통합 된 라이브 셀 모니터링을 통해 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 피질 및 도파민 뉴런의 자동화 된 생산

1. 세포 배양 및 이미징 자동화를 위한 기본 절차 새로운 문화 접시와 팁로드 GUI를 열고 리소스/계측기 프로세스 보기 버튼을 클릭합니다. 리소스/계측기 프로세스를 실행하려면 리소스/계측기 프로세스를 선택하고 실행 계측기 프로세스 버튼을 클릭합니다. 리소스 프로세스 RunHepaHood 및 다시 로드실행(1.1.1 단계 참조). 도어를 열고 제어 PC의 팝업 이미지에 표시된 바와 같이 셀 배양 플레이트 및 일회용 팁을 해당 위치에 로드합니다. 오염 제거를 위해 70% 에탄올로 문을 닦고 닫습니다. GUI에서 오염 제거 를 해제하는 계측기 공정을 실행합니다(1.1.1 단계 참조). 이 시스템은 30 분 동안 UV 방사선에 의해 멸균됩니다. 리필 문화 매체 및/또는 해리 시약 계측기 단계 RunHepahood를 실행합니다(1.1.1 단계 참조). 액체 취급 스테이션의 정문을 엽니다. 70%에탄올로 저수지(미디어, PBS 및/또는 해리 시약 포함)를 오염 제거하고 덱에 배치(cfg.csv 파일에 정의된 대로). 저장소를 디뚜껑을 닫습니다. 70%의 에탄올로 문을 오염제거하고 닫습니다. GUI에서 리소스/계측기 프로세스 “InitHepaHood”를 실행하여 HEPA 후드를 전원을 공급합니다. GUI에서 새 “셀라인” 및 프로젝트 만들기 컨피그(*.cfg.csv), 가져오기(*.imp.csv), 리소스(*.rsv.csv) 및 워크플로(*.wfl.csv) 파일로 구성된 사용자 정의 “셀 라인” 파일을 생성/수정합니다. GUI를 열고 “셀라인 편집기” 보기에서 셀라인 추가 버튼을 클릭하여 새 “셀라인”을 만듭니다. Config 파일을 선택해야 하는 마법사가 열리고 설명이 짧은 프로젝트 이름을 입력해야 합니다. 녹색 화살표헤드를 사용하여 이 마법사를 탐색하고 녹색 체크표시를 클릭하여 설정을 확인합니다. 프로젝트 추가 단추를 클릭하여 생성된 “셀라인”에 대한 새 프로젝트를 만듭니다. 프로젝트 이름과 설명을 입력하고 GUI의 캘린더 뷰에 표시되는 프로젝트 색상을 정의합니다. 화살표헤드를 클릭하여 마법사의 다음 페이지로 이동합니다. 배치 추가 단추를 클릭하고 팝업 창에 짧은 이름과 설명을 제공하여 새 배치를 만듭니다. 모든 프로세스 단계를 선택하고 각 프로세스 단계에 대한 시작 시간을 예약합니다. 확인을클릭하여 창을 닫습니다. GUI를 사용하여 자동화된 메서드 실행 GUI의 캘린더 보기로 이동하여 프로세스 추가 단계 버튼을 클릭합니다. 셀줄을 선택하고 마법사의 다음 페이지로 이동한 후 프로젝트를 선택합니다. 사용할 배치를 표시하고 오른쪽을 가리키는 화살표헤드를 클릭합니다. 사용되는 방법에 따라 일괄 처리는 비어 있거나(새 플레이트 수신을 위해) 배양 판 또는 분석 플레이트(다른 모든 프로세스)를 포함해야 합니다. 마법사의 다음 페이지로 이동하여 실행해야 하는 프로세스 단계를 선택합니다. 이 마법사의 마지막 페이지로 이동하여 실험을 예약합니다. 메서드를 실행하는 데 필요한 “매개 변수 세부 정보” 변수 섹션에서 수정할 수 있습니다. 확인을클릭하여 확인을 클릭하여 확인합니다. CO2 인큐베이터에 문화 및 분석 플레이트를 적재참고: 1웰 플레이트는 일반적으로 대량 세포에 사용되기 때문에 배양 판으로 정의됩니다. 모든 멀티웰 플레이트는 분석 플레이트로 정의됩니다. 1.1.1 단계에서 설명된 대로 GUI에서 계측기 공정 “RunHepaHood”를 실행합니다. 로봇 팔 앞에서 문을 엽니다. 자동 이미징을 위해 플레이트를 적재하면 70% 에탄올과 보풀이 없는 조직으로 분석 플레이트의 바닥을 닦아냅니다. 왼쪽 선반에 문화권 이나 분석 판을 놓습니다. 플레이트의 방향이 올바른지 확인합니다. 분석 판의 경우, 잘 A1은 배양 판의 가장자리가 오른쪽을 가리키는 동안 로봇 팔을 가리킨다. 오염 제거를 위해 70% 에탄올로 문을 닦고 닫습니다. 1.4 단계에서 설명된 다중 웰 플레이트를 가져오기 위한 1웰 플레이트 또는 “분석 플레이트로드”를 가져오기 위한 “배양 플레이트 로드”를 실행합니다. 빈 배치를 사용하여 두 메서드를 모두 실행합니다. 플레이트 바코드가 이 배치에 이미 있는 경우 확인란을 클릭하여 선택 해제합니다. 로봇 팔을 사용하여 선반에서 CO2 인큐베이터 플랫폼으로 개별 플레이트를 운반합니다. 내장 플레이트 셔틀 스테이션은 접시를 회수하고 CO2 인큐베이터의 랙 중 하나에 저장합니다. 세포는 37°C 및 5% CO2로유지된다. CO2 인큐베이터에서 플레이트 하역 메서드 “언로드 플레이트”를 실행합니다(1.4단계 참조). 내보내야 하는 플레이트가 포함된 일괄 처리를 선택합니다. 개별 플레이트는 바코드로 선택할 수 있습니다. 로봇 팔을 사용하여 CO2 인큐베이터에서 왼쪽 선반으로 플레이트를 운반합니다. 1.1.1 단계에서 설명한 대로 계측기 공정 “RunHepaHood”를 사용하여 HEPA 후드를 시작합니다. 로봇 팔 앞에서 문을 엽니다. 접시를 제거하고 문을 70% 에탄올로 오염제거한 후 닫고 HEPA 후드를 전원을 공급합니다. 2. 자동화 프로토콜 튜브에서 플레이트 의 씨앗 계측기 프로세스 RunHepaHood를 실행하여 HEPA 후드를 시작합니다(1.1.1 단계 참조). 액체 처리 스테이션 앞의 문을 엽니다. 셀 서스펜션을 포함하는 50mL 튜브를 입력하고 튜브를 디뚜껑을 디리드한다. 로봇 팔 앞의 문을 열고 선반에 셀을 수신하기 위해 코팅 된 배양 판을로드합니다. 오염을 제거하고 두 문을 닫습니다. “튜브에서 플레이트 의 파싱”메서드를 실행합니다(1.4단계 참조). 직접 세포 계수 기능을 사용하여 밝은 필드 이미징 세포계에서 세포를 계산합니다. 셀 계산의 경우 16개의 웰을 384웰 플레이트 형식으로 복제하는 것처럼 사용하십시오. 384웰 카운팅 플레이트를 로봇 팔을 사용하여 턴테이블을 통해 밝은 필드 이미징 사이토미터로 운반하고 이미징 프로세스를 시작합니다. 사이토미터는 밀리리터당 세포 수를 자동으로 결정합니다. 로봇 팔을 사용하여 카운팅 플레이트를 원래 위치로 되돌려 놓습니다. 코팅된 배양 또는 분석판을 선반에서 로봇 팔을 사용하여 파이프팅 데크로 운반합니다. 사용자 정의 번호및 플레이트 포맷에 적합한 부피에서 코팅 및 종자 세포를 제거합니다(표 1참조). 전지 분배를 위해 500rpm에서 10s의 온데크 셰이커로 플레이트를 이동하고 CO2 인큐베이터로 옮김합니다. 자동 합류 평가 1.4 단계에서 설명된 대로 “인플루엔시확인”메서드를 실행합니다. 하나 이상의 배양 판과 분석 플레이트가 없는 일괄 처리를 선택합니다. 섹션에서 이미지 수집 및 이미징 분석 설정에 대한 “매개 변수 세부 사항”입력 “iPSCf_2020”. 첫 번째 플레이트를 CO2 인큐베이터에서 로봇 암을 사용하여 턴테이블을 통해 밝은 필드 이미징 사이토미터로 운반합니다. hiPSC 식민지의 합류 검사를 위한 밝은 필드 화상 진찰 세포계에 있는 세포의 화상 진찰을 수행합니다. “합류” 응용 프로그램 및 이미지 13 1-잘 파테의 필드를 사용 하 여 자동으로 셀에 의해 점유 평균 영역을 계산 합니다. 로봇 암을 사용하여 플레이트를 CO2 인큐베이터로 다시 운반합니다. 2.2.2 단계를 반복합니다. 2.2.4. 나머지 플레이트의 경우. 문화 판 또는 분석 판의 미디어 변경 1.4 단계에서 설명한 대로 “문화 판의 미디어 변경”을 실행합니다. 배양판만 포함하는 일괄 처리를 선택합니다. “매개 변수 세부 정보”섹션의 파이프팅 단계에 팁이나 바늘이 사용되는지 여부를 나타내는 변수를 설정합니다. 멀티웰 플레이트의 미디어 변경을 위해 “분석 플레이트의 미디어 변경” 메서드를 실행하고 분석 플레이트가 포함된 배치를 선택합니다. CO2 인큐베이터에서 로봇 팔을 사용하여 개별 플레이트를 갑판으로 운반하고 플레이트를 디뚜껑을 닫습니다. 플레이트를 자동으로 기울이고 오래된 미디어를 흡인하고 폐기하여 폐기 수거 모듈에 버리십시오. 신선한 미디어의 12 mL을 추가합니다. 플레이트를 다시 뚜껑을 닫고 로봇 암을 사용하여 플레이트를 CO2 인큐베이터로 다시 운반합니다. 하위 육성참고: 1.1.1에 설명된 대로 GUI에서 계측기 프로세스 “RunHepaHood”를 실행합니다. 액체 처리 스테이션의 정문을 엽니다. 필요한 위치에서 미디어 및 해리 시약을 로드합니다(1.2단계 참조). 팁을 다시 작성해야 하는 경우 1.1단계에서 설명한 대로 “다시 로드”를 사용합니다. 셀 서스펜션을 수신하기 위한 50mL 튜브를 입력하고 튜브를 디뚜껑을 디리드한다. 메서드 “준수 셀의 하위 재배”를 실행합니다(1.4단계 참조). 하위 배양이 필요한 배양 판이 포함된 배치를 선택합니다. CO2 인큐베이터에서 로봇 팔을 사용하여 플레이트를 갑판으로 운반하고 플레이트를 디뚜껑을 닫습니다. 플레이트를 자동으로 기울이고 오래된 미디어를 제거하고 폐기 회수 모듈에 버리십시오. PBS8mL로 한 번 세척합니다. 0.5mM EDTA의 8mL를 추가하여 덩어리 기반 의 패싱을 합니다. 갑판에서 8 분 동안 배양하십시오. 플레이트에서 EDTA 용액을 제거하고 폐기 회수 모듈에 폐기하십시오. 신선한 중간 크기의 12mL를 추가하고 접시를 셰이커로 옮킨다. 2000 rpm에서 1 분 동안 흔들어 식민지를 제거하십시오. iPSC 콜로니를 더 작은 크기(~50\u201280 μm)로 나누기 위해 5주기의 파이펫팅 셀 서스펜션을 트리튜트합니다. 셀 서스펜션을 데크의 50mL 튜브로 옮기습니다. 종자 셀은 7에서 1의 분할 비율을 사용하여 2.1.5 단계에 설명된 바와 같이 자동으로.참고: 선택적 단일 셀 패시징. 단일 세포 해리 시약을 사용하여 단일 셀 서스펜션을 생성합니다(재료 표참조). 2.4.2.단계에서 0.5 mM EDTA 대신, 단일 세포 해리 시약 8mL을 사용하고 37 °C에서 20 분 동안 배양하십시오. 셀 서스펜션을 50mL 튜브로 수집하고 동일한 양의 미디어를 추가합니다. 단일 세포 해리 시약을 사용하여 해리화하려면 세포를 펠렛하는 수동 단계가 필요합니다. 3 분 동안 300 x g의 원심 분리기 세포. 상체를 제거하고 필요한 매체의 12mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 “튜브에서 플레이트의 파싱”을 진행한다(2.1단계 참조). hiPSC의 단일 세포 현탁액을 사용할 때 파종 당일 2 μM 티아조비빈으로 미디어를 보충하십시오. 자동화된 고함량, 높은 처리량 이미징참고: 측정 설정을 사용할 수 있어야 합니다(보충 파일 1: 1.1 단계 참조). 이미지할 분석 플레이트는 인큐베이터에서 사용할 수 있습니다. 메서드 “이미징”을 실행합니다(1.4단계 참조). 적어도 하나의 분석 플레이트와 배양 판이 없는 배치를 선택합니다. 섹션 “매개 변수 세부 사항”에서 플레이트 유형, 플레이트 정의 (표준 96-웰 이미징 플레이트: “플레이트-96-2017091813842”) 및 측정 설정의 이름을 입력합니다. 턴테이블을 통해 분석 판을 로봇 암을 사용하여 자동화된 공초점 현미경으로 전송하여 이미징 프로세스를 시작합니다. 현미경에서 이미징의 끝에 있는 플레이트를 복구하고 CO2 인큐베이터로 다시 운반합니다. 배치에 남은 플레이트의 프로세스를 반복합니다. 3. hiPSC의 자동 유지 보수 및 확장 자동 통합 검사, 미디어 변경 및 하위 배분 시퀀스 “튜브에서 플레이트의 파종”방법을 사용하여 1 웰 플레이트의 종자 세포 (2.1 단계 참조). 또는 “배양판 로드” 방법을 사용하여 수동으로 시드된 1웰 플레이트를 가져옵니다(1.5단계 참조). iPSC 문화권의 1일부터 6일까지 식민지 성장을 모니터링하기 위해 매일 자동 합류 점검을 예약합니다(2.2단계 참조). “문화 판의 미디어 변경” 방법을 사용하여 매 2일마다 미디어를 새로 고칩니다(2.3단계 참조). 12 mL의 매체는 플레이트 당 사용된다. 6일째에는 “하위 육성” 프로세스를 시작합니다(2.4단계 참조). 4. 자동 차별화 인체 iPSC에서 피질 NGN2 뉴런참고 : 수동 hiPSC 준비. 프로토콜은 납품을 위한 렌티바이러스 벡터를 사용하여 NGN2의 과발현을 포함합니다. 1:2 비율로 NGN2 ~ rTTA3 렌티바이러스를 가진 성우 hiPSC (> ~107 TU/mL). 그런 다음 세포는 0.5 μg/mL 푸로마이신을 가진 한 구절에 대해 선택됩니다. 안정적인 hiPSC-NGN2 라인을 생성하기위한 자세한 프로토콜은 보충 파일 1: 2 단계에 있습니다. 단계 2.4.4의 노트에 기재된 단일 세포 해리 시약을 사용하여 설명된 바와 같이 “하위 배양” 과정을 진행한다. hiPSC가 70\u201280% 합류에 도달하면 2.5 μg/mL 독시사이클린(dox) 및 2 μM 티아조비빈을 함유한 NGN2매체(재료표)의12mL에서 상체를 제거하고 세포 펠릿을 재연한다. “튜브에서 플레이트 의파종”방법을 사용하여 차별화를 시작합니다 (단계 2.1 참조). iPSC의 원하는 시드 밀도를 30,000/cm2로 설정합니다(표 1 참조). iPSC는 0.1 mg/mL 폴리 L-오르니틴(PLO) 및 5 μg/mL 라미닌으로 미리 코팅된 플레이트에 도금됩니다.참고: 1웰 플레이트는 RNA 및 프로테오믹스 기반 연구에서 선호되며 96웰 플레이트 포맷은 이미징 실험에 선호됩니다. 48-, 24, 12 또는 6웰 플레이트와 같은 다른 분석 플레이트 형식도 사용될 수 있다. 차별화 첫날, 리프레시 미디어는 NGN2 배지를 사용하여 “분석 판의 미디어 변경(2.3단계 참조) 2.5 μg/mL 독스와 10 μM N-[2S-(3,5-디플루오로페닐)]아세틸]-L-alanyl-2-phenyl-글리신,디메일 1,1,디메틸(1,1,1,dpta)을 사용합니다. 원하는 분화일까지 2\u20123일마다 미디어 변경을 계속합니다(2.3단계 참조). 분화 4일째에, 10ng/mL 뇌 유래 신경영양인자(BDNF), 10 ng/mL 신경신경세포 유래 신경영양인자(GDNF) 및 10ng/mL 신경영양계자(NT-3)로 보충된 NGN2 배지를 사용하여 또 다른 미디어 변화(단계 2.3.참조)를 수행한다. 실험이 끝나면 다운스트림 실험을 위해 시스템에서 배양 판을 내보냅니다(1.6단계 참조). NGN2 뉴런에 작은 분자 신경 전구체 세포 (smNPC)참고: 게시된 프로토콜12의 적응된 버전에 따라 smNPC를 파생합니다(보충 파일 1: 5단계 참조). NGN2 및 rTTA3 바이러스로 smNPC를 수정합니다(보충 파일 1: 2단계 참조). NGN2 및 rTTA 트랜스듀션의 한 라운드는 안정적인 인구를 생성하기에 충분합니다. 또한 라이브 셀 모니터링을 수행 할 수 있도록 pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 렌티 바이러스와 smNPC를 수정합니다. 감염의 복합성 (MOI) 10 GFP 렌즈 바이러스 변환에 사용 됩니다. 2.4단계에서 설명된 바와 같이 단일 세포 해리 시약을 사용하여 합류성에 도달하는 통로 smNPC. 참고. 종자 세포는 50,000/cm2의 세포 밀도에서 자동 세포 배양 시스템을 사용하여 “튜브에서 플레이트의 파종”방법 (단계 2.1.참조) 0.1 mg / mL PLO와 사전 코팅 플레이트에, NGN2 배지에서 5 μg /mL 라미닌 2.5 μg/mL dox로 보충. 3일째에는 2.5 μg/mL 독스와 10μM DAPT를 함유한 신선한 NGN2 배지를 사용하여 미디어 변경(1.3단계 참조)을 수행합니다. 3일째 이후, 각각 10ng/mL에서 2.5 μg/mL 독스, BDNF, GDNF 및 NT-3을 포함하는 신선한 NGN2 배지로 3일마다 미디어 변경을 수행합니다. 이미지 셀매일 “자동 고함량, 높은 처리량 이미징” 방법(2.5단계 참조)을 사용하여 GFP를 사용하여 중성기 아웃성장을 위한 판독값으로 모니터링합니다. 레이저 전력을 80%로 설정하고 30ms의 노출 시간을 사용합니다. 20배 목표를 사용하여 많은 수의 필드(예: 25필드)를 획득합니다. 배치 이미지 분석 중성염 아웃성장 템플릿을 사용하여 이미지 분석 소프트웨어 1을 사용하여 이미지 분석을 수행합니다. 소프트웨어를 엽니다. “데이터” 옵션을 선택하고 이미징 데이터 폴더를 탐색하고 확인을 클릭하여 분석할 데이터를 로드합니다. 상단 메뉴 표시줄에서 열고 프로토콜을 선택하고 응용 프로그램 메뉴에서 중성기 아웃성장을선택합니다. “알고리즘”으로 이동하여 “488” 채널을 사용하여 핵, 세포 체 및 중성염을 정의합니다. 각각의 임계값 매개 변수를 조정합니다. 이미지 분석에 사용할 우물을 선택합니다. 하단 오른쪽 클릭 링크에서 셀 수 평균, 총 골격 길이 합계와 같이 분석할 피처를 선택합니다. “사전 분석”을 진행한 다음 “미리 보기”를 진행합니다. 미리 보기 설정이 허용되는지 확인하고 배치 모드에서 분석을 시작합니다. 결과는 excel에서 열 수 있는 .csv 파일 형식으로 “보고서”아래 의 부모 폴더에서 사용할 수 있습니다.참고: 요청 시 이미지 분석 스크립트를 사용할 수 있습니다. 총 중성염 길이에 의해 얻어진 평균 중성기 길이를 셀 수로 정규화한다. 5. 중뇌 도파민기 (mDA) 뉴런으로 hiPSC의 자동 분화 수동 hiPSC 준비 단일 세포 해리 시약을 사용하여 단일 세포로 70\u201280% confluent hiPSC를 해리. 간략하게, 단일 세포 해리 시약(100 μL/cm2)으로세포를 37°C에서 30분 동안 배양하고, 원추형 튜브로 세포 현탁액을 수거하고, 원심분리기는 200 x g에서 5분 동안 및 iPSC 배양 배지에서 세포 펠릿을 재중단한다. 종자 200,000 세포 매트릭스 코팅 1 웰 플레이트및 iPSC 배양 배지에 200,000 세포 /cm2 10 μM Y-27632로 보충. 배양 세포는 하룻밤 사이에 37°C 및 5% CO2에서. 자동화된 차별화: 1단계 1.1\u20121.2 단계에서 설명한 대로 자동화된 배양 시스템을 준비합니다. 자동 배양 시스템의 CO2 인큐베이터에 세포를 포함하는 배양 판을 적재한다(1.5단계 참조). KSR 배지 준비(재료 표참조) 및 소분자 보충제(표 2참조)를 분화의 시작 일에 필요한 경우 0일 분화하는 데 필요한 제품입니다. 작은 분자와 성장 인자를 가진 갓 준비된 매체만 사용하십시오. 0일과 1일 0일과 1일에 설명된 바와 같이 배양판의 미디어 변경을 수행하고 25일까지 매일 씩 수행한다. 5일째부터, 표 3에상세히 설명된 바와 같이 서서히 시프트 미디어 제형. 11일차면 CHIR(13일까지), BDNF, AA1, GDNF, db-cAMP, TGFß3 및 DAPT로 보충된 mDA 뉴런 분화 매체를 추가합니다(재료표참조). 25일째, 언로드 플레이트(1.6단계 참조) 수동 레타칭 1 단일 세포 해리 시약을 사용하여 단일 세포로 25 mDA 전구체를 해리. 간략하게, 단일 세포 해리 시약 (100 μL/cm2)으로세포를 37 °C에서 40 분 동안 배양하고, 원면 튜브로 세포 현탁액을 수집하고, 원심분리기는 200 x g에서 5 분 동안 200 x g로 수집하고 mDA 뉴런 분화 배지에서 세포 펠릿을 재중단한다. 종자 400,000 세포/cm2 에 1-웰 배양 플레이트에 0.1 mg/mL PLO, 10 μg/mL 라미닌 및 2 μg/mL 라미닌 및 mDA 뉴런 분화 배지에서 2 μg/mL fibronectin (26 일까지) 및 작은 분자 및 성장 인자 설명 2. 배양 세포는 하룻밤 사이에 37°C 및 5% CO2에서. 자동화된 차별화: 2단계 mDA 뉴런을 함유한 적재배양판은 1.5단계에서 설명된 바와 같이 자동화된 배양 시스템의CO2 인큐베이터에 mDA 뉴런 분화 배지를 준비(재료표참조) 및 26일 이후최종 분화에 필요한 소분자 및 성장인자를 보충한다(표 2참조). 26일 2.3단계에서 설명한 바와 같이 문화판의 미디어 변경을 수행한 다음, 65일까지 3\u20124일마다 수행한다.참고: 고처리량 이미징 을 위해, 5.5 단계에서 설명된 바와 같이, 분화의 32일째에 저밀도에서 96웰 플레이트에서 mDA 뉴런을 재플레이트하는 것이 좋습니다. 수동 레볼레이팅 2 1.6 단계에서 설명된 바와 같이 배양 판을 언로드합니다. 단계 5.3.1에 기술된 바와 같이 단일 세포로 32mDA 뉴런을 해리한다. 종자 100,000 세포/cm2 에 0.1 mg/mL PLO, 10 μg/mL 라미닌 및 2 μg/mL 라미닌 및 2 μg/mL fibronectin mDA 뉴런 분화 매체에 10 μM Y-27632 (33 일까지) 및 작은 분자 및 성장 인자 (표 2참조). 배양 세포는 하룻밤 사이에 37°C 및 5% CO2에서. 33일째에, 소량 분자 및 성장 인자(Y-27632 없이)로 보충된 갓 준비된 DA 뉴런 분화 매체에 의해 배지를 교체하십시오. 65일까지 3\u20124일마다 수동으로 중간을 변경합니다. 6. 면역 스테인닝, 자동화된 고처리량 이미지 수집 및 분석 형광 염색 보충 파일 1: 단계 4에 설명 된 바와 같이 형광 면역 염색을 수행합니다. 보충 파일 1에설명 된 이미지 셀 1 : 단계 1.2. 영상 시스템에 의해 생성된 이미징 파일을 이미지 분석 소프트웨어 2(재료 표참조)에 업로드하여 6.2 단계에서 설명된 바와 같이 추가 이미지 분석을 위해 한다. 이미지 분석 소프트웨어를 이용한 이미지 분석 2 이미징 파일이 이미지 분석 소프트웨어 2에 업로드되면 “이미지 분석” 함수로 이동하여 드롭다운 메뉴를 사용하여 분석 알고리즘을 빌드합니다. 세포 핵에 속하는 이미지의 영역을 감지하는 작업 “핵 찾기”를 사용하여 핵을 선택하십시오 (여기 Hoechst로 염색). 핵 영역 또는 직경에 대한 임계값을 설정하여 죽은 세포 (pyknotic 핵)에서 핵을 제외하십시오. “세포질 찾기”라는 작업을 사용하여 세포질을 선택합니다. 이 작업은 세포 세포질에 속하는 핵 의 주위에 지구를 검출합니다. 잘 분할된 셀만 포함합니다. 미토틱, 세포 세포 및 심하게 세분화된 세포를 제외합니다. 이미지의 테두리를 터치하는 셀을 제거합니다. “형태 속성 계산”과 “강도 속성 계산”작업을 추가합니다. 형태 매개 변수에는 관심 영역에 대한 영역과 같은 형태 속성의 계산이 포함됩니다. 강도 매개 변수는 관심 영역(예: 뉴런의 세포질)에 대한 평균 강도와 같은 강도 특성의 계산을 포함한다. 하나 이상의 조건, 형태 및/또는 강도를 사용하여 입력 모집단(예를 들어, TH 양성 뉴런)을 선택한다.참고 : 일반적으로, 강도는 뉴런을 위해 선택됩니다. 부정적인 컨트롤에 기초하여, 뉴런이 TH에 대해 양성으로 간주되는 강도의 임계 값을 위에 정의 할 수 있습니다. 출력 결과를 정의합니다. 이것은 각 분석의 마지막 구성 요소입니다. 배양판의 각 웰에 대한 분석 판독 값(음당 결과)을 정의합니다. 일괄 처리 분석을 실행하고 결과를 내보냅니다. 양수 세포의 수를 총 핵 수로 정규화하고 데이터를 양수 세포의 백분율로 나타낸다. 7. 정량 적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 (qRT-PCR) 보충 파일 1: 3 단계에 설명 된 바와 같이 qRT-PCR 프로토콜을 수행합니다.