使用SAX-HPLC从不同植物物种中提取和定量可溶性、放射性标记肌醇多磷酸盐

1. 设置 HPLC 系统 设置一个由两个独立的 HPLC 泵（二进制泵）组成的系统，每个缓冲器一个。两个泵都需要通过计算机与各自的软件或有一个主泵一起控制。通过重力或通过第三个低压泵为两个泵安装活塞密封清洗。为缓冲器 A（指定泵 A）指定一个泵，为缓冲器 B（指定泵 B）指定一个泵。注：两者必须能够产生高达 60 bar （6 MPa） 的压力和至少 0.5 mL/min 的流速。 将两个泵连接到动态混合器。 将搅拌机连接到具有至少 1 mL 容量的样品回路的喷射阀。 通过相应的端部接头，用毛细管将喷射阀连接到柱上。 使用长度适当的毛细管将柱连接到分数收集器。注：此描述基于我们的 HPLC 系统（参见 材料表），它比更新和更复杂的系统需要更多的手动步骤。我们的系统允许轻松访问和修改所有组件。第四纪泵（与此处描述的二进制梯度）也可以使用，并将导致洗脱配置文件和分析的整体质量类似于那些实现二进制泵。 2. 准备缓冲器、柱和 HPLC 系统 准备提取可溶性无溶性物质的缓冲液：萃取缓冲液（1 M HClO4）和中和缓冲液（1 M K2CO3）。使用超纯脱水准备两个缓冲液。它们在室温下稳定了几个月。在萃取之前，立即将 EDTA 添加到两种溶液中，最终浓度为 3 mM（例如，从过滤的 250 mM EDTA 库存溶液中）。注意：HClO4（ 高氯酸）具有很强的腐蚀性。 为 SAX-HPLC 运行准备缓冲区：缓冲区 A （1 mM EDTA） 和缓冲区 B （1 mM EDTA， 1.3 M （NH4）2HPO4; pH 3.8 与 H3PO4.使用超纯脱压水，然后使用 0.2 μm 孔径的膜过滤器进行真空过滤。这些在室温下稳定了几个月。注意：EDTA 应包含在所有缓冲区中，以防止与 InsP 的 ces 相互作用，这可能导致 InsP 电荷改变，甚至不溶性 InsP 盐复合物。 编程梯度如下：0\u20122分钟，0%缓冲区B;2\u20127分钟，高达10%的缓冲器B;7\u201268分钟，高达84%的缓冲B;68\u201282 分钟，高达 100% 缓冲器 B;82\u2012100 分钟，100% 缓冲区 B，100\u2012101 分钟，低至 0% 缓冲区 B;101\u2012125 分钟，0% 缓冲区 B。此梯度的最佳流速为 0.5 mL/min。 在运行过程中，每分钟收集分数，从第 1 分钟到第 96 分钟。其余 30 分钟的梯度用于清洗柱和系统，并且不必收集闪烁计数。 如果可能，在 HPLC 泵紧急停机之前，将最大可达到压力设置为 80 bar（8 MPa）。这样可防止 对柱 树脂造成严重损坏。 使用新的 SAX HPLC 柱时， 在第 一次使用 前用过滤 过的超纯脱水彻底清洗（>50 mL）。注：这将确保去除含有的甲醇，从而防止盐沉淀在以后的步骤。如果可能，请使用单独的 HPLC 泵。如果不可用，请确保 HPLC 在清洗柱前已用水冲洗。流量不应超过 2 mL/min。洗涤后，列已准备好进行分析，如果处理得当，可用于 20\u201240 运行。之后，决议将陆续减少。使用缓冲液 A （>1 h） 和执行步骤 2.6 进行长时间清洗有助于延长列的生存期。如果分辨率的降低仍然存在，则需要交换列。梯度可以调整，以增加特定肌醇多磷酸盐物种之间的分离或减少整体运行时间。使用不同的 HPLC 系统（具有不同的空隙体积或毛细血管的体积不同）将严重影响保留时间。此外，列更改对保留时间的影响很小。 执行”模拟运行”。在 HPLC 系统中注入过滤过的超纯脱压水，而不是提取的样品，然后运行标准梯度。不必收集分数。注：步骤 2.6 是可选的。但是，如果适用以下情况之一：安装新列，则应执行该操作：HPLC 系统已事先用于其他方法;HPLC 系统使用时间不超过 3 天;前一次运行有问题。 3. 植物栽培和标签与[3H]-肌醇 – 肌醇 注：以下步骤应用无菌 组件和无菌 条件下 执行，同时戴手套保护手免受放射性标签的污染。植物介质，尤其是含有蔗糖时，容易受到微生物污染。 用1 mL 1.2%次氯酸钠消毒 A. thaliana 种子 3 分钟，然后用 1 mL 70% 乙醇消毒 3 分钟。然后加入1 mL的100%乙醇，用乙醇将种子移液到圆形滤纸上，让种子在干净的长凳上用层流进行空气干燥。 使用 L.japonicus种子 时，将它们放在砂浆中，并在灭菌前用砂纸擦洗种子，以确保足够的发芽率。 在方 培养皿 上播种1~2排，里面装满了固体生长介质，包括半强度的Murashige和Skoog（MS）盐溶液、1%蔗糖、0.7%的凝胶胶在去维水中调整为pH 5.7与KOH，并允许它们在黑暗中4°C下至少分层1天。 对于 莲花 种子，在方培养皿上播种，用固体生长介质在去维化水中由0.8%的细菌性芳分剂组成，并允许它们在黑暗中4°C下分层至少3天。 将板垂直放在生长培养箱或气候室中，并允许它们在短日条件下生长10-12天（22°C下为8小时光，在20°C下为16小时暗）。 将 10~20 株幼苗转移到 12 井清澈平底细胞培养板的一个井中，该培养板中填充了 2 mL 的半强度 MS 盐溶液，并辅以 1% 蔗糖，并调整为 pH 5.7。 加入45μCi的+ 3H+-肌醇（30×80 Ci/mmol，溶解在90%乙醇中），通过温和的涡旋混合。用相应的盖子盖住盘子，用微孔手术胶带（如微孔或利孔胶带）密封，将其放回生长培养箱中。注意：[3H] 是一种低能β发射器，在通过裸露的皮肤吸入、摄入或吸收时，可能会造成有害的辐射危害。 处理 与放射性物质有直接或间接接触的放射性物质或设备时，请戴上手套。还要遵守当地关于安全处理放射化学品的规则（例如，穿着额外的防护服、使用剂量计和定期对表面进行污染调查）。 贴标签5天后，从介质上取出幼苗，用去维水短暂清洗。用纸巾擦干，然后转移到1.5 mL微离心管中。 不要过度填充管子 ，放置不超过100毫克FW/管，这相当于大约10\u20120 17天大的幼苗。注：过量的植物材料在萃取过程中会稀释酸，并显著降低萃取效率。 将管子在液氮中捕捉冻结，并将其储存在-80°C，直到提取。注：样品可保持在-80°C，不影响样品质量。生长条件（介质、光、温度、时间）可根据特定实验或植物物种的需要进行修改。但是，在稀释{3H}-肌醇时应小心，以确保可量化的 SAX-HPLC 运行质量良好。因此，建议从此处所述的 +3H+-肌醇浓度开始，如果需要，可逐步减少。在贴标期间，工厂可以接受不同的处理（例如，环境应力或化学剂），以评估这些条件对全球 InsP 的影响。为了达到稳定状态标签，我们建议给植物贴上至少5天的标签。 4. 可溶性不溶性不法药物的萃取 注：整个提取过程中，将样品和试剂放在冰上。 由于与放射性物质接触的风险 很高，尤其是在磨削过程中，请始终戴上手套和防护眼镜。与样品接触的所有东西都被视为 放射性废物 ，应根据当地安全处置放射性材料的规则进行处置。 准备提取和中和缓冲器的工作解决方案，如步骤 2.1 中。每个样品都需要 600 μL 的萃取缓冲液和 400 μL 的中和缓冲液。将缓冲液存放在冰上。 从-80°C冷冻室采集样品，并放在液氮中，直到进一步处理。用微离心管对样品进行研磨，直到它们开始解冻，并加入500μL的冰冷萃取缓冲液。继续研磨，直到样品完全均匀且溶液具有深绿色（如果样品中存在叶子）。 在 18000 x g的温度下，在 4 °C 下≥ 10 分钟。将上一液转移到新鲜的 1.5 mL 管中。请记住，用于萃取的管子被视为固体放射性废物，需要相应地处理。 小心 地向萃取器中加入 300 μL 的中和缓冲液。蛋白质的沉淀和冒泡将立即开始。一分钟后，通过旋涡与移液器尖端混合，等待几秒钟，然后移液在 pH 纸上（理想范围内为 pH 6+9）。最终 pH 应在 pH 7 和 8 之间。 如有必要，添加少量（通常为 10~20 μL）的中和缓冲液或萃取缓冲液，直到达到所需的 pH 值。让样品在冰上休息至少1小时，盖开盖子。 在 18，000 x g的温度下，在 4 °C 下≥ 10 分钟。将上一液转移到新鲜的 1.5 mL 管中。注：样品可以直接在SAX-HPLC运行中使用，也可以保存在冰上（如果在同一天晚些时候使用），也可以冷冻在液氮中，在-80°C中储存2\u20124周。为确保高可重复性和可比性，建议始终将样品冷冻在液氮中 5 分钟，即使随后直接使用。只要样品仅解冻一次，就有可能在-80°C下长期储存提取样品。如果冻结样品用于分析，请确保解冻 后 没有颗粒可见。否则，在 4 °C 下再次离心 10 ≥ 18，000 x g， 然后将上最后一代转移到新鲜的 1.5 mL 管中。 5. 执行 HPLC 运行 为小瓶收集器配备 96 个小闪烁小瓶（容量为 +6 mL），并为每个小瓶填充 2 mL 的合适闪烁鸡尾酒（例如，Ultima-Flo AP 液体闪烁鸡尾酒），与低 pH 值和高磷酸铵浓度的缓冲液兼容（参见材料 表）。注：小瓶的数量和小瓶的大小取决于使用的分数收集器和闪烁计数器。重要的是至少收集前 90个分数，如果使用此处描述的梯度，以获得一个完整的肌醇多磷酸盐配置文件。还要确保正确 标记 每个小瓶及其各自的盖子，以防止混淆分数或样品。 启动 HPLC 系统/泵，并准备好运行。激活活塞密封清洗，并保持其激活，整个运行。使用合适的注射器从步骤 4.5（约 750 μL）手动注射完整的上上液（参见 材料表）来加载样品。如果可以自动注射，将样品转移到相应的样品瓶中。将阀从”负载”转向”注入”位置，然后启动梯度和分数收集器。注：根据使用的 HPLC 系统，启动过程可能会有所不同，尤其是在将较旧的系统（如此处所述）与完全由软件控制的较新的型号进行比较时。确保梯度、样本注入和分数收集同时启动非常重要。 当 HPLC 运行正在进行时，请定期检查压力。起始压力应在 18~24 bar （1.8–2.4 MPa） 左右，一旦达到 100% 缓冲 B，起始压力应缓慢上升到 50~60 bar （5~6 MPa）。注意：压力降低可能表示系统泄漏，而压力增加则表示堵塞。压力波动（≥秒内 3 bar）可以指示系统中存在空气。请记住，离开柱的所有，以及在喷油器或之后发生的每一个泄漏都是 放射性的。注：压力还取决于 HPLC 系统，并且可能低于此处所述或更高。在大约 15~20 次运行后，它会慢慢增加。但是，这并不一定影响获取的运行的质量。 跑步后，紧密地合上小瓶，通过剧烈的摇晃将小瓶与闪烁的鸡尾酒混合。直接进行测量或保持小瓶直立位置，最好是在黑暗中。注：与闪烁鸡尾酒混合的分数稳定数周，可稍后测量。由于钛的半寿命为12.32年，信号损耗可以忽略不计。 一旦当天最后一个样本的运行完成，停止两个 HPLC 泵。 （可选）为了延长系统的使用寿命，尤其是在不经常使用时，请将缓冲器 B 中的毛细管放入带缓冲器 A 的瓶子中，让泵运行 10-15 分钟，以清洗泵 B 和毛细管。在下次使用之前， 请记住 将毛细管更换到缓冲器 B 中，并取消将泵 B 与混合器耦合，以将其与缓冲器 B 齐平。泵和毛细管再次充满缓冲器 B 后，请重新与混合器连接，系统即可使用。 6. 测量分数 将小瓶插入闪烁计数器机架，并在液体闪烁计数器中测量每个小瓶 5 分钟。 理想情况下，使用直接适合小小瓶的机架，避免挂在大瓶（例如 20 mL）小瓶中，以减少计数误差。此协议中使用的软件设置显示在补充 图 1 中。注：使用未挤压的 +3H + 标准定期执行 SNC（自规范化和校准）协议。可缩短计数时间（1~5 分钟），以减少等待时间。但是，为了确保高计数的可重复性和准确性，建议使用 5 分钟。 7. 数据分析 将闪烁计数器中的测量值导出为电子表格文件或兼容/可转换文件格式。使用配备 Excel 或类似软件的计算机以及合适的分析软件（如 Origin）评估数据。 准备一个二元线图，其中根据保留时间绘制每分钟（cpm）的测量计数（参见图 1，图2）。 要相互比较样本，请 通过汇总 每个样本从 25 分钟到 96 的分条的 cpm 来规范化数据。注：第25分钟用作截止值，从分析中排除未合并的 [3H+- myo-inositol， InsP1和 InsP2），因为这些倾向于剧烈波动， 不能很好地分离 （至少与本协议中建议的梯度）， 因此由于其高活性而强烈改变规范化因子。myo 通过将总 cpm（分数 25+96）与最低 cpm 的样本（分数 25+96）除以其他样本的总 cpm（分数 25–96）将总 cpm 与样本中的总 cpm（以分数 25+96）将所有数据规范化。然后，通过将每个分数的 cpm 与因子相乘，可以使用结果因子来使每个分数的 cpm 规范化。注：最后，所有样本的 cpm 值从分钟 25 到结束的总和应相等。只有规范化的运行应在同一图形/图形中显示（当作为实际配置文件显示时）。补充图 2显示了如何执行这些计算步骤的示例（仅使用两个样本中的 25-35 分数进行简化）。但是，在某些情况下，没有必要对数据进行规范化。例如，如果峰值根据步骤 7.4 进行量化，并且显示为 InsP 总数的百分比（如图3D 所示）。如前所述，当将多个分析并排呈现为配置文件时，或当实际测量的活动用于结论时（例如，治疗 a） 与控制相比，InsP7增加 x%，因此需要参考两个样本中的 InsP7的 cpm 值，而不是其占总 InsP 的百分比）规范化。要分析基因型或治疗差异对标签效率的影响，重要的是不要正常化，因为这将使这些差异无效。然而，使用这种方法的绝对定量是具有挑战性的，因为由于各种原因，使用这种协议的提取效率可能是可变的，有时甚至在分析同一基因型和治疗的复制品时被观察到。请记住，根据用于分析的 HPLC 系统、列和梯度，可能需要更改截止时间。 要对某些肌醇多磷酸盐峰执行相对定量，并随后创建包含复制数据的条形bar graphs图进行统计分析，请使用可计算色谱峰区（例如原点）的专用软件继续分析。参见补充图 3。注：大多数受软件控制的 HPLC 系统都随附一个能够完成此任务的软件。峰值确定为背景以上 cpm 值的分数（在运行之间会因一定程度而变化）和保留时间，与以前发布的数据类似。特定峰值的保留时间在电子表格软件（例如 Excel）中确定，并用于分配峰值以计算确定积分（例如，在原点中）。 补充图 3 说明了峰值确定、背景减法和峰值集成的过程。