تصور ديناميات الانتشار من نانورود الذهب على غشاء الخلية باستخدام جسيمات نانوية واحدة Darkfield المجهرية
Summary
هنا، نعرض استخدام المجهر التقليدي في مجال الظلام لمراقبة ديناميات نانورود الذهب (AuNRs) على غشاء الخلية. يتم الكشف عن موقع واتجاه AuNRs واحد باستخدام ImageJ MATLAB، وتتميز الدول الانتشارية من AuNRs بتحليل تتبع الجسيمات واحدة.
Abstract
تحليل ديناميات الانتشار من الجسيمات النانوية على غشاء الخلية يلعب دورا هاما في فهم أفضل لعملية امتصاص الخلوية ويوفر أساسا نظريا للتصميم العقلاني لتقديم الأدوية نانو. يمكن أن يسبر تحليل تتبع الجسيمات المفردة (SPT) موضع وتوجه الجسيمات النانوية الفردية على غشاء الخلية، ويكشف عن حالاتها الترجمية والدورانية. هنا، نعرض كيفية استخدام المجهر التقليدي في الحقل المظلم لمراقبة ديناميكيات نانورود الذهب (AuNRs) على غشاء الخلية الحية. كما نعرض كيفية استخراج موقع وتوجه AuNRs باستخدام ImageJ و MATLAB ، وكيفية توصيف الحالات المنتشرة في AuNRs. التحليل الإحصائي لمئات من الجسيمات تبين أن AuNRs واحد أداء حركة براونيان على سطح غشاء الخلية U87 MG. ومع ذلك، يظهر تحليل المسار الطويل الفردي أن لدى وحدات الـ “أو إن آر” نوعان مختلفان بشكل واضح من حالات الحركة على الغشاء، وهما النقل بعيد المدى والحبس المحدود المساحة. يمكن استخدام طرق SPT لدينا لدراسة انتشار الجسيمات داخل الخلايا أو السطح في الخلايا البيولوجية المختلفة ويمكن أن تصبح أداة قوية للتحقيقات في الآليات الخلوية المعقدة.
Introduction
ترتبط ديناميات الجسيمات النانوية (NPs) على الغشاء ارتباطًا وثيقًا بعملية الامتصاص الخلوية ، وهو أمر ضروري لفهم وظائف الخلايا والعدوى الفيروسية أو البكتيرية وتطوير أنظمة توصيل نانوميدية اصطناعية1،2. تقنية تتبع الجسيمات المفردة (SPT) هي أداة قوية لتميز السلوكيات غير المتجانسة لـ NPs3،4. بشكل عام، غشاء الخلية هو fluidic، مما يعني أن مكونات مثل البروتينات والدهون يمكن أن تتحرك أفقيا في الطائرة غشاء البلازما5،6،7. قد يؤدي التعقيد الزماني الزهيائي لتنظيم الغشاء وبنيته إلى عدم تجانس الزمانية في التفاعل بين مصادر القدرة النووية والغشاء. وبالتالي ، فإن التصور المباشر لحركة مصادر القدرة النووية على الغشاء يتطلب دقة مكانية وزمنية عالية.
تم تطوير المجهر تتبع الجسيمات واحد الذي يرصد توطين الجسيمات الفردية في الخلايا الحية مع القرار المكاني من عشرات نانومتر ودقة الوقت من ميلي ثانية لدراسة NPs أو ديناميات الجزيئات الغشاء8،9. وقد أصبحت تقنيات التصوير المجهري الفلورية المستندة إلى أدوات قيمة لمراقبة NPs / الجزيئات في بيئة الخلايا الحية9،10،11،12. على سبيل المثال ، تم استخدام المجهر الفلوري الداخلي الكلي ، الذي صور طبقات رقيقة (~ 100 نانومتر) من العينة في واجهة الركيزة / الحل مع دقة ارقائية عالية في دراسات ديناميات جزيئات الغشاء13،14. ومع ذلك ، فإن العيوب الكامنة في الفلوروفورات المفردة ، مثل الكثافة المنخفضة والضوائ السريع الذي لا رجعة فيه يقلل من دقة ومدة تتبع13. ولذلك، فإن NPs بلازمونية غير الفلورية، التي تحل محل المسابير الفلورية، جذبت المزيد والمزيد من الاهتمام في دراسات التصوير طويلة الأجل بسبب خصائصها البصرية الفريدة15. استنادا إلى إشارات تشتت تحقيقات NP plasmonic ، وقد استخدمت عدة أنواع من تقنيات التصوير المجهري البصري لدراسة آلية العمليات البيولوجية ، مثل المجهر في مجال الظلام (DFM)16، التداخل تشتت (iSCAT) المجهري17 والتداخل التفاضلي التباين المجهر (DICM)18. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الحصول على الحركة وتناوب دينامية AuNRs باستخدام سوق دبي المالي وDICM18،19،20،21،22. عادة، في تجربة SPT، يتم تسجيل حركة الجسم بواسطة المجهر البصري، ومن ثم تحليلها بواسطة أساليب التحليل SPT3. المسارات التي تم حلها في الوقت والزوايا التوجهية التي تولدها مصادر القدرة النووية الفردية عادة ما تكون عشوائية وغير متجانسة ، لذلك من الضروري تقديم معلومات ديناميكية وفيرة مع أساليب تحليل مختلفة.
هنا، نحن نقدم بروتوكول متكامل يراقب ديناميات AuNRs على غشاء الخلية باستخدام DFM، ويستخرج موقع واتجاه AuNRs مع ImageJ و MATLAB، ويميز انتشار AuNRs باستخدام أساليب التحليل SPT. وكعرض توضيحي، نعرض هنا كيفية استخدام بروتوكول SPT لتصور ديناميات أورون غير المعدلة (CTAB-AuNRs، التي يتم تصنيعها بواسطة جزيء بروميد الأمونيوم السيتيلتريلميثوم كعامل وقائي) على غشاء الخلية U87 MG. وقد ثبت أن CTAB-AuNRs يمكن أن adsorb البروتينات في البيئة البيولوجية، والانتقال على غشاء الخلية ومن ثم أدخل الخلايا2،20،22. U87 MG الخلية هو الورم الأكثر شيوعا والأكثر الخبيثة من الجهاز العصبي المركزي, ويتم التعبير عن مستقبلات الغشاء بشكل غير طبيعي. يمكن لمستقبلات الغشاء التفاعل مع البروتينات على AuNRs، والتي تؤثر على ديناميات أوارون. بروتوكولنا ينطبق بشكل عام على تجارب SPT الأخرى في مجال البيولوجيا.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتم استخدام البروتوكول المقدم لدراسة ديناميات الـ AuNRs على غشاء الخلية. ويتألف البروتوكول من أربعة أجزاء، بما في ذلك التصوير المجهري، واستخراج البيانات، وحساب المعايير الديناميكية، وطرق تحليل البيانات، وكل جزء مرن وعالمي. لذلك ، هناك العديد من التطبيقات المستقبلية المحتملة ، على سبيل ال?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية الصينية للعلوم الطبيعية بالأرقام التي منحتها 21425519 و91853105 و21621003.
Materials
| CTAB coated gold nanorods(CTAB-AuNRs) | Nanoseedz | NR-40-650 | 85 nm * 40 nm |
| Color CMOS camera | Olympus | DP74 | Japan |
| Coverslips | Citoglas | z10212222C | 22*22 mm |
| Dark-field microscopy | Nikon | 80i | upright microscope |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141 | |
| Fiji | National Institutes of Health | 2.0.0-rc-69/1.52 p | a distribution of ImageJ |
| Grooved glass slide | Sail brand | 7103 | Single concave |
| Image J | National Institutes of Health | 1.52 j | |
| MATLAB | MathWorks | R2019b | |
| MATLAB Code | https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020 | ||
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 10-010-CVR | with phenol red |
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 51200038 | no phenol red |
| Origin | OriginLab | Origin Pro 2018C | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353002 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353001 | 35*10 mm |
| U87 MG cell | American Type Culture Collection | ATCC HTB-14 | a human primary glioblastoma cell line |
Referencias
- Rees, P., Wills, J. W., Brown, M. R., Barnes, C. M., Summers, H. D. The origin of heterogeneous nanoparticle uptake by cells. Nature Communication. 10 (1), 2341 (2019).
- Behzadi, S., et al. Cellular uptake of nanoparticles: journey inside the cell. Chemical Society Reviews. 46 (14), 4218-4244 (2017).
- Shen, H., et al. Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications. Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).
- Saxton, M. J. Single-particle tracking: connecting the dots. Nature Methods. 5 (8), 671-672 (2008).
- Kusumi, A., et al. Dynamic organizing principles of the plasma membrane that regulate signal transduction: commemorating the fortieth anniversary of Singer and Nicolson’s fluid-mosaic model. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 215-250 (2012).
- Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. The Lateral Organization and Mobility of Plasma Membrane Components. Cell. 177 (4), 806-819 (2019).
- Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
- von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
- Rosenberg, J., Huang, J. Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (155), e59914 (2020).
- Kusumi, A., Tsunoyama, T. A., Hirosawa, K. M., Kasai, R. S., Fujiwara, T. K. Tracking single molecules at work in living cells. Nature Chemical Biology. 10 (7), 524-532 (2014).
- Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy – A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments. (151), e59387 (2019).
- Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Visualizing protein-DNA interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking. Journal of Visualized Experiments. (85), e511177 (2014).
- Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. Probing cellular events, one quantum dot at a time. Nature Methods. 7 (4), 275-285 (2010).
- Mehidi, A., et al. Transient Activations of Rac1 at the Lamellipodium Tip Trigger Membrane Protrusion. Current Biology. 29 (17), 2852-2866 (2019).
- Ye, Z., Wang, X., Xiao, L. Single-Particle Tracking with Scattering-Based Optical Microscopy. Analytical Chemistry. 91 (24), 15327-15334 (2019).
- Pan, Q., Zhao, H., Lin, X., He, Y. Spatiotemporal Heterogeneity of Reactions in Solution Observed with High-Speed Single-Nanorod Rotational Sensing. Angewandte Chemie. International Ed. in English. 58 (25), 8389-8393 (2019).
- Taylor, R. W., et al. Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane. Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).
- Chen, K., et al. Characteristic rotational behaviors of rod-shaped cargo revealed by automated five-dimensional single particle tracking. Nature Communication. 8 (1), 887 (2017).
- Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Y. Direct observation of the orientation dynamics of single protein-coated nanoparticles at liquid/solid interfaces. Angewandte Chemie. International Ed. in English. 53 (27), 6951-6955 (2014).
- Lehui, X., Yan, H., Edward, S. Y. Three Dimensional Orientational Imaging of Nanoparticles with Darkfield Microscopy. Analytical Chemistry. 82, 5268-5274 (2010).
- Ge, F., Xue, J., Wang, Z., Xiong, B., He, Y. Real-time observation of dynamic heterogeneity of gold nanorods on plasma membrane with darkfield microscopy. Science China Chemistry. 62, 1072-1081 (2019).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Janczura, J., Weron, A. Ergodicity testing for anomalous diffusion: small sample statistics. The Journal of Chemical Physics. 142 (14), 144103 (2015).
- Kim, D. H., et al. Single particle tracking-based reaction progress kinetic analysis reveals a series of molecular mechanisms of cetuximab-induced EGFR processes in a single living cell. Chemical Science. 8 (7), 4823-4832 (2017).
- Kurzthaler, C., et al. Probing the Spatiotemporal Dynamics of Catalytic Janus Particles with Single-Particle Tracking and Differential Dynamic Microscopy. Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).
- Lin, X., Pan, Q., He, Y. In situ detection of protein corona on single particle by rotational diffusivity. Nanoscale. 11 (39), 18367-18374 (2019).
- Wei, L., et al. Sub-diffraction-limit localization imaging of a plasmonic nanoparticle pair with wavelength-resolved dark-field microscopy. Nanoscale. 9 (25), 8747-8755 (2017).
- Cheng, X., Dai, D., Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Subdiffraction-limited plasmonic imaging with anisotropic metal nanoparticles. Analytical Chemistry. 86 (5), 2303-2307 (2014).
- Belyy, V., et al. PhotoGate microscopy to track single molecules in crowded environments. Nature Communication. 8, 13978 (2017).
