Summary

Muliggjør sanntidskompensasjon i raske fotokjemiske oksidasjoner av proteiner for bestemmelse av proteintopografiendringer

Published: September 01, 2020
doi:

Summary

Rask fotokjemisk oksidasjon av proteiner er en fremvoksende teknikk for strukturell karakterisering av proteiner. Ulike løsemiddeltilsetningsstoffer og ligandes har varierte hydroksylradikale scavenging egenskaper. For å sammenligne proteinstrukturen under forskjellige forhold, er sanntidskompensasjon av hydroksylradikaler generert i reaksjonen nødvendig for å normalisere reaksjonsforholdene.

Abstract

Rask fotokjemisk oksidasjon av proteiner (FPOP) er en massespektrometribasert strukturbiologiteknikk som sonderer det løsemiddeltilfredse overflatearealet av proteiner. Denne teknikken er avhengig av reaksjonen av aminosyre sidekjeder med hydroksylradikaler fritt diffusering i løsningen. FPOP genererer disse radikaler in situ ved laser fotolyse av hydrogenperoksid, og skaper et utbrudd av hydroksylradikaler som er utarmet i rekkefølgen av et mikrosekund. Når disse hydroksylradikale reagerer med en løsningsmiddeltil hjelp tilgjengelig aminosyre sidekjede, viser reaksjonsproduktene et masseskifte som kan måles og kvantifiseres ved massespektrometri. Siden reaksjonshastigheten av en aminosyre avhenger delvis av den gjennomsnittlige løsningsmiddeltilgjengelige overflaten av aminosyren, kan målte endringer i mengden oksidasjon av et gitt proteinområde være direkte korrelert til endringer i oppløsningsvæsketilgjengeligheten i den regionen mellom forskjellige konformasjoner (f.eks ligand-bundet versus ligand-fri, monomer vs. aggregert, etc.) FPOP har blitt brukt i en rekke problemer i biologi, inkludert protein-protein interaksjoner, protein konformasjonsendringer, og protein-ligand binding. Etter hvert som den tilgjengelige konsentrasjonen av hydroksylradikaler varierer basert på mange eksperimentelle forhold i FPOP-eksperimentet, er det viktig å overvåke den effektive radikale dosen som proteinanalyttet eksponeres for. Denne overvåkingen oppnås effektivt ved å innlemme en inline dosimeter for å måle signalet fra FPOP-reaksjonen, med laserflyt justert i sanntid for å oppnå ønsket mengde oksidasjon. Med denne kompensasjonen kan endringer i proteintopografi som gjenspeiler konformasjonsendringer, ligandbindende overflater og/eller proteininteraksjonsgrensesnitt bestemmes i heterogene prøver ved hjelp av relativt lave prøvemengder.

Introduction

Rask fotokjemisk oksidasjon av proteiner (FPOP) er en fremvoksende teknikk for bestemmelse av proteintografiske endringer ved ultrarask kovalent modifisering av det løsemiddelutsatte overflatearealet av proteiner etterfulgt av deteksjon av LC-MS1. FPOP genererer en høy konsentrasjon av hydroksylradikaler in situ ved UV laser flash fotolyse av hydrogenperoksid. Disse hydroksylradikale er svært reaktive og kortvarige, forbrukes på omtrent et mikrosekund tidsskala under FPOP forhold2. Disse hydroksylradikale diffuse gjennom vann og oksiderer ulike organiske komponenter i oppløsning ved kinetiske priser generelt fra rask (~ 106 M-1 s-1) til diffusjonskontrollert3. Når hydroksylradikale møter en proteinoverflate, vil radikaleren oksidere aminosyresidekjedene på proteinoverflaten, noe som resulterer i et masseskifte av den aminosyren (oftest nettotillegget av ett oksygenatom)4. Frekvensen av oksidasjonsreaksjonen ved en hvilken som helst aminosyre avhenger av to faktorer: den iboende reaktiviteten til aminosyren (som avhenger av sidekjeden og sekvenskonteksten)4,5 og tilgjengeligheten til sidekjeden til den diffuse hydroksylradikale, som nøye korrelerer til gjennomsnittlig løsningsmiddel tilgjengelig overflate6,,7. Alle standard aminosyrer unntatt glycin har blitt observert som merket av disse svært reaktive hydroksylradikale i FPOP eksperimenter, om enn ved vidt forskjellige utbytter; I praksis blir Ser, Thr, Asn og Ala sjelden sett på som oksidert i de fleste prøver unntatt under høye radikale doser og identifisert ved forsiktig og følsom målrettet ETD fragmentering8,9. Etter oksidasjon slukkes prøvene for å fjerne hydrogenperoksid og sekundære oksidanter (superoksid, enkeltoksygen, peptidyhydroperoksider osv.) De slukkede prøvene blir deretter proteolytisk fordøyd for å generere blandinger av oksidert peptider, hvor den strukturelle informasjonen er frosset som et kjemisk “øyeblikksbilde” i mønstrene til oksidasjonsprodukter av de ulike peptidene (figur 1). Flytende kromatografi kombinert med massespektrometri (LC-MS) brukes til å måle mengden oksidasjon av aminosyrer i et gitt proteolytisk peptid basert på de relative intensitetene i de oksiderte og ukoksidiserte versjonene av dette peptidet. Ved å sammenligne dette oksidative fotavtrykket av det samme proteinet oppnådd under forskjellige konformasjonsforhold (f.eks. ligand-bundet versus ligand-fri), kan forskjeller i mengden oksidasjon av et gitt proteinområde være direkte korrelert med forskjeller i det løsemiddeltilfredse overflatearealet i den regionen6,7. Evnen til å gi protein topografisk informasjon gjør FPOP til en attraktiv teknologi for høyere rekkefølge struktur bestemmelse av proteiner, inkludert i protein terapeutisk oppdagelse og utvikling10,11.

Figure 1
Figur 1: Oversikt over FPOP. Overflaten av proteinet er kovalent modifisert av svært reaktive hydroksylradikaler. Hydroksylradikale vil reagere med aminosyre sidekjeder av proteinet i en hastighet som er sterkt påvirket av løsemiddel tilgjengeligheten av sidekjeden. Topografiske endringer (for eksempel på grunn av bindingen av en ligand som vist ovenfor) vil beskytte aminosyrer i samhandlingsområdet fra å reagere med hydroksylradikale, noe som resulterer i en reduksjon i intensiteten av modifisert peptid i LC-MS-signalet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Ulike bestanddeler som finnes i FPOP-løsningen (f.eks. ligands, hjelpestoffer, buffere) har forskjellig scavenging aktivitet mot hydroksylradikale generert på laserfotolyse av hydrogenperoksid3. På samme måte kan en liten endring i peroksidkonsentrasjon, laserflyt og buffersammensetning endre den effektive radikale dosen, noe som gjør reproduksjonen av FPOP-data utfordrende på tvers av prøvene og mellom forskjellige laboratorier. Derfor er det viktig å kunne sammenligne hydroksylradikal dose tilgjengelig for å reagere med protein i hver prøve ved hjelp av en av flere tilgjengelige hydroksylradikale dosimeters12,13,,14,,15,,16. Hydroxylradikale dosimeters handle ved å konkurrere med analytten (og med alle scavengers i løsning) for bassenget av hydroksylradikale; den effektive dosen av hydroksylradikaler måles ved å måle mengden oksidasjon av dosimeteret. Legg merke til at “effektiv hydroksylradikal dose” er en funksjon av både den opprinnelige konsentrasjonen av hydroksylradikal generert og radikalens halveringstid. Disse to parametrene er delvis avhengige av hverandre, noe som gjør den teoretiske kinetiske modelleringen noe kompleks (figur 2). To prøver kan ha svært forskjellige innledende radikale halveringsliv samtidig som den opprettholder den samme effektive radikale dosen ved å endre den opprinnelige konsentrasjonen av hydroksylradikale dannet; de vil fortsatt generere identiske fotavtrykk17. Adenine13 og Tris12 er praktiske hydroksylradikale dosimeters fordi deres oksidasjonsnivå kan måles ved UV-spektroskopi i sanntid, slik at forskerne raskt kan identifisere når det er et problem med effektiv hydroksylradikal dose og for å feilsøke problemet. For å løse dette problemet er det viktig å finne en innebygd dosimeter i strømningssystemet rett etter bestrålingsstedet som kan overvåke signalet fra adeninabsorbansendringer i sanntid. Dette bidrar til å utføre FPOP eksperimenter i buffere eller andre hjelpestoffer med vidt forskjellige nivåer av hydroxyl radikal scavenging kapasitet17. Denne radikale doseringskompensasjonen kan utføres i sanntid, noe som gir statistisk umulige resultater for samme samsvar ved å justere den effektive radikale dosen.

I denne protokollen har vi detaljerte prosedyrer for å utføre et typisk FPOP-eksperiment med radikal doseringskompensasjon ved hjelp av adenin som en intern optisk radikal dosimeter. Denne metoden gjør det mulig for etterforskere å sammenligne fotavtrykk på tvers av FPOP-forhold som har forskjellig scavenging kapasitet ved å utføre kompensasjon i sanntid.

Figure 2
Figur 2: Kinetisk simulering av dosimetrybasert kompensasjon. 1 m Adenin dosimeter respons måles i 5 μM lysozymanalytt med en 1 mM innledende hydroksylradikal konsentrasjon (▪OH t1/2=53 ns), og satt som en måldoserrespons (svart). Ved tilsetning av 1 mM av scavenger hjelpende histidin, dosimeter respons (blå) reduseres sammen med mengden protein oksidasjon på en proporsjonal måte (cyan). Halveringstiden til hydroksylradikalen reduseres også (▪OH t1/2=39 ns). Når mengden hydroksylradikal generert økes for å gi et tilsvarende utbytte av oksidert dosimeter i prøven med 1 mM histidin scavenger som oppnås med 1 mM hydroksylradikal i fravær av scaveng (rød), mengden proteinoksidasjon som oppstår på samme måte blir identisk (magenta), mens hydroksylradikal halveringstid reduseres ytterligere (▪OH t1/2=29 ns). Tilpasset med tillatelse fra Sharp J.S., Am Pharmaceut Rev 22, 50-55, 2019. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

1. Klargjør den optiske benken og kapillæren for FPOP FORSIKTIG: KrF excimer lasere er ekstreme øyefarer, og direkte eller reflektert lys kan forårsake permanent øyeskade. Bruk alltid passende øyebeskyttelse, unngå tilstedeværelse av reflekterende gjenstander i nærheten av strålebanen når det er mulig, og bruk tekniske kontroller for å forhindre uautorisert tilgang til en aktiv laser og for å begrense eventuelle bortkommen refleksjoner. Klargjør den optiske FPOP-benken….

Representative Results

Sammenligning av det tunge kjedepeptidavtrykket til adalimumab biosimilar i fosfatbufferen og ved oppvarming ved 55 °C i 1 time viser interessante resultater. Studentens t-test brukes til identifisering av peptider som er betydelig endret under disse to forholdene (p ≤ 0,05). Peptidene 20-38, 99-125, 215-222, 223-252, 260-278, 376-413 og 414-420 viser betydelig beskyttelse mot løsemiddel når proteinet varmes opp for å danne aggregater (figur 5)30. Dette eksperim…

Discussion

Massespektrometribaserte strukturelle teknikker, inkludert hydrogendeuteriumutveksling, kjemisk krysskobling, kovalent merking og innfødt spraymassespektrometri og ionmobilitet har vokst raskt i popularitet på grunn av deres fleksibilitet, følsomhet og evne til å håndtere komplekse blandinger. FPOP har flere fordeler som har økt sin popularitet i området massespektrometribaserte strukturelle teknikker. Som de fleste kovalente merkingsstrategier gir det et stabilt kjemisk øyeblikksbilde av proteintopografi som er …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi anerkjenner forskningsmidler fra National Institute of General Medical Sciences stipend R43GM125420-01for å støtte kommersiell utvikling av en benkeplate FPOP enhet og R01GM127267 for utvikling av standardisering og dosimetry protokoller for høyenergi FPOP.

Materials

Adenine Acros Organics 147440250 Soluble in water upto 3.5 mM
Aperture Edmund Optics 39-905 1000 μm Aperture Diameter, Gold-Plated Copper Aperture
Aperture holder Edmund Optics 53-287 25.8mm Outer Diameter, Precision Pinhole Mount
Catalse Sigma Aldrich C-40 Catalase from bovine liver, lyophilized powder, ≥10,000 units/mg protein
COMPex Pro laser Coherent 1113836 COMPexPRO 102, F-Vversion, KrF laser, No XeCl
Dithiotheitol (DTT) Promega V3151 DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol)
Fraction collector GenNext Technologies, Inc. N/A Automated fraction collector
Fused silica capillay Molex 1068150023 Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 100 µm, Outer Diameter 375 µm, TSP100375
Glutamine Acros Organics 119951000 L(+)-Glutamine, 99%
Holder for lens Edmund Optics 03-668 53 mm Outer Diameter, Three-Screw Adjustable Ring Mount
Hydrogen peroxide Fisher Scientific H325-100 Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS), Fisher Chemical
LC-MS/MS system Thermo Scientific IQLAAEGAAPFADBMBCX Dionex Ultimate 3000 coupled to Orbitap Fusion Tribrid mass spectrometer
Mas spec grade Acetonitrile Fisher Scientific A955-1 Acetonitrile, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical
Mass spec grade formic acid Fisher Scientific A117-50 Formic Acid, 99.0+%, Optima™ LC/MS Grade, Fisher Chemical
Mass spec grade water Fisher Scientific W6-4 Water, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical
MES buffer Sigma Aldrich M0164 MES hemisodium salt
Methionine amide Bachem 4000594.0005 H-met-NH2.HCl
Micro V clamp Thor Labs VK250 Micro V-clamp with stainless steel blades
Motorized stage Edmund Optics 68-638 50mm Travel Motorized Stage System with Manual Control
Nano C18 colum Thermo Scientific 164534 Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns
Optical bench Edmund Optics 56-935 18" x 18" breadboard
Pioneer FPOP Module System GenNext Technologies, Inc. N/A Inline FPOP Radical Dosimetry System
Post holder Edmund Optics 58-979 3" Length, ¼-20 Thread, Post Holder
Sodium phosphate dibasic Fisher Scientific BP331-500 Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate (Colorless-to-White Crystals), Fisher BioReagents
Sodium phosphate monobasic Fisher Scientific BP330-500 Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (Colorless-to-white Crystals), Fisher BioReagents
Syringe Hamilton 81065 100 µL, Model 1710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 3
Syringe pump KD Scientific 788101 Legato 101 syringe pump
Trap C18 column Thermo Scientific 160454 Thermo Scientific Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns
Tris Sigma Aldrich 252859 Tris(hydroxymethyl)aminomethane
Trypsin Promega V5111 Sequencing Grade Modified Trypsin
UV plano convex lens Edmund Optics 84-285 30 mm Dia. x 120 mm FL Uncoated, UV Plano-Convex Lens

Referencias

  1. Kaur, P., Kiselar, J., Yang, S., Chance, M. R. Quantitative protein topography analysis and high-resolution structure prediction using hydroxyl radical labeling and tandem-ion mass spectrometry (MS). Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 1159-1168 (2015).
  2. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).
  3. Buxton, G. V., Greenstock, C. L., Helman, W. P., Ross, A. B. Critical review of rate constants for reactions of hydrated electrons, hydrogen atoms and hydroxyl radicals (·OH/·O- in Aqueous Solution. Journal of Physical and Chemical Reference Data. 17 (2), 513 (1988).
  4. Xu, G., Chance, M. R. Radiolytic modification and reactivity of amino acid residues serving as structural probes for protein footprinting. Analytical Chemistry. 77 (14), 4549-4555 (2005).
  5. Sharp, J. S., Tomer, K. B. Effects of anion proximity in peptide primary sequence on the rate and mechanism of leucine oxidation. Analytical Chemistry. 78 (14), 4885-4893 (2006).
  6. Huang, W., Ravikumar, K. M., Chance, M. R., Yang, S. Quantitative mapping of protein structure by hydroxyl radical footprinting-mediated structural mass spectrometry: a protection factor analysis. Biophysical Journal. 108 (1), 107-115 (2015).
  7. Xie, B., Sood, A., Woods, R. J., Sharp, J. S. Quantitative protein topography measurements by high resolution hydroxyl radical protein footprinting enable accurate molecular model selection. Scientific Reports. 7 (1), 4552 (2017).
  8. Li, Z., et al. High structural resolution hydroxyl radical protein footprinting reveals an extended Robo1-heparin binding interface. Journal of Biological Chemistry. 290 (17), 10729-10740 (2015).
  9. Li, X., et al. Structural analysis of the glycosylated intact HIV-1 gp120-b12 antibody complex using hydroxyl radical protein footprinting. Bioquímica. 56 (7), 957-970 (2017).
  10. Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. Mass spectrometry-based fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) for higher order structure characterization. Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).
  11. Li, J., Chen, G. The use of fast photochemical oxidation of proteins coupled with mass spectrometry in protein therapeutics discovery and development. Drug Discovery Today. 24 (3), 829-834 (2019).
  12. Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Intrinsic buffer hydroxyl radical dosimetry using Tris(hydroxymethyl)aminomethane. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).
  13. Xie, B., Sharp, J. S. Hydroxyl radical dosimetry for high flux hydroxyl radical protein footprinting applications using a simple optical detection method. Analytical Chemistry. 87 (21), 10719-10723 (2015).
  14. Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP). Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).
  15. Niu, B., et al. Incorporation of a reporter peptide in FPOP compensates for adventitious scavengers and permits time-dependent measurements. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (2), 389-392 (2017).
  16. Garcia, N. K., Sreedhara, A., Deperalta, G., Wecksler, A. T. Optimizing hydroxyl radical footprinting analysis of biotherapeutics using internal standard dosimetry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1563-1571 (2020).
  17. Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. Real time normalization of fast photochemical oxidation of proteins experiments by inline adenine radical dosimetry. Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).
  18. Zhang, B., Cheng, M., Rempel, D., Gross, M. L. Implementing fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) as a footprinting approach to solve diverse problems in structural biology. Methods. 144, 94-103 (2018).
  19. Konermann, L., Stocks, B. B., Czarny, T. Laminar flow effects during laser-induced oxidative labeling for protein structural studies by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (15), 6667-6674 (2010).
  20. Gau, B. C., Sharp, J. S., Rempel, D. L., Gross, M. L. Fast photochemical oxidation of protein footprints faster than protein unfolding. Analytical Chemistry. 81 (16), 6563-6571 (2009).
  21. Li, K. S., et al. Hydrogen-Deuterium exchange and hydroxyl radical footprinting for mapping hydrophobic interactions of human bromodomain with a small molecule Inhibitor. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2795-2804 (2019).
  22. Espino, J. A., Jones, L. M. Illuminating biological interactions with in vivo protein footprinting. Analytical Chemistry. 91 (10), 6577-6584 (2019).
  23. Charvatova, O., et al. Quantifying protein interface footprinting by hydroxyl radical oxidation and molecular dynamics simulation: application to galectin-1. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 19 (11), 1692-1705 (2008).
  24. Gau, B., Garai, K., Frieden, C., Gross, M. L. Mass spectrometry-based protein footprinting characterizes the structures of oligomeric apolipoprotein E2, E3, and E4. Bioquímica. 50 (38), 8117-8126 (2011).
  25. Gau, B. C., Chen, J., Gross, M. L. Fast photochemical oxidation of proteins for comparing solvent-accessibility changes accompanying protein folding: Data processing and application to barstar. Biochimica et Biophysica Acta. 1834 (6), 1230-1238 (2013).
  26. Garrison, W. M. Reaction mechanisms in the radiolysis of peptides, polypeptides, and proteins. Chemical Reviews. 87 (2), 381-398 (1987).
  27. Xu, G., Chance, M. R. Radiolytic modification of sulfur-containing amino acid residues in model peptides: fundamental studies for protein footprinting. Analytical Chemistry. 77 (8), 2437-2449 (2005).
  28. Xu, G., Chance, M. R. Radiolytic modification of acidic amino acid residues in peptides: probes for examining protein-protein interactions. Analytical Chemistry. 76 (5), 1213-1221 (2004).
  29. Xu, G., Takamoto, K., Chance, M. R. Radiolytic modification of basic amino acid residues in peptides: probes for examining protein-protein interactions. Analytical Chemistry. 75 (24), 6995-7007 (2003).
  30. Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Compensated hydroxyl radical protein footprinting measures buffer and excipient effects on conformation and aggregation in an adalimumab biosimilar. AAPS Journal. 21 (5), 87 (2019).
  31. Simmons, D. A., Konermann, L. Characterization of transient protein folding intermediates during myoglobin reconstitution by time-resolved electrospray mass spectrometry with on-line isotopic pulse labeling. Bioquímica. 41 (6), 1906-1914 (2002).
  32. Vahidi, S., Konermann, L. Probing the time scale of FPOP (fast photochemical oxidation of proteins): radical reactions extend over tens of milliseconds. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (7), 1156-1164 (2016).
  33. Chance, M. R. Unfolding of apomyoglobin examined by synchrotron footprinting. Biochemical and Biophysical Research Communications. 287 (3), 614-621 (2001).
  34. Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).
  35. Zhang, Y., Rempel, D. L., Zhang, H., Gross, M. L. An improved fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) platform for protein therapeutics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (3), 526-529 (2015).
  36. Cornwell, O., Radford, S. E., Ashcroft, A. E., Ault, J. R. Comparing hydrogen deuterium exchange and fast photochemical oxidation of proteins: a structural characterisation of wild-type and ΔN6 β(2)-microglobulin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (2), 2413-2426 (2018).
  37. Xie, B., Sharp, J. S. Relative Quantification of sites of peptide and protein modification using size exclusion chromatography coupled with electron transfer dissociation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (8), 1322-1327 (2016).
  38. Srikanth, R., Wilson, J., Vachet, R. W. Correct identification of oxidized histidine residues using electron-transfer dissociation. Journal of Mass Spectrometry. 44 (5), 755-762 (2009).
  39. Li, X., Li, Z., Xie, B., Sharp, J. S. Improved identification and relative quantification of sites of peptide and protein oxidation for hydroxyl radical footprinting. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (11), 1767-1776 (2013).
  40. Li, X., Li, Z., Xie, B., Sharp, J. S. Supercharging by m-NBA Improves ETD-Based Quantification of Hydroxyl Radical Protein Footprinting. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (8), 1424-1427 (2015).
  41. Khaje, N. A., Sharp, J. S. Rapid quantification of peptide oxidation isomers from complex mixtures. Analytical Chemistry. 92 (5), 3834-3843 (2020).

Play Video

Citar este artículo
Misra, S. K., Sharp, J. S. Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes. J. Vis. Exp. (163), e61580, doi:10.3791/61580 (2020).

View Video