Visualizando dinâmica difusional de nanorods de ouro na membrana celular usando microscopia de campo escuro de nanopartícula única

A dinâmica das nanopartículas (NPs) na membrana está intimamente associada ao processo de captação celular, essencial para a compreensão das funções celulares, infecções virais ou bacterianas e o desenvolvimento de sistemas de entrega nanomédicas artificiais^1,2. A técnica de rastreamento de partículas únicas (SPT) é uma ferramenta robusta para caracterizar os comportamentos heterogêneos das NPs^3,4. Em geral, a membrana celular é fluidica, o que significa que os componentes como proteínas e lipídios podem se mover lateralmente no plano da membrana plasmática^5,6,7. A complexidade espiotemporal da organização e estrutura da membrana pode levar à heterogeneidade espiotemporal da interação entre NPs e membrana. Assim, a visualização direta do movimento de NPs na membrana requer alta resolução espacial e temporal.

Microscopia de rastreamento de partículas únicas que monitora a localização de partículas individuais em células vivas com uma resolução espacial de dezenas de nanômetros e uma resolução temporal de milissegundos foi bem desenvolvida para estudar as NPs ou moléculas de membrana dinâmica^8,9. Técnicas de imagem microscópica baseadas em fluorescência tornaram-se ferramentas valiosas para observar NPs/moléculas no ambiente celular vivo^9,10,11,12. Por exemplo, a microscopia total de fluorescência de reflexão interna, que imagens de camadas finas (~100 nm) da amostra na interface substrato/solução com alta resolução espátula tem sido amplamente utilizada em estudos da dinâmica das moléculas de membrana^13,14. No entanto, as desvantagens inerentes aos fluoroforos únicos, como baixa intensidade e fotobleaching irreversível rápido reduzem a precisão e a duração do rastreamento¹³. Portanto, NPs plasmônicos não fluorescentes, que substituem as sondas fluorescentes, têm atraído cada vez mais atenção em estudos de imagem de longo prazo devido às suas características ópticas únicas¹⁵. Com base nos sinais de dispersão de sondas NP plasmônicas, vários tipos de tecnologias ópticas de imagem microscópica têm sido utilizadas para estudar o mecanismo de processos biológicos, como microscopia de campo escuro (DFM)^16,microscopia de dispersão interferométrica (iSCAT)¹⁷ e microscopia de contraste de interferência diferencial (DICM)¹⁸. Além disso, a dinâmica de movimento e rotação de AuNRs pode ser obtida utilizando DFM e DICM^{18,19,20,21,22}. Normalmente, em um experimento SPT, o movimento do objeto é registrado pelo microscópio óptico e, em seguida, analisado pelos métodos de análise SPT³. As trajetórias e ângulos orientacionais gerados por NPs individuais são normalmente estocásticos e heterogêneos, por isso é necessário apresentar informações dinâmicas abundantes com vários métodos de análise.

Aqui, fornecemos um protocolo integrado que monitora a dinâmica dos AuNRs na membrana celular utilizando DFM, extrai a localização e orientação dos AuNRs com ImageJ e MATLAB e caracteriza a difusão de AuNRs com métodos de análise SPT. Como demonstração, mostramos aqui como usar o protocolo SPT para visualizar dinâmicas de AuNRs não modificados (CTAB-AuNRs, sintetizados pela molécula de brometo de amônio cetililomina como agente protetor) na membrana celular U87 MG. Foi demonstrado que os CTAB-AuNRs podem adsorb proteínas em ambiente biológico, mover-se na membrana celular e, em^seguida,entrar nas células^2,20,22. A célula U87 MG é o tumor mais comum e mais maligno do sistema nervoso central, e seus receptores de membrana são anormalmente expressos. Os receptores de membrana podem interagir com proteínas em AuNRs, que influenciam a dinâmica dos AuNRs. Nosso protocolo é geralmente aplicável a outros experimentos SPT no campo da biologia.