Hurtig fotokemisk oxidation af proteiner er en ny teknik til strukturel karakterisering af proteiner. Forskellige opløsningsmiddeltilsætningsstoffer og ligands har varieret hydroxyl radikale skyllevæske egenskaber. For at sammenligne proteinstrukturen under forskellige forhold kræves der en real-time kompensation af hydroxyl radikaler genereret i reaktionen for at normalisere reaktionsbetingelserne.
Hurtig fotokemisk oxidation af proteiner (FPOP) er en massespektrometribaseret strukturel biologiteknik, der sonderer proteiners opløsningsmiddeltilgængelige overfladeareal. Denne teknik er afhængig af reaktionen fra aminosyre sidekæder med hydroxyl radikaler frit sprede i opløsning. FPOP genererer disse radikaler in situ ved laser fotolyse af hydrogenperoxid, hvilket skaber en byge af hydroxyl radikaler, der er opbrugt på bestilling af et mikrosekund. Når disse hydroxyl radikaler reagerer med en opløsningsmiddel-tilgængelig aminosyre sidekæde, reaktionsprodukterne udviser en masse skift, der kan måles og kvantificeres ved massespektrometri. Da en aminosyres reaktionshastighed til dels afhænger af den gennemsnitlige tilgængelige opløsningsmiddeloverflade af den pågældende aminosyre, kan målte ændringer i mængden af oxidation af et givet proteinområde være direkte korreleret med ændringer i opløsningsmiddeltilgængeligheden i den pågældende region mellem forskellige konformeringer (f.eks. ligandbundet versus ligandfri, monomer vs. aggregat osv.) FPOP er blevet anvendt i en række problemer i biologi, herunder protein-protein interaktioner, protein kropslige ændringer, og protein-ligand bindende. Da den tilgængelige koncentration af hydroxyl radikaler varierer baseret på mange eksperimentelle betingelser i FPOP eksperiment, er det vigtigt at overvåge den effektive radikale dosis, som proteinanalyt er udsat for. Denne overvågning opnås effektivt ved at indarbejde et inline dosimeter til måling af signalet fra FPOP-reaktionen, med laserfluence justeret i realtid for at opnå den ønskede mængde oxidation. Med denne kompensation kan ændringer i proteintopografi, der afspejler konformationelle ændringer, ligandbindende overflader og/eller proteinproteininteraktionsgrænseflader, bestemmes i heterogene prøver ved hjælp af relativt lave prøvemængder.
Hurtig fotokemisk oxidation af proteiner (FPOP) er en ny teknik til bestemmelse af proteintopografiske ændringer ved ultrahurtig kovaent ændring af proteiners opløsningsmiddeludsynlige overfladeareal efterfulgt af påvisning af LC-MS1. FPOP genererer en høj koncentration af hydroxyl radikaler in situ ved UV laser flash fotolyse af hydrogenperoxid. Disse hydroxyl radikaler er meget reaktive og kortvarig, forbruges på nogenlunde en microsecond tidsskala under FPOP betingelser2. Disse hydroxyl radikaler diffus gennem vand og oxidere forskellige organiske komponenter i opløsning ved kinetiske satser generelt spænder fra hurtig (~ 106 M-1 s-1) til diffusion-kontrollerede3. Når hydroxyl radikal støder på et protein overflade, den radikale vil oxidere aminosyren sidekæder på proteinoverfladen, hvilket resulterer i en masse skift af denne aminosyre (oftest netto tilsætning af en ilt atom)4. Oxidationsreaktionen ved enhver aminosyre afhænger af to faktorer: den iboende reaktivitet af denne aminosyre (som afhænger af sidekæden og sekvenskonteksten)4,5 ogtilgængeligheden af denne sidekæde til den spredende hydroxylrifrielle, som korrelerer tæt til det gennemsnitlige opløsningsmiddel, der er tilgængeligtoverfladeareal6,7. Alle standard aminosyrer undtagen glycin er blevet observeret som mærket af disse meget reaktive hydroxyl radikaler i FPOP eksperimenter, om end ved vidt forskellige udbytter; i praksis ses Ser, Thr, Asn og Ala sjældent som oxideret i de fleste prøver undtagen under høje radikale doser og identificeres ved omhyggelig og følsom målrettet MÅLRETTET ETD-fragmentering8,9. Efter oxidation slukkes prøverne for at fjerne hydrogenperoxid og sekundære oxidanter (superoxid, singlet oxygen, peptidylhydroxider osv.) De slukkete prøver fordøjes derefter proteolytisk for at generere blandinger af oxiderede peptider, hvor de strukturelle oplysninger fryses som et kemisk “øjebliksbillede” i mønstrene for oxidationsprodukter af de forskellige peptider (figur 1). Flydende kromatografi koblet til massespektrometri (LC-MS) anvendes til at måle mængden af oxidation af aminosyrer i et givet proteolytisk peptid baseret på de relative intensiteter af de oxiderede og ikke-oxiderede versioner af det pågældende peptid. Ved at sammenligne dette oxidative fodaftryk af det samme protein, der er fremstillet under forskellige konformationsforhold (f.eks. ligandbundet versus ligandfri), kan forskelle i mængden af oxidation af et givet område af proteinet korreleres direkte med forskelle i det opløsningsmiddeltilgængelige overfladeareal i den pågældende region6,7. Evnen til at give protein topografisk information gør FPOP en attraktiv teknologi til højere orden struktur bestemmelse af proteiner, herunder i protein terapeutisk opdagelse og udvikling10,11.
Figur 1: Oversigt over FPOP. Overfladen af proteinet er kovalent modificeret af meget reaktive hydroxyl radikaler. Hydroxyl radikaler vil reagere med aminosyre sidekæder af proteinet med en hastighed, der er stærkt påvirket af opløsningsmiddel tilgængelighed af sidekæden. Topografiske ændringer (f.eks. på grund af bindingen af en ligand som vist ovenfor) vil beskytte aminosyrer i interaktionsregionen mod at reagere med hydroxyl radikaler, hvilket resulterer i et fald i intensiteten af modificeret peptid i LC-MS signal. Klik her for at se en større version af dette tal.
Forskellige bestanddele, der findes i FPOP-opløsningen (f.eks. ligander, hjælpestoffer, buffere), har forskellige skylleaktivitet i forhold til hydroxyldriberne, der genereres på laserfotolyse af hydrogenperoxid3. Tilsvarende kan en lille ændring i peroxid koncentration, laser fluence, og buffer sammensætning ændre den effektive radikale dosis, hvilket gør reproduktion af FPOP data udfordrende på tværs af prøverne og mellem forskellige laboratorier. Det er derfor vigtigt at kunne sammenligne den hydroxylriske dosis, der er tilrådighed,til at reagere med protein i hver prøve ved hjælp af et af flere tilgængelige hydroxylrekromiske dosimeterer12,13,14,15,16. Hydroxyl radikale dosimetre handle ved at konkurrere med analysand (og med alle skyllevæsker i opløsning) for puljen af hydroxyl radikaler; den effektive dosis af hydroxyl radikaler måles ved at måle mængden af oxidation af dosimeteret. Bemærk, at “effektiv hydroxyl radikal dosis” er en funktion af både den oprindelige koncentration af hydroxyl radikale genereret og halveringstid af den radikale. Disse to parametre er delvist afhængige af hinanden, hvilket gør den teoretiske kinetiske modellering noget kompleks (figur 2). To prøver kunne have vildt forskellige indledende radikale halveringsliv og samtidig opretholde den samme effektive radikale dosis ved at ændre den oprindelige koncentration af hydroxyl radikale dannet; de vil stadig generere identiske fodspor17. Adenin13 og Tris12 er praktisk hydroxyl radikale dosimeterer, fordi deres niveau af oxidation kan måles ved UV spektroskopi i realtid, giver mulighed for forskere til hurtigt at identificere, når der er et problem med effektiv hydroxyl radikal dosis og til fejlfinding af deres problem. For at løse dette problem er et inline dosimeter placeret i flowsystemet umiddelbart efter bestrålingsstedet, der kan overvåge signalet fra adeninabsorbanceændringer i realtid, vigtigt. Dette hjælper med at udføre FPOP-forsøg i buffere eller andre hjælpestoffer med vidt forskellige niveauer af hydroxylremmelig skyllekapacitet17. Denne radikale dosering kompensation kan udføres i realtid, giver statistisk skelnes resultater for den samme konforme ved at justere den effektive radikale dosis.
I denne protokol, Vi har detaljerede procedurer for at udføre en typisk FPOP eksperiment med radikale dosering kompensation ved hjælp af adenin som en intern optisk radikal dosimeter. Denne metode gør det muligt for efterforskere at sammenligne fodspor på tværs af FPOP-forhold, der har forskellige skyllekapacitet ved at udføre kompensation i realtid.
Figur 2: Kinetisk simulering af dosimetribaseret kompensation. 1 mM adenin dosimeter respons måles i 5 μM lysozym analysand med en 1 mM indledende hydroxyl radikal koncentration (▪OH t1/2=53 ns), og indstilles som et mål dosimeter respons (sort). Ved tilsætning af 1 mM af scavenger excipient histidin, dosimeter respons (blå) falder sammen med mængden af protein oxidation i en proportional måde (cyan). Halveringstiden for hydroxyl radikalen falder også (▪OH t1/2=39 ns). Når mængden af hydroxyl radikal genereret øges for at give et tilsvarende udbytte af oxideret dosimeter i prøven med 1 mM histidine skyllevæske som opnået med 1 mM hydroxyl radikal i mangel af sca (rød), mængden af proteinoxidation, der opstår på samme måde bliver identisk (magenta), mens hydroxyl radikale halveringstid falder endnu mere (▪OH t1 / 2=29 ns). Tilpasset med tilladelse fra Sharp J.S., Am Pharmaceut Rev 22, 50-55, 2019. Klik her for at se en større version af dette tal.
Massespektrometri-baserede strukturelle teknikker, herunder hydrogen-deuterium udveksling, kemiske krydsbinding, kovalent mærkning, og indfødte spray massespektrometri og ion mobilitet har været hastigt voksende i popularitet på grund af deres fleksibilitet, følsomhed og evne til at håndtere komplekse blandinger. FPOP kan prale af flere fordele, der har øget sin popularitet inden for massespektrometri-baserede strukturelle teknikker. Ligesom de fleste kovalente mærkning strategier, giver det en stabil kemisk øje…
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender forskningsmidler fra National Institute of General Medical Sciences tilskud R43GM125420-01for at støtte kommerciel udvikling af en benchtop FPOP enhed og R01GM127267 til udvikling af standardisering og dosimetri protokoller for høj-energi FPOP.
Adenine | Acros Organics | 147440250 | Soluble in water upto 3.5 mM |
Aperture | Edmund Optics | 39-905 | 1000 μm Aperture Diameter, Gold-Plated Copper Aperture |
Aperture holder | Edmund Optics | 53-287 | 25.8mm Outer Diameter, Precision Pinhole Mount |
Catalse | Sigma Aldrich | C-40 | Catalase from bovine liver, lyophilized powder, ≥10,000 units/mg protein |
COMPex Pro laser | Coherent | 1113836 | COMPexPRO 102, F-Vversion, KrF laser, No XeCl |
Dithiotheitol (DTT) | Promega | V3151 | DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol) |
Fraction collector | GenNext Technologies, Inc. | N/A | Automated fraction collector |
Fused silica capillay | Molex | 1068150023 | Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 100 µm, Outer Diameter 375 µm, TSP100375 |
Glutamine | Acros Organics | 119951000 | L(+)-Glutamine, 99% |
Holder for lens | Edmund Optics | 03-668 | 53 mm Outer Diameter, Three-Screw Adjustable Ring Mount |
Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS), Fisher Chemical |
LC-MS/MS system | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Dionex Ultimate 3000 coupled to Orbitap Fusion Tribrid mass spectrometer |
Mas spec grade Acetonitrile | Fisher Scientific | A955-1 | Acetonitrile, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical |
Mass spec grade formic acid | Fisher Scientific | A117-50 | Formic Acid, 99.0+%, Optima™ LC/MS Grade, Fisher Chemical |
Mass spec grade water | Fisher Scientific | W6-4 | Water, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical |
MES buffer | Sigma Aldrich | M0164 | MES hemisodium salt |
Methionine amide | Bachem | 4000594.0005 | H-met-NH2.HCl |
Micro V clamp | Thor Labs | VK250 | Micro V-clamp with stainless steel blades |
Motorized stage | Edmund Optics | 68-638 | 50mm Travel Motorized Stage System with Manual Control |
Nano C18 colum | Thermo Scientific | 164534 | Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns |
Optical bench | Edmund Optics | 56-935 | 18" x 18" breadboard |
Pioneer FPOP Module System | GenNext Technologies, Inc. | N/A | Inline FPOP Radical Dosimetry System |
Post holder | Edmund Optics | 58-979 | 3" Length, ¼-20 Thread, Post Holder |
Sodium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP331-500 | Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate (Colorless-to-White Crystals), Fisher BioReagents |
Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP330-500 | Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (Colorless-to-white Crystals), Fisher BioReagents |
Syringe | Hamilton | 81065 | 100 µL, Model 1710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 3 |
Syringe pump | KD Scientific | 788101 | Legato 101 syringe pump |
Trap C18 column | Thermo Scientific | 160454 | Thermo Scientific Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns |
Tris | Sigma Aldrich | 252859 | Tris(hydroxymethyl)aminomethane |
Trypsin | Promega | V5111 | Sequencing Grade Modified Trypsin |
UV plano convex lens | Edmund Optics | 84-285 | 30 mm Dia. x 120 mm FL Uncoated, UV Plano-Convex Lens |