intron seqFISH. Cell. 174, 363-376 (2018).
  38. Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9, 1-13 (2019).
  39. Lubeck, E., Coskun, A. F., Zhiyentayev, T., Ahmad, M., Cai, L. Single-cell in situ RNA profiling by sequential hybridization. Nature Methods. 11, 360-361 (2014).
  40. Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8, (2018).
  41. Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16, 33-41 (2019).
  42. Zimmerman, S. G., Peters, N. C., Altaras, A. E., Berg, C. A. Optimized RNA ISH, RNA FISH and protein-RNA double labeling (IF/FISH) in Drosophila ovaries. Nature Protocols. 8, 2158-2179 (2013).
  43. Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59, 209-221 (2015).

Tags

Single Cell AnalysisTranscriptionally Active AllelesSingle Molecule FISHRNA QuantificationGene TranscriptionEstrogen Receptor AgonistRNA FISHGREB1 IntronGREB1 ExonDAPIFluorescence Microscopy

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Mistry, R. M., Singh, P. K., Mancini, M. G., Stossi, F., Mancini, M. A. Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH. J. Vis. Exp. (163), e61680, doi:10.3791/61680 (2020).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image