Saccharomyces cerevisiae Kronolojik Yaşam Süresini Düzenleyen Genetik Bağlantıların Karakterizasyonu için Bastırıcı Ekran
Summary
Burada Saccharomyces cerevisiaeartan bir kopya numarası bastırıcı ekran aracılığıyla genetik etkileşimleri belirlemek için bir protokoldür. Bu yöntem araştırmacılar, klon ve kısa ömürlü maya mutantlar test bastırıcılar sağlar. SIR2’nin kopya sayısı artışının otofaji null mutantında kullanım ömrü üzerindeki etkisini test ediyoruz.
Abstract
Yaşlanma, bir organizmanın normal biyolojik süreçlerinin ölüm olasılığını artıran zamana bağlı bozulmasıdır. Birçok genetik faktör normal yaşlanma sürecinde değişikliklere katkıda bulunur. Bu faktörler karmaşık şekillerde kesişiyor, belgelenmiş bağlantıların zenginliği ile kanıtlanan ve birçok organizmada tanımlanan ve korunan. Bu çalışmaların çoğu aynı anda birçok genin hızlı bir şekilde taranmasıiçin izin fonksiyon kaybı, null mutantlar üzerinde duruluyor. Bu süreçte bir genin aşırı ekspresyonu rolünü karakterize etmek üzerinde odaklanan çok daha az iş vardır. Bu çalışmada, biz tanımlamak ve tomurcuklanan maya genleri klonlamak için basit bir metodoloji salıyoruz, Saccharomyces cerevisiae, birçok genetik arka planda görülen kısa ömürlü kronolojik yaşam süresi fenotip bastırma çalışma için. Bu protokol, çok çeşitli geçmişlere ve çeşitli akademik aşamalardan araştırmacıların erişimine açık olacak şekilde tasarlanmıştır. Kronojen yaşam süresi üzerindeki etkisi hakkında çelişkili raporlar olduğu için, histon deasetilaz kodlayan SIR2 geni pRS315 vektöründe klonlama için seçilmiştir. SIR2 aynı zamanda otofaji de bir rol oynar, hangi sonuçları çeşitli genlerin silinmesi yoluyla bozuldu, transkripsiyon faktörü ATG1dahil. Prensip kanıtı olarak, sir2 genini, otofaji eksikliği olan atg1Δ mutantın kısaltılmış kullanım ömrü fenotip karakteristiği üzerinde bir bastırıcı ekran yapmak için klonluyorum ve bunu başka bir izojenik, vahşi tip genetik arka planla karşılaştırıyoruz.
Introduction
Yaşlanma, sayısız biyolojik süreçlerde zamana bağlı bütünlük kaybıdır ve bu da organizmasal ölüm olasılığını arttırır. Yaşlanma tüm türler için neredeyse kaçınılmazdır. Hücresel düzeyde yaşlanma ile ilişkili birkaç iyi karakterize işaretleri vardır, dahil: genomik instabilite, epigenetik değişiklikler, proteostaz kaybı, mitokondriyal disfonksiyon, deregüle besin algılama, hücresel senescence, ve telomer yıpranma1,2. Mayalar gibi tek hücreli organizmalarda, bu çoğaltıcı potansiyel ve kronolojik yaşam süresi bir azalmaya yol açar3,4. Bu hücresel değişiklikler daha karmaşık organizmalarda tezahür, insanlar gibi, kanserler içeren patolojiler olarak, kalp yetmezliği, nörodejenerasyon, diyabet, ve osteoporoz5,6,7. Yaşlanma sürecini karakterize eden birçok karmaşıklığa rağmen, yaygın olarak farklı organizmalar arasında bu sürecin altında yatan bu moleküler işaretlerin korunması vardır8,9,10. Yaşlanma sırasında bu yollara yapılan değişikliklerin tanımlanması, yaşam tarzı değişiklikleri yoluyla manipüle edilebilenlerin farkına varılmasına yol açmıştır – diyet kısıtlamasının birçok organizmada yaşam süresini önemli ölçüde uzattığı gösterilmiştir11. Bu yollar birbiriyle ve diğer birçok patikayla karmaşık yollarla birleşir ve kesişer. Bu etkileşimlerin açıklanması ve karakterizasyonu yaşam süresini uzatmak için terapötik müdahaleler için potansiyel sunuyor12,13,14.
Yaşlanmamoleküler temellerinin korunması daha basit model organizmaların kullanımı yoluyla sürecin altında yatan genetik etkileşimlerin fonksiyonel diseksiyon sağlar – tomurcuklanan maya dahil, Saccharomyces cerevisiae15,16. Tomurcuklanan maya tarafından modellenen yaşlanma nın iki yerleşik türü vardır: kronolojik yaşlanma (kronolojik yaşam süresi, CLS) ve çoğaltıcı yaşlanma (çoğaltıcı yaşam süresi, RLS)17. Kronolojik yaşlanma, bir hücrenin bölünmeyen bir durumda hayatta kalabilmesi nin miktarını ölçer. Bu g0hayatlarının çoğunluğu harcamak hücrelerde görülen yaşlanma benzer , nöronlar gibi4. Alternatif olarak, çoğaltıcı kullanım ömrü, bir hücrenin tükenmeden önce bölünebildiği ve mitotik olarak etkin hücre türleri için bir model olduğu (örn. bir hücrenin sahip olabileceği küçük hücre sayısı)18′dir.
Bu yöntemin genel amacı S. cerevisiaekullanarak yaşlanma genetiğinin fonksiyonel diseksiyon sağlayan bir protokol sunmaktır. Birçok araştırmacı tarafından yapılan ve şu anki anlayışımıza yol açan pek çok mükemmel çalışma olsa da, tomurcuklanan araştırmacıların akademik kariyerlerinin başlarından itibaren yaşlanma alanına katkıda bulunmaları için pek çok fırsat mevcuttur. Araştırmacıların yaşlanma alanını daha da ilerletmelerine olanak sağlayacak açık bir metodoloji salıyoruz. Bu protokol, akademik kariyerlerinin aşamasından bağımsız olarak, kendi yeni hipotezlerini formüle etmek ve test etmek için gerekli araçları sağlayarak tüm araştırmacılar için erişilebilir olacak şekilde tasarlanmıştır. Yaklaşımımızın avantajı, bu uygun maliyetli bir yöntem kolayca tüm araştırmacılar için erişilebilir ne olursa olsun kurum – ve bazı protokoller için gerekli pahalı, özel ekipman gerektirmez19. Bu tür bir ekran tasarlamanın birkaç farklı yolu vardır, bu çalışmada özetlenen yaklaşım, özellikle, kronolojik kullanım ömründe, iyotlu yabani tip mayaya kıyasla ciddi bir azalma gösteren gerekli olmayan genlerin null mutantlarının taranması için uygundur.
İlke kanıtı olarak, biz SIR2klon , bir lizin deasetilaz hem genişletilmiş ve kısaltılmış CLS sergileyen olarak bildirilen zaman aşırı ifade. SIR2 aşırı ekspresyonu son zamanlarda şarap mayaları CLS artırmak bulundu; ancak, çeşitli gruplar SIR2 ve CLS uzantısı arasında hiçbir bağlantı bildirdin, karakterize altında rolünü bırakarak20,21,22. Literatürdeki bu çelişkili raporlar nedeniyle, sir2’nin kronolojik yaşlanmadaki rolünü açıklığa kavuşturmak için bağımsız araştırmalar eklemek için bu geni seçtik. Ayrıca, sir2 homolog kopya sayısını artırmak bir nematod solucan modeli sistemi23ömrünü uzatır.
Otofaji, proteinler ve organeller gibi sitozolik ürünleri lizozom24’eulaştırmak için hücre içi bir bozulma sistemidir. Otofaji yakından hücresel homeostaz korumak için hasarlı proteinler ve organeller aşağılayıcı rolü ile uzun ömürlü bağlantılıdır25. Otofaji indüksiyonbirçok genlerin ekspresyonu düzenleyen bağlıdır, ve tomurcuklanan maya bir anormal kısa CLS ATG1 gen sonuçlarının silinmesi26. Otofaji ve sitoplazma-to-vacuol (mantar lısozomal eşdeğeri) yolu27,,28vezikül oluşumu için gerekli olan bir protein serine / treonin kinaz için ATG1 kodları . Burada, artırılmış bir kopya numarası ekranı için metodumuzu sıyoruz, artırılmış SIR2 kopyasının CLS üzerindeki etkisini vahşi bir tipte ve atg1-null arka planda test ediyoruz. Bu yöntem özellikle, birçoğu bilimlerde yeterince temsil edilmeyen ve sınırlı kaynaklara sahip olan, öncelikle lisans kurumlarında bulunan genç araştırmacılar ve araştırma grupları için uygun durmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yaşlanma nın genetiğini çözmek zor bir iştir ve daha fazla çalışma için var olan karmaşık etkileşimler hakkında önemli bilgiler edinebilecek pek çok fırsat vardır. Maya45,46null suşları çalışması için fonksiyon kaybı mutantların hızlı nesil için izin birçok yöntem vardır. Bu yöntem, aşırı ekspresyon baskılayıcı çalışmalar için pRS315 vektörüne genleri tanımlamak ve klonlamak için basit bir yaklaşım sunar. Bu yakla…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
James T. Arnone, 2017 ve 2018 yıllarında William Paterson Üniversitesi’nde düzenlenen rekombinant DNA Teknolojileri dersinde yer alan ve bu projede yer alan ancak çabaları yazarlık eşiğini aşmayan öğrencilerin desteğini kabul etmek ister: Christopher Andino, Juan Botero, Josephine Bozan, Brenda Calalpa, Brenda Cubas, Headtlove Essel Dadzie Irvin Gamarra, Precious Isbor , Wayne Ko, Nelson Mejia, Hector Mottola, Rabya Naz, Abdullah Odeh, Pearl Paguntalan, Daniel Raza’e, Gabriella Rektör, Aida Shono ve Matthew So. Siz büyük bilim adamlarısınız ve hepinizi özledim!
Yazarlar, William Paterson Üniversitesi’nde Eğitim ve Araştırma Teknolojisi’nin paha biçilmez desteğini kabul etmek isterler: Greg Mattison, Peter Cannarozzi, Rob Meyer, Dante Portella ve Henry Heinitsh. Yazarlar ayrıca SANAT desteği için Provost Ofisi, Dekan Ofisi ve Bilim ve Sağlık Koleji Araştırma Merkezi bu çalışmayı desteklemek ve bu projeyi desteklemek için Biyoloji Bölümü kabul etmek istiyorum.
Materials
| Fungal/Bacterial DNA kit | Zymo Research | D6005 | |
| HindIIIHF enzyme | New England Biolabs | R3104S | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Plasmid miniprep kit | Qiagen | 12123 | |
| SacII enzyme | New England Biolabs | R0157S | |
| Salmon sperm DNA | Thermofisher | AM9680 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S |
Referencias
- López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
- Kenyon, C. The genetics of ageing. Nature. 464 (7288), 504-512 (2010).
- Petralia, R. S., Mattson, M. P., Yao, P. J. Aging and longevity in the simplest animals and the quest for immortality. Ageing Research Reviews. 16, 66-82 (2014).
- Longo, V. D., Fabrizio, P. . Aging Research in Yeast. , 101-121 (2011).
- Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).
- Galkin, F., Zhang, B., Dmitriev, S. E., Gladyshev, V. N. Reversibility of irreversible aging. Ageing Research Reviews. 49, 104-114 (2019).
- Khan, S. S., Singer, B. D., Vaughan, D. E. Molecular and physiological manifestations and measurement of aging in humans. Aging Cell. 16 (4), 624-633 (2017).
- Riera, C. E., Merkwirth, C., De Magalhaes Filho, C. D., Dillin, A. Signaling networks determining life span. Annual Review of Biochemistry. 85, 35-64 (2016).
- Powers, R. W., Kaeberlein, M., Caldwell, S. D., Kennedy, B. K., Fields, S. Extension of chronological life span in yeast by decreased TOR pathway signaling. Genes & Development. 20 (2), 174-184 (2006).
- Lapierre, L. R., Hansen, M. Lessons from C. elegans: signaling pathways for longevity. Trends in Endocrinology & Metabolism. 23 (12), 637-644 (2012).
- Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. Extending healthy life span-from yeast to humans. Science. 328 (5976), 321-326 (2010).
- Houtkooper, R. H., Pirinen, E., Auwerx, J. Sirtuins as regulators of metabolism and healthspan. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (4), 225-238 (2012).
- Bitto, A., et al. Transient rapamycin treatment can increase lifespan and healthspan in middle-aged mice. elife. 5, 16351 (2016).
- Fang, E. F., et al. NAD+ replenishment improves lifespan and healthspan in ataxia telangiectasia models via mitophagy and DNA repair. Cell Metabolism. 24 (4), 566-581 (2016).
- Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. Large-scale identification in yeast of conserved ageing genes. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (1), 17-21 (2005).
- Fabrizio, P., et al. Genome-wide screen in Saccharomyces cerevisiae identifies vacuolar protein sorting, autophagy, biosynthetic, and tRNA methylation genes involved in life span regulation. PLoS Genetics. 6 (7), (2010).
- Longo, V. D., Shadel, G. S., Kaeberlein, M., Kennedy, B. Replicative and chronological aging in Saccharomyces cerevisiae. Cell Metabolism. 16 (1), 18-31 (2012).
- He, C., Zhou, C., Kennedy, B. K. The yeast replicative aging model. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. 1864 (9), 2690-2696 (2018).
- Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (13), 4916-4920 (2012).
- Fabrizio, P., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Aging Cell. 2 (2), 73-81 (2003).
- Smith, J., Daniel, L., McClure, J. M., Matecic, M., Smith, J. S. Calorie restriction extends the chronological lifespan of Saccharomyces cerevisiae independently of the Sirtuins. Aging Cell. 6 (5), 649-662 (2007).
- Orozco, H., Matallana, E., Aranda, A. Genetic manipulation of longevity-related genes as a tool to regulate yeast life span and metabolite production during winemaking. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1 (2013).
- Tissenbaum, H. A., Guarente, L. Increased dosage of a sir-2 gene extends lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 410 (6825), 227-230 (2001).
- Huang, W. P., Klionsky, D. J. Autophagy in yeast: a review of the molecular machinery. Cell Structure and Function. 27 (6), 409-420 (2002).
- Barbosa, M. C., Grosso, R. A., Fader, C. M. Hallmarks of aging: an autophagic perspective. Frontiers in Endocrinology. 9, 790 (2019).
- Aris, J. P., et al. Autophagy and leucine promote chronological longevity and respiration proficiency during calorie restriction in yeast. Experimental Gerontology. 48 (10), 1107-1119 (2013).
- Cheong, H., Nair, U., Geng, J., Klionsky, D. J. The Atg1 kinase complex is involved in the regulation of protein recruitment to initiate sequestering vesicle formation for nonspecific autophagy in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 19 (2), 668-681 (2008).
- Matsuura, A., Tsukada, M., Wada, Y., Ohsumi, Y. Apg1p, a novel protein kinase required for the autophagic process in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 192 (2), 245-250 (1997).
- Cherry, J. M., et al. Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast. Nucleic Acids Research. 40, 700-705 (2012).
- Engel, S. R., et al. The reference genome sequence of Saccharomyces cerevisiae: then and now. G3: Genes, Genomes, Genetics. 4 (3), 389-398 (2014).
- Imai, S. I., Armstrong, C. M., Kaeberlein, M., Guarente, L. Transcriptional silencing and longevity protein Sir2 is an NAD-dependent histone deacetylase. Nature. 403 (6771), 795-800 (2000).
- Sampaio-Marques, B., et al. SNCA (α-synuclein)-induced toxicity in yeast cells is dependent on Sir2-mediated mitophagy. Autophagy. 8 (10), 1494-1509 (2012).
- Nagalakshmi, U., et al. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science. 320 (5881), 1344-1349 (2008).
- De Boer, C. G., Hughes, T. R. YeTFaSCo: a database of evaluated yeast transcription factor sequence specificities. Nucleic Acids Research. 40, 169-179 (2012).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. (63), e3064 (2012).
- Gietz, R. D., Woods, R. A. . Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
- Salvi, S., et al. Serum and plasma copy number detection using real-time PCR. Journal of Visualized Experiments. (130), e56502 (2017).
- McIsaac, R. S., et al. Visualization and analysis of mRNA molecules using fluorescence in situ hybridization in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Visualized Experiments. (76), e50382 (2013).
- Mirisola, M. G., Braun, R. J., Petranovic, D. Approaches to study yeast cell aging and death. FEMS Yeast Research. 14 (1), 109-118 (2014).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. (16), e752 (2008).
- Lin, S. J., Guarente, L. Nicotinamide adenine dinucleotide, a metabolic regulator of transcription, longevity and disease. Current Opinion in Cell Biology. 15 (2), 241-246 (2003).
- Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genética. 122 (1), 19-27 (1989).
- Romanos, M. A., Scorer, C. A., Clare, J. J. Foreign gene expression in yeast: a review. Yeast. 8 (6), 423-488 (1992).
- Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).
- Storici, F., Resnick, M. A. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods in Enzymology. 409, 329-345 (2006).
- DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).
- Arnone, J. T. Genomic Considerations for the Modification of Saccharomyces cerevisiae for Biofuel and Metabolite Biosynthesis. Microorganisms. 8 (3), (2020).
- Murakami, C., Kaeberlein, M. Quantifying yeast chronological life span by outgrowth of aged cells. Journal of Visualized Experiments. (27), e1156 (2009).
- Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring replicative life span in the budding yeast. Journal of Visualized Experiments. (28), e1209 (2009).
- Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast. Journal of Visualized Experiments. (78), e50143 (2013).
