JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

सक्स-एचपीएलसी का उपयोग करके विभिन्न पौधों की प्रजातियों से घुलनशील, रेडियोलेबल इनोसिटोल पॉलीफॉस्फेट का निष्कर्षण और क्वांटिफिकेशन

Published: June 26, 2020
doi:
10.3791/61495
, , ,
1Department of Plant Nutrition, Institute of Crop Science and Resource Conservation,University of Bonn

Summary

यहां हम मजबूत एनियन एक्सचेंज[3एच]-मायो-इनोसिटोल-लेबल वाले रोपण की उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफी का वर्णन करते हैं जो पौधों में इनोसिटोल पॉलीफॉस्फेट का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील तरीका है।myo

Abstract

मायो-इनोसिटोल के myoफॉस्फेट एस्टर, को इनोसिटोल फॉस्फेट (आईएनपीएस) भी कहा जाता है, पौधे फिजियोलॉजी में महत्वपूर्ण भूमिकाएं निभाने वाले सेलुलर नियामकों का एक वर्ग है। उनके नकारात्मक आवेश, कम बहुतायत और हाइड्रोलिटिक गतिविधियों के लिए संवेदनशीलता के कारण, इन अणुओं का पता लगाना और परिमाणीकरण चुनौतीपूर्ण है। यह विशेष रूप से ‘उच्च ऊर्जा’ डिफोस्फो बांड वाले अत्यधिक फॉस्फोरिलेटेड रूपों के लिए मामला है, जिन्हें इनोसिटोल पायरोफोस्फेट (पीपी-इन्स्प्स) भी कहा जाता है। इसकी उच्च संवेदनशीलता के कारण, मजबूत एनियन एक्सचेंज उच्च प्रदर्शन वाले तरल क्रोमेटोग्राफी (एसएक्स-एचपीएलसी) के साथ लेबल किए गए पौधों की[3एच]- मायो-इनोसिटोल वर्तमान में इन अणुओं का विश्लेषण करने के लिए पसंद की विधि है।myo रेडियोलेबल पौधों केरोपणके लिए मायो-इनोसिटोल का उपयोग करके, कई गैर-एन्टिओमेरिक आइसोमर्स सहित विभिन्न आईएनसपी प्रजातियों का पता लगाया जा सकता है और उच्च संवेदनशीलता के साथ भेदभाव किया जा सकता है।myo यहां, एक उपयुक्त सैक्स-एचपीएलसी सिस्टम के सेटअप का वर्णन किया गया है, साथ ही पौधों की खेती, रेडियोलाबेलिंग और आईएनएसपी निष्कर्षण से एसएक्स-एचपीएलसी रन और बाद में डेटा विश्लेषण के लिए पूरा वर्कफ्लो भी वर्णित है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल विभिन्न आईएनपी प्रजातियों के भेदभाव और मात्राकरण की अनुमति देता है, जिसमें कई गैर-एन्टियोमेरिक आइसोमर और पीपी-आईएनपी, आईएनएसपी7 और आईएनएसपी8शामिल हैं, और आसानी से अन्य पौधों की प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। उदाहरण के रूप में, अरबीडोप्सिस थैलियाना और लोटस जैपोनिकस रोपण के सैक्स-एचपीएलसी विश्लेषण किए जाते हैं और पूर्ण आईएनपी प्रोफाइल प्रस्तुत किए जाते हैं और चर्चा की जाती है। यहां वर्णित विधि पौधों में InsPs की जैविक भूमिकाओं को बेहतर ढंग से समझने के लिए एक आशाजनक उपकरण का प्रतिनिधित्व करती है।

Introduction

लगभग चार दशक पहले, इनोसिटोल फॉस्फेट (InsPs) सिग्नलिंग अणुओं के रूप में उभरा, आईएनएस (1,4,5) पी3 (आईएनएसपी3)के बाद एक दूसरे दूत के रूप में पहचाना गया जो पशु कोशिकाओं1, 2,में सीए2 + की रिसेप्टर-मध्यस्थता रिहाई को सक्रिय करताहै। आज तक, पौधों में कोई InsP3 रिसेप्टर (IP3-R) की पहचान नहीं की गई है, जो पौधों की कोशिकाओं3में InsP3 के लिए एक प्रत्यक्ष संकेत भूमिका पर सवाल उठाता है । भले ही, आईएनएसपी3 कई संयंत्र विकास प्रक्रियाओं में शामिल अन्य आईएनपी के लिए एक अग्रदूत के रूप में कार्य करता है, जिसमें विशिष्ट,सिग्नलिंग पाथवे3,4,,,5, 6,,6,7,8का नियमन शामिल है। उदाहरण के लिए, आईएनएसपी,3 को आईएनएसपी6से आगे फॉस्फोरिलेटेड किया जा सकता है, जिसे “फाइटिक एसिड” के रूप में भी जाना जाता है, जो फॉस्फेट, मायो-इनोसिटोलऔर cations के एक प्रमुख स्रोत का प्रतिनिधित्व करता है, और रोगजनकों, एमआरएनए निर्यात और फॉस्फेट होमोस्टासिस5,,9,,10,11,12के खिलाफ संयंत्र रक्षा में महत्वपूर्ण भूमिकाएं निभाते हुए दिखाया गया था।,

इनोसिटोल पायरोफोस्फेट (पीपी-आईएनपी) इन्स्प्स का एक वर्ग है जिसमें कम से कम एक उच्च ऊर्जा वाले डी-फॉस्फो बॉन्ड होते हैं, जो शुरू में पशु कोशिकाओं, अमीबा और खमीर में पहचाने जाते हैं, जहां वे विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं13,14,,15में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।, पौधों में पीपी-इन्सिप पर मौलिक कार्य के बावजूद16,17,18,,,19,,20,,,21,22,,,23,24,25, 26,,26इन अणुओं के जैविक कार्य और आइसोमर पहचान अभी भी काफी हद तक रहस्यपूर्ण बनी हुई है।,, मॉडल संयंत्र में अरबीडोप्सिस थैलियाना,सेलुलर आईएनएसपी8 को आईएमपी8 के संयोग-पता लगाने और ASK1-COI1-JAZ रिसेप्टर कॉम्प्लेक्स17द्वारा सक्रिय जस्मोनेट के माध्यम से कीट शाकाहारी और नेक्रोट्रोफिक कवक के खिलाफ सुरक्षा को विनियमित करने का प्रस्ताव किया गया था। इसके अलावा, ऊर्जा होमोस्टेसिस और पोषक तत्व संवेदन में आईएनएसपी 8 और अन्य पीपी-इन्स्प की भूमिकाओं के साथ-साथ फॉस्फेट होमोस्टेसिस17,23,,,24, 25,,,26प्रस्तावित किया गया है ।25

नियोजित जैविक प्रणाली के बावजूद, InsPs का अध्ययन करते समय एक प्रमुख पद्धतिगत चुनौती इन अणुओं का विश्वसनीय पता लगाने और सटीक मात्राकरण रही है। सेल अर्क से पीपी-इन्सेप्स सहित आईएनएसपी का पता लगाने के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित तरीकों का इस्तेमाल किया गया है । हालांकि , वे अध्ययन अलग आइसोमर्स26,27में अंतर करने में विफल रहे . आईएनएसपी का विश्लेषण करने के लिए एक और दृष्टिकोण टीओ2 मोतियों का उपयोग करके सेल लिसेट्स से आईएनएसपी के पुल-डाउन को नियोजित करता है, जिसके बाद एल्यूटेड आईएनपीएस का पॉलीएक्रीलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (पेज) होता है। इसके बाद आईएनपीएस को टोलुडीन ब्लू या डीएपीआई24 , 28,29,से दाग दिया जासकताहै . हालांकि, इस विधि का उपयोग करके संयंत्र अर्क से आईएनएसपी 5 की तुलना में आईएनएसपी 5 से कम इन्स्प्स का मज़बूती से पतालगाना अब तक संभव नहीं है। हाल ही में, इन्स्प्स के परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) विश्लेषण के लिए[13सी]-मायो-इनोसिटोल का उपयोग करने वाली एक विधि मजबूत एनियन एक्सचेंज हाई-परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमेटोग्राफी (सैक्स-एचपीएलसी)30के विकल्प के रूप में प्रकाशित की गई थी।myo इस तकनीक को एसएक्स-एचपीएलसी की तुलना में समान संवेदनशीलता प्राप्त करने और 5-आईएनएसपी7का पता लगाने की अनुमति देने के साथ-साथ सेल अर्क से विभिन्न गैर-एनेंटियोमेरिक आईएनपी5 आइसोमर्स के भेदभाव की सूचना दी गई है। हालांकि, एनएमआर-आधारित विधि के कार्यान्वयन के लिए रासायनिक संश्लेषित और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं है[13सी]- मायो-इनोसिटोल।myo इसलिए, अधिकांश मामलों मेंनियोजितविधि रेडियोलेबलिंग नमूने हैं, जिनमें मायो-इनोसिटोल है, जिसके बाद एसएक्स-एचपीएलसी31,32, 33,33है।myo, यह तकनीक संयंत्र में रेडियोधर्मी myoमायो-इनोसिटोल के तेज और समर्पित सेलुलर किनेस और फॉस्फेट की संयुक्त गतिविधि द्वारा विभिन्न आईएनएसपी में इसके रूपांतरण पर आधारित है।

इसकेबाद एसएक्स-एचपीएलसी का उपयोग करके एसिड-निकाले जाते हैं और आंशिक रूप से 10 00 00 00 000 000 0000 0000 0000 0000 0000 0000 0000 उनके नकारात्मक आवेश के कारण, आईएनपीएस एसएक्स-एचपीएलसी कॉलम के सकारात्मक आवेशित स्थिर चरण के साथ दृढ़ता से बातचीत करते हैं और कॉलम से इंस्पस को मात देने के लिए बढ़ते फॉस्फेट सांद्रता वाले बफर ग्रेडिएंट के साथ संबद्ध किया जा सकता है। इस प्रकार एल्यूशन का समय अलग होने के लिए आईएनएसपी प्रजातियों के चार्ज और ज्यामिति पर निर्भर करता है। चिरल कॉलम के अभाव में, केवल गैर-एन्टियोमेरिक आइसोमर्स इस प्रोटोकॉल द्वारा अलग हो सकते हैं। हालांकि, रेडियोलेबल मानकों का उपयोग एक विशिष्ट आईएनएसपी चोटी की आइसोमेरिक प्रकृति को आवंटित करने के लिए किया जा सकता है। विभिन्न प्रयोगशालाओं द्वारा भूत्यूल और अवेलेबल मानकों को (जैव) रासायनिक तरीकों के साथ उत्पन्न करने या उन्हें विभिन्न कोशिकाओं और जीवों से शुद्ध करने के लिए पूर्व में कई प्रयासों ने चोटियों को कुछ आईएनपी प्रजातियों को सौंपने में मदद की है, और व्यक्तिगत आईएनएसपी प्रजातियों 5 , 7,,21, 34,,,35,365,37,38,39,40,41,742,3943की आइसोमेट्रिक पहचान को कम करने42के43लिए भी । इसके अलावा, हाल ही में एंजाइमेटिक रास्तों की स्पष्टता जिससे पौधों में पीपी-इन्सेपी का गठन होता है, साथ ही एक विशिष्ट 1-फाइटास गतिविधि के साथ बैक्टीरियल टाइप III प्रभावक की खोज, इन विश्लेषणों के लिए उपयोगी मानकों को उत्पन्न करने के बारे में जानकारी प्रदान करता है10,,17,18,,,22,,23।

ट्रिटियम(3एच) के β-क्षय के कारण परिणामस्वरूप अंशों को तरल प्रस्फुटन काउंटर में मापा जा सकता है। लेबलिंग समय में वृद्धि के साथ, एक स्थिर-राज्य आइसोटोपिक संतुलन पहुंच जाता है, जिसके बाद प्राप्त आईएनएसपी प्रोफाइल को संयंत्र31की आईएनपी स्थिति का प्रतिनिधित्व करना चाहिए। अन्य उपलब्ध तकनीकों की तुलना में इस प्रोटोकॉल का प्रमुख लाभ InsPs के लिए प्रत्यक्ष अग्रदूत के उपयोग और रेडियोधर्मी संकेत के माप द्वारा प्राप्त उच्च संवेदनशीलता है।

एसैक्स-एचपीएलसी[3एच]-मायो-इनोसिटोल-लेबल वाले पौधों या अन्य जीवों से निकाले गए नमूनों का उपयोग आमतौर पर कम आईएनपी प्रजातियों से लेकर पीपी-आईएनपीएस तक के आईएनपी का पता लगाने और मात्राकरण के लिए किया जाता है, जो मेटाबॉलिज्म, कार्य और इन्सिप की कार्रवाई के तरीकों को बेहतर ढंग से समझने के लिए एक मूल्यवान उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है।myo अब तक, यह विधि कम आईएनपी प्रजातियों में विशेष रुचि वाले शोधकर्ताओं के लिए भी सबसे उपयुक्त विकल्प है। जबकि इस प्रक्रिया की मूल बातें, जिस पर यहां वर्णित प्रोटोकॉल पर बनाता है, पहले7,21, 31,,,34,संयंत्र व्युत्पन्न InsPs और विशेष रूप से पीपी-InsPs के विश्लेषण के अनुरूप एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है अभी भी लापता है ।,31 पिछले प्रकाशनों ने कम प्रचुर मात्रा में पीपी-इन्स्प्स, विशेष रूप से आईएमपी8का पता लगाने में कठिनाइयों की सूचना दी, जो निम्नलिखित कारकों में से एक या अधिक के कारण है: अपेक्षाकृत कम मात्रा में पौधे की सामग्री,कमविशिष्ट गतिविधि (> 20 Ci/mmol) के साथ मायो-इनोसिटोल, निष्कर्षण बफ़र्स का उपयोग जो या तो परक्लोरिक एसिड पर आधारित नहीं हैं या 1 एम से कम केंद्रित हैं, विभिन्न बेअसर बफर, साथ ही उप-इष्टतम ढाल या ऑन-लाइन डिटेक्टर के साथ[3एच] का पता लगाना।myo उन अध्ययनों की तुलना में, यहां,प्रस्तुत प्रोटोकॉल पीपी-आईएनपी7,21,34के विश्वसनीय पहचान के लिए डिज़ाइन किया गया है।,

यहां हम एक विस्तृत कार्यप्रवाह पेश करते हैं, जो उपकरणों के सेटअप से शुरू होकर खेती और लेबलिंग, आईएनएसपी निष्कर्षण और सैक्स-एचपीएलसी ही चलाते हैं। यद्यपि विधि को मॉडल पौधे ए थैलियानामें अनुकूलित किया गया था, लेकिन इसे अन्य पौधों की प्रजातियों का अध्ययन करने के लिए आसानी से संशोधित किया जा सकता है, जैसा कि यहां मॉडल फली लोटस जैपोनिकसके पहले रिपोर्ट किए गए आईएनस्प प्रोफाइल के साथ दिखाया गया है। हालांकि एक अलग पौधों की प्रजातियों के उपयोग के लिए कुछ अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है, हम परिकल्पना करते हैं कि वे मामूली होंगे, जिससे यह प्रोटोकॉल संयंत्र InsPs में आगे के अनुसंधान के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु बन जाएगा। संभावित अनुकूलन को सुविधाजनक बनाने के लिए, हम प्रोटोकॉल के भीतर हर कदम का संकेत देते हैं जिसमें संशोधन संभव हैं, साथ ही सभी महत्वपूर्ण कदम जो पहली बार विधि स्थापित करते समय चुनौतीपूर्ण हो सकते हैं। इसके अतिरिक्त, हम रिपोर्ट करते हैं कि इस विधि द्वारा प्राप्त डेटा का उपयोग विशिष्ट InsPs के परिमाणीकरण के लिए कैसे किया जा सकता है और विभिन्न नमूनों का विश्लेषण और तुलना कैसे की जा सकती है।

Protocol

1. एचपीएलसी सिस्टम की स्थापना एक प्रणाली स्थापित करें जिसमें दो स्वतंत्र एचपीएलसी पंप (बाइनरी पंप) शामिल हैं, प्रत्येक बफर के लिए एक। दोनों पंपों को संबंधित सॉफ्टवेयर के साथ एक कंप्यूटर के माध्यम से या एक मास्टर पंप होने से एक साथ नियंत्रित करने की आवश्यकता है । दोनों पंपों के लिए एक पिस्टन सील धोने को लागू करें, या तो गुरुत्वाकर्षण बल के माध्यम से या एक तिहाई कम दबाव पंप के माध्यम से । बफर ए (जिसे पंप ए कहा जाता है) के लिए एक पंप और बफर बी (जिसे पंप बी कहा जाता है) के लिए एक पंप नामित करें।नोट: दोनों को ६० बार (6 MPa) और प्रवाह दरों को कम से ०.५ mL/मिनट तक दबाव उत्पन्न करने में सक्षम होना चाहिए । दोनों पंपों को एक गतिशील मिक्सर से कनेक्ट करें। मिक्सर को कम से कम 1 मिलील क्षमता के सैंपल लूप के साथ एक इंजेक्शन वाल्व से कनेक्ट करें। इंजेक्शन वाल्व को इसी अंत फिटिंग के माध्यम से एक केशिका के साथ कॉलम से कनेक्ट करें। उचित लंबाई के साथ एक केशिका का उपयोग करके कॉलम को अंश कलेक्टर से कनेक्ट करें।नोट: यह विवरण हमारी एचपीएलसी प्रणाली (सामग्री की तालिकादेखें) पर आधारित है, जिसके लिए नए और अधिक परिष्कृत प्रणालियों की तुलना में अधिक मैनुअल चरणों की आवश्यकता होती है। हमारी प्रणाली सभी घटकों की आसान पहुंच और संशोधन की अनुमति देती है। क्वाटरर्नरी पंप (यहां वर्णित बाइनरी रेडिएंट के साथ) का भी उपयोग किया जा सकता है और बाइनरी पंपों के साथ प्राप्त किए गए विश्लेषणों के समान प्रोल्यूशन प्रोफाइल और समग्र गुणवत्ता का कारण बनेगा। 2. बफर, कॉलम और एचपीएलसी सिस्टम की तैयारी घुलनशील आईएनपीएस की निकासी के लिए बफर तैयार करें: निष्कर्षण बफर (1 एम एचसीएलओ4)और बेअसर बफर (1 एम के2सीओ3)। दोनों बफ़र्स को अल्ट्रा-प्योर डिसोनाइज्ड वॉटर के साथ तैयार करें। वे कई महीनों के लिए कमरे के तापमान पर स्थिर हैं। निष्कर्षण से तुरंत पहले, 3 m m (उदाहरण के लिए, फ़िल्टर किए गए 250 mM EDTA स्टॉक समाधान से) की अंतिम एकाग्रता के लिए दोनों समाधानों में ईडीटीए जोड़ें।सावधानी: एचसीएलओ4 (परक्लोरिक एसिड) दृढ़ता से संक्षारक है। सैक्स-एचपीएलसी रन के लिए बफर तैयार करें: बफर ए (1 एमएम ईडीटीए) और बफर बी (1 एमएम ईडीटीए, 1.3 एम (एनएच4)2एचपीओ4,पीएच 3.8 एच3पीओ4के साथ)। अल्ट्रा-प्योर डियोनाइज्ड पानी का उपयोग करके दोनों को तैयार करें और इसके बाद वैक्यूम फिल्ट्रेशन के बाद 0.2 माइक्रोन पोर-आकार झिल्ली फिल्टर के साथ। ये कई महीनों के लिए कमरे के तापमान पर स्थिर हैं।नोट: EDTA को सभी बफ़र्स में शामिल किया जाना चाहिए ताकि InsPs के साथ cations की बातचीत को रोका जा सके, जिसके परिणामस्वरूप इन्स्प चार्ज या यहां तक कि अघुलनशील आईएमपी नमक परिसरों में भी बदलाव आ सकता है। इस प्रकार ढाल कार्यक्रम: 0\u20122 मिनट, 0% बफर बी; 2\u20127 मिनट, 10% बफर बी तक; 7\u201268 मिनट, 84% बफर बी तक; 68\u201282 मिनट, 100% बफर बी तक; 82\u2012100 मिनट, 100% बफर बी, 100\u2012101 मिनट, 0% बफर बी के नीचे; 101\u012125 मिनट, 0% बफर बी इस ढाल के लिए इष्टतम प्रवाह दर 0.5 एमएल/मिनट है। रन के दौरान, हर मिनट अंश इकट्ठा करें, मिनट 1 से मिनट 96 तक शुरू करें। ढाल के शेष 30 मिनट कॉलम और प्रणाली को धोने के लिए सेवा करते हैं, और प्रस्फुटन गिनती के लिए एकत्र करने की व्यवस्था नहीं है । यदि संभव हो, तो एचपीएलसी पंपों के आपातकालीन शटडाउन से पहले अधिकतम पहुंच योग्य दबाव को 80 बार (8 MPa) में सेट करें। यह कॉलम के राल को महत्वपूर्ण क्षति से बचाता है। एक नए एसैक्स एचपीएलसी कॉलम का उपयोग करते समय, इसे पहले उपयोग से पहले फ़िल्टर किए गए अल्ट्रा-प्योर डिओनाइज्ड पानी के साथ अच्छी तरह से (>50 एमएल) धोएं।नोट: यह निहित मेथनॉल को हटाने को सुनिश्चित करेगा, इस प्रकार बाद के चरणों में नमक वर्षा को रोक देगा। हो सके तो अलग एचपीएलसी पंप का इस्तेमाल करें। यदि यह उपलब्ध नहीं है, तो सुनिश्चित करें कि एचपीएलसी ने कॉलम धोने से पहले पानी से फ्लश किया है। प्रवाह-दर 2 एमएल/न्यूनतम से अधिक नहीं होनी चाहिए। धोने के बाद, कॉलम विश्लेषण के लिए तैयार है और, जब ठीक से संभाला, 20 \ u201240 रन के लिए इस्तेमाल कियाजा सकता है । उसके बाद, संकल्प क्रमिक रूप से कम हो जाएगा। बफर ए (>1 h) के साथ लंबे समय तक धोने और चरण 2.6 प्रदर्शन कॉलम के जीवनकाल को बढ़ाने में मदद कर सकते हैं। यदि संकल्प में कमी बनी रहती है, तो कॉलम का आदान-प्रदान करने की आवश्यकता है। ढाल विशिष्ट इनोसिटोल पॉलीफॉस्फेट प्रजातियों के बीच जुदाई को बढ़ाने के लिए या समग्र रनटाइम को कम करने के लिए समायोजित किया जा सकता है। विभिन्न एचपीएलसी सिस्टम (विभिन्न शून्य मात्रा या केशिकाओं की विभिन्न मात्रा के साथ) का उपयोग करना दृढ़ता से प्रतिधारण समय को प्रभावित करेगा। इसके अलावा, कॉलम परिवर्तन प्रतिधारण समय पर मामूली प्रभाव पड़ता है । “मॉक रन” करें। निकाले गए नमूने के बजाय, एचपीएलसी सिस्टम में फ़िल्टर किए गए अल्ट्रा-प्योर डिओनाइज्ड पानी इंजेक्ट करें और मानक ढाल चलाएं। अंश एकत्र करने की ललक नहीं है।नोट: चरण 2.6 वैकल्पिक है। हालांकि, यदि निम्नलिखित स्थितियों में से एक लागू होता है तो इसे किया जाना चाहिए: एक नया कॉलम स्थापित किया गया है; एचपीएलसी प्रणाली का उपयोग पहले से एक अलग विधि के लिए किया गया है; एचपीएलसी प्रणाली का उपयोग 3 दिनों से अधिक समय से नहीं किया गया है; पिछले रन को लेकर समस्या थी । 3. पौधों की खेती और लेबलिंग के साथ[3एच]-मायो-इनोसिटोलmyo नोट: निम्नलिखित चरणों को बाँझ घटकों और बाँझ परिस्थितियोंमें किया जाना चाहिए, जबकि रेडियोलेबल के साथ हाथों को दूषित होने से बचाने के लिए दस्ताने पहने हुए। प्लांट मीडिया, खासकर जब सुक्रोज युक्त होता है, तो माइक्रोबियल संदूषण का खतरा होता है। 3 मिनट के लिए 1.2% सोडियम हाइपोक्लोराइट के 1 मिलील के साथ ए थैलियाना बीज को स्टरलाइज करें और इसके बाद 3 मिनट के लिए 70% इथेनॉल की 1 एमसीएल। फिर 100% इथेनॉल के 1 एमसीएल जोड़ें, एक परिपत्र फिल्टर पेपर पर इथेनॉल के साथ बीज को पिपेट करें और उन्हें एक साफ बेंच पर लेमिनार-प्रवाह के तहत हवा-सूखने की अनुमति दें। एल जैपोनिकस बीजों का उपयोग करते समय, उन्हें पर्याप्त अंकुरण दर सुनिश्चित करने के लिए नसबंदी से पहले सैंडपेपर के साथ मोर्टार और स्क्रब बीज में रखें। ठोस विकास मीडिया से भरे स्क्वायर पेट्री व्यंजनों पर 1-2 पंक्तियों में अरबीडोप्सिस बीज बोएं जिसमें आधी ताकत मुर्शिज और स्कूग (एमएस) नमक समाधान, 1% सुक्रोज, 0.7% गेलन गम को कोह के साथ पीएच 5.7 में समायोजित किया गया है और उन्हें अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 दिन के लिए स्तरीकरण करने की अनुमति देता है। लोटस बीजों के लिए, उन्हें 1 पंक्ति में स्क्वायर पेट्री व्यंजन पर बोएं, जिसमें ठोस विकास मीडिया से भरा हुआ है जिसमें 0.8% जीवाणु आगार शामिल है और उन्हें अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 3 दिनों के लिए स्तरीकरण करने की अनुमति दें। प्लेटों को एक विकास इनक्यूबेटर या जलवायु कक्ष में खड़ी रखें और उन्हें कम दिन की स्थितियों के तहत 10-12 दिनों के लिए बढ़ने की अनुमति दें (22 डिग्री सेल्सियस पर 8 घंटे प्रकाश, 20 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे अंधेरा)। 10-20 रोपण को 12-अच्छी तरह से स्पष्ट फ्लैट-तली सेल संस्कृति प्लेट के एक कुएं में स्थानांतरित करें, जो 2 एमएल आधी ताकत एमएस नमक समाधान से भरा हुआ है जो 1% सुक्रोज के साथ पूरक है और पीएच 5.7 में समायोजित है। [3 एच]- मायो-इनोसिटोल(30-80सीआई/mmol, 90% इथेनॉल में भंग) और कोमल घूमता द्वारा मिश्रण के 45 μCi जोड़ें।myo प्लेट को संबंधित ढक्कन से ढक दें और इसे माइक्रोपोरस सर्जिकल टेप (जैसे, माइक्रोपोर या ल्यूकोपोर टेप) के साथ सील करें, इसे विकास इनक्यूबेटर में वापस रखें।सावधानी:[3एच] एक कम ऊर्जा बीटा उत्सर्जक है जो नंगे त्वचा के माध्यम से साँस लेने, निगलने या अवशोषित होने पर हानिकारक विकिरण खतरा हो सकता है। रेडियोधर्मी सामग्री या उपकरण है कि रेडियोधर्मी सामग्री के लिए प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष संपर्क किया है संभालने जब हमेशा दस्ताने पहनते हैं । इसके अलावा रेडियोकेमिकल्स की सुरक्षित हैंडलिंग के लिए स्थानीय नियमों का पालन करें (उदाहरण के लिए, अतिरिक्त सुरक्षात्मक कपड़े पहने, एक डोसिमेटर का उपयोग और नियमित आधार पर संदूषण के लिए सतहों का सर्वेक्षण)। लेबलिंग के 5 दिनों के बाद, मीडिया से रोपण निकालें और उन्हें संक्षेप में डिओनाइज्ड पानी से धोएं। उन्हें कागज तौलिए के साथ सुखाएं और उन्हें 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। ट्यूब को ओवरफिल न करें, और 100 मिलीग्राम एफडब्ल्यू/ट्यूब से अधिक न रखें, जो लगभग 10\u201220 17-पुराने रोपण से मेल खाती है।नोट: पौधे की सामग्री की अधिकता निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान एसिड को पतला करेगी और निष्कर्षण दक्षता को दृढ़ता से कम कर देगी। स्नैप-तरल नाइट्रोजन में ट्यूब फ्रीज और निष्कर्षण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर इसे स्टोर करें।नोट: नमूने की गुणवत्ता से समझौता किए बिना कई हफ्तों तक -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है। विकास की स्थिति (मीडिया, प्रकाश, तापमान, समय) एक विशिष्ट प्रयोग या पौधों की प्रजातियों की जरूरतों के अनुसार संशोधित किया जा सकता है। हालांकि, अच्छी गुणवत्ता के मात्रात्मक सैक्स-एचपीएलसी रन सुनिश्चित करने के लिए [3एच-मायो-इनोसिटोल को कमजोर करते समय देखभाल की जानी चाहिए।myo इसलिए, यहां बताए गए[3एच]-मायो-इनोसिटोल सांद्रता के साथ शुरू करने की सिफारिश की जाती है और यदि वांछित हो तो इसे कदम से कम करें।myo लेबलिंग समय के दौरान, पौधों को वैश्विक InsPs पर उन स्थितियों के प्रभाव का आकलन करने के लिए विभिन्न उपचारों (जैसे, पर्यावरणीय तनाव या रासायनिक एजेंटों) में प्रस्तुत किया जा सकता है। स्थिर-राज्य लेबलिंग तक पहुंचने के लिए, हम कम से कम 5 दिनों के लिए पौधों को लेबल करने की सलाह देते हैं। 4. घुलनशील आईएनपीएस की निकासी नोट: पूरी निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर नमूने और अभिकर् ता रखें। हमेशा रेडियोधर्मी सामग्री के साथ संपर्क के उच्च जोखिम के कारण दस्ताने और सुरक्षात्मक चश्मा पहनें, विशेष रूप से पीसने के दौरान। सब कुछ है कि नमूनों के संपर्क में हो जाता है रेडियोधर्मी अपशिष्ट के रूप में माना जाता है और रेडियोधर्मी सामग्री के सुरक्षित निपटान के लिए स्थानीय नियमों के अनुसार निपटाया जाना चाहिए । चरण 2.1 में निष्कर्षण और बेअसर बफर के लिए काम करने वाले समाधान तैयार करें। प्रत्येक नमूने को निष्कर्षण बफर के 600 माइक्रोन और बेअसर बफर के 400 माइक्रोन की आवश्यकता होगी। बर्फ पर बफ़र्स स्टोर करें। -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से नमूने लें और आगे की प्रक्रिया तक उन्हें तरल नाइट्रोजन में रखें। नमूनों को माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब मूसल के साथ पीसें जब तक कि वे विगलन शुरू न करें और बर्फ-ठंडे निष्कर्षण बफर के 500 माइक्रोन जोड़ें। जब तक नमूना पूरी तरह से समरूप न हो जाए तब तक पीसने जारी रखें और समाधान का गहरा हरा रंग हो (यदि नमूने में पत्तियां मौजूद हैं)। 18000 x ग्रामपर 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए नमूनों ≥ अपकेंद्रित्र । सुपरनेट को एक ताजा 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। ध्यान रखें कि निष्कर्षण के लिए उपयोग की जाने वाली ट्यूबों को ठोस रेडियोधर्मी अपशिष्ट माना जाता है और तदनुसार निपटान की आवश्यकता होती है। ध्यान से निकालने के लिए बेअसर बफर के 300 μL जोड़ें। प्रोटीन और बुदबुदाती की वर्षा तुरंत शुरू हो जाएगी। एक मिनट के बाद एक पिपेट टिप के साथ घूमता द्वारा मिलाएं और पीएच पेपर (पीएच 6-9 की आदर्श सीमा) पर एक छोटी राशि (5 माइक्रोन) को पिपेट करने से पहले कुछ सेकंड तक प्रतीक्षा करें। पीएच अंत में पीएच 7 और 8 के बीच होना चाहिए। यदि आवश्यक हो, तो वांछित पीएच तक पहुंचने तक या तो बेअसर बफर या निष्कर्षण बफर की छोटी मात्रा (आमतौर पर 10-20 माइक्रोन) जोड़ें। नमूनों को खुले ढक्कन के साथ कम से कम 1 घंटे के लिए बर्फ पर आराम करने दें। 18,000 एक्स जीपर 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए नमूनों को सेंट्रलाइज ≥। सुपरनेट को एक ताजा 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।नोट: नमूनों या तो सीधे एक SAX-HPLC चलाने में इस्तेमाल किया जा सकता है या बर्फ पर रखा (यदि एक ही दिन बाद में इस्तेमाल किया) या तरल नाइट्रोजन में जमे हुए और 2 \ u20124 सप्ताह के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत । उच्च प्रजनन क्षमता और तुलनीयता सुनिश्चित करने के लिए, हमेशा तरल नाइट्रोजन में नमूनों को 5 मिनट के लिए फ्रीज करने की सिफारिश की जाती है, भले ही उनका उपयोग सीधे बाद में किया जाएगा। -80 डिग्री सेल्सियस पर निकाले गए नमूनों का दीर्घकालिक भंडारण तब तक संभव है जब तक नमूने केवल एक बार गल जाते हैं। यदि विश्लेषण के लिए जमे हुए नमूनों का उपयोग किया जाता है, तो सुनिश्चित करें कि विगलन के बाद कोई कण दिखाई नहीं दे रहे हैं। अन्यथा, 18,000 x g ≥ पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए फिर से अपकेंद्रित्र करें और सुपरनिटेंट को एक ताजा 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। 5. एचपीएलसी रन का प्रदर्शन 96 छोटे प्रस्फुटन शीशियों (~ 6 एमएल की क्षमता) के साथ अंश कलेक्टर से लैस करें और प्रत्येक शीशी को एक उपयुक्त प्रस्फुटन कॉकटेल (जैसे, अल्टिमा-फ्लो एपी तरल प्रस्फुटन कॉकटेल) के 2 एमएल के साथ भरें, जो कम पीएच और उच्च अमोनियम फॉस्फेट एकाग्रता (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ बफ़र्स के साथ संगत है।नोट: शीशियों की संख्या और शीशियों का आकार अंश कलेक्टर और प्रस्फुटन काउंटर पर निर्भर करता है। कम से कम पहले 90 अंशोंको इकट्ठा करना महत्वपूर्ण है, यदि यहां वर्णित ढाल का उपयोग किया जाता है, तो पूर्ण इनोसिटोल पॉलीफॉस्फेट प्रोफ़ाइल प्राप्त करने के लिए। इसके अलावा, अंशों या नमूनों के मिश्रण को रोकने के लिए, हर शीशी और उसके संबंधित ढक्कन को ठीक से लेबल करना सुनिश्चित करें। एचपीएलसी सिस्टम/पंप शुरू करें और इसे चलाने के लिए तैयार करें । पिस्टन सील वॉश को सक्रिय करें और पूरे रन के दौरान इसे सक्रिय रखें। एक उपयुक्त सिरिंज (सामग्रीकी तालिका देखें) का उपयोग करके चरण 4.5 (लगभग 750 माइक्रोन) से पूर्ण सुपरनैंट को मैन्युअल रूप से इंजेक्ट करके नमूना लोड करें। यदि स्वचालित इंजेक्शन संभव है, तो नमूना को संबंधित नमूना शीशी में स्थानांतरित करें। वाल्व को “लोड” से “इंजेक्ट” स्थिति में बदलें और ढाल और अंश कलेक्टर शुरू करें।नोट: उपयोग की जाने वाली एचपीएलसी प्रणाली के आधार पर, शुरुआती प्रक्रिया अलग हो सकती है, खासकर जब पुराने सिस्टम (जैसा कि यहां वर्णित है) की तुलना पूरी तरह से सॉफ्टवेयर-नियंत्रित नए मॉडल के साथ करें। यह सुनिश्चित करना बहुत महत्वपूर्ण है कि ढाल, नमूना इंजेक्शन और अंश संग्रह एक साथ शुरू करें। जबकि एचपीएलसी रन चल रहा है, नियमित रूप से दबाव की जांच करें। शुरुआती दबाव 18-24 बार (1.8-2.4 एमपीए) के आसपास होना चाहिए और 100% बफर बी तक पहुंचने के बाद धीरे-धीरे 50-60 बार (5-6 एमपीए) तक बढ़ना चाहिए।सावधानी: कम दबाव प्रणाली में रिसाव का संकेत हो सकता है, जबकि बढ़ा दबाव एक रुकावट इंगित करता है । दबाव में उतार-चढ़ाव (कुछ सेकंड में ≥ 3 बार) सिस्टम में हवा की उपस्थिति का संकेत दे सकता है। ध्यान रखें कि कॉलम को छोड़ने वाली हर चीज, साथ ही इंजेक्टर पर या बाद में होने वाला हर रिसाव रेडियोधर्मीहै।नोट: दबाव भी एचपीएलसी प्रणाली पर निर्भर करता है और कम या अधिक से अधिक यहां कहा जा सकता है । लगभग 15-20 रन के बाद यह धीरे-धीरे बढ़ेगा। हालांकि, यह जरूरी नहीं कि प्राप्त रन की गुणवत्ता को प्रभावित करता है । रन के बाद, शीशियों को कसकर बंद करें और जोरदार झटकों से प्रस्फुटन कॉकटेल के साथ अंशों को मिलाएं। माप के साथ सीधे आगे बढ़ें या शीशियों को एक ईमानदार स्थिति में रखें, आदर्श रूप से अंधेरे में।नोट: प्रस्फुटन कॉकटेल के साथ मिश्रित अंश हफ्तों के लिए स्थिर हैं और बाद में मापा जा सकता है। चूंकि ट्राइटियम का आधा जीवन 12.32 वर्ष है, इसलिए सिग्नल हानि नगण्य है। एक बार दिन के अंतिम नमूने की दौड़ समाप्त हो जाने के बाद, दोनों एचपीएलसी पंपों को बंद कर दें। (वैकल्पिक) प्रणाली की दीर्घायु बढ़ाने के लिए, खासकर जब इसका नियमित रूप से उपयोग नहीं किया जाता है, तो बफर बी से केशिका को बफर ए के साथ बोतल में रखकर पंप बी और केशिकाओं को धोएं और पंप को 10-15 मिनट तक चलने दें। अगले उपयोग से पहले, बफर बी में केशिका को बदलने के लिए और मिक्सर से पंप बी को अनकपल करने के लिए इसे बफर बी के साथ फ्लश करना याद रखें। एक बार जब पंप और केशिकाओं को बफर बी से फिर से भर दिया जाता है, तो इसे मिक्सर से फिर से कनेक्ट करें और सिस्टम उपयोग करने के लिए तैयार है। 6. अंशों को मापने प्रस्फुटन काउंटर रैक में शीशियों डालें और एक तरल प्रस्फुटन काउंटर में 5 मिनट के लिए प्रत्येक शीशी को मापने। आदर्श रूप से, रैक का उपयोग करें जो सीधे छोटी शीशियों को फिट करते हैं और गिनती त्रुटियों को कम करने के लिए बड़ी (उदाहरण के लिए, 20 एमएल) शीशियों में फांसी से बचते हैं। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सॉफ्टवेयर सेटिंग्स को पूरक चित्र 1में दिखाया गया है।नोट: नियमित रूप से एक एसएनसी (आत्म-सामान्यीकरण और अंशांकन) प्रोटोकॉल का उपयोग करके अकांगित[3एच] मानकों का उपयोग करें। प्रतीक्षा समय को कम करने के लिए कम गिनती का समय (1-5 मिनट) संभव है। हालांकि, उच्च गिनती प्रजनन क्षमता और सटीकता सुनिश्चित करने के लिए, 5 मिनट की सिफारिश की जाती है। 7. डेटा विश्लेषण प्रस्फुटन काउंटर से माप को स्प्रेडशीट फ़ाइल या संगत/परिवर्तनीय फ़ाइल प्रारूप के रूप में निर्यात करें। एक्सेल या इसी तरह के सॉफ्टवेयर से लैस कंप्यूटर और मूल जैसे उपयुक्त विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ डेटा का मूल्यांकन करें। एक 2-डी लाइन चार्ट तैयार करें जहां प्रति मिनट मापा गया गिनती (सीपीएम) को प्रतिधारण समय के खिलाफ प्लॉट किया जाता है (चित्रा 1, चित्रा 2देखें)। एक दूसरे के साथ नमूनों की तुलना करने के लिए, प्रत्येक व्यक्ति के नमूने के लिए 25 से 96 मिनट तक प्रत्येक eluted अंश से सीपीएम को संक्षेप में समाप्त करें।नोट: मिनट 25 का उपयोग अनिगमित[3एच]-मायो-इनोसिटोल, आईएनएसपी 1 और आईएनएसपीmyo2 को विश्लेषण से बाहर करने के लिए कट-ऑफ के रूप में कियाजाता है, क्योंकि वे दृढ़ता से उतार-चढ़ाव करते हैं और अच्छी तरह से अलग नहीं हो सकते हैं (कम से कम इस प्रोटोकॉल में प्रस्तावित ढाल के साथ) और इस प्रकार उनकी उच्च गतिविधि के कारण सामान्यीकरण कारक को दृढ़ता से बदल देते हैं। अन्य नमूनों के कुल सीपीएम (अंश 25-96 में) द्वारा नमूने से कुल सीपीएम को विभाजित करके सबसे कम कुल सीपीएम (अंश 25-96 में) के साथ नमूने से सभी डेटा को सामान्य करें। परिणामस्वरूप कारक तो कारक के साथ प्रत्येक अंश के सीपीएम गुणा द्वारा प्रत्येक अंश से सीपीएम को सामान्य करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।नोट: अंत में, 25 मिनट से अंत तक सीपीएम मूल्यों का योग एक दूसरे की तुलना में सभी नमूनों के लिए बराबर होना चाहिए । केवल सामान्यीकृत रन एक ही ग्राफ/फिगर (जब वास्तविक प्रोफाइल के रूप में प्रस्तुत) में प्रस्तुत किया जाना चाहिए । पूरक चित्रा 2 इस बात का उदाहरण दिखाता है कि ये गणना चरण कैसे बनाए जाते हैं (सरलीकरण के लिए दो नमूनों में से केवल 25-35 अंशों का उपयोग करके)। हालांकि, कुछ मामलों में डेटा को सामान्य करना आवश्यक नहीं है। उदाहरण के लिए, जब चोटियों को चरण 7.4 के अनुसार निर्धारित किया जाता है और कुल आईएनपीएस के प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत किया जाता है (जैसा कि चित्र 3 डीमें दिखाया गया है)। जैसा कि पहले कहा गया है, प्रोफाइल के रूप में कई विश्लेषणों को प्रस्तुत करते समय, या जब वास्तविक मापा गतिविधि निष्कर्षों के लिए उपयोग की जाती है (उदाहरण के लिए, उपचार ए) नियंत्रण की तुलना में एक्स% द्वारा InsP7 बढ़ जाती है, दोनों नमूनों के InsP 7 के सीपीएम मूल्यों की चर्चा करतेहुए और कुल InsPs के अपने प्रतिशत के लिए नहीं) सामान्यीकरण की आवश्यकता है । लेबलिंग दक्षता पर जीनोटाइप या उपचार मतभेदों के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए, सामान्यीकरण नहीं करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह इन मतभेदों को अमान्य कर देगा। हालांकि, इस विधि के साथ पूर्ण मात्राकरण चुनौतीपूर्ण है क्योंकि इस प्रोटोकॉल के साथ निष्कर्षण दक्षता विभिन्न कारणों से परिवर्तनशील हो सकती है और कभी-कभी एक ही जीनोटाइप और उपचार की प्रतिकृति का विश्लेषण किए जाने पर भी मनाया जाता है। ध्यान रखें कि विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली एचपीएलसी प्रणाली, कॉलम और ढाल के आधार पर, कट-ऑफ को बदलने की आवश्यकता हो सकती है। कुछ इनोसिटोल पॉलीफॉस्फेट चोटियों के सापेक्ष मात्राकरण करने के लिए और बाद में बार ग्राफ बनाने के लिए जिसमें सांख्यिकीय विश्लेषणों के लिए प्रतिकृतियों का डेटा होता है, एक विशेष सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण जारी रखें जो क्रोमाटोग्राम (जैसे, मूल) के चरम क्षेत्रों की गणना कर सकता है। पूरक चित्र 3देखें ।नोट: अधिकांश एचपीएलसी सिस्टम जो सॉफ्टवेयर-नियंत्रित हैं, इस कार्य में सक्षम संबंधित सॉफ्टवेयर के साथ आपूर्ति की जाती है। चोटियों पृष्ठभूमि के ऊपर सीपीएम मूल्यों के साथ अंश के रूप में निर्धारित कर रहे है (है कि रन के बीच एक निश्चित डिग्री के लिए बदलता है) और प्रतिधारण समय है कि पहले से प्रकाशित डेटा के समान हैं । एक विशिष्ट चोटी का अवधारण समय स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर (जैसे, एक्सेल) में निर्धारित किया जाता है और निश्चित अभिन्न (उदाहरण के लिए, मूल में) की गणना के लिए चोटियों को आवंटित करने के लिए उपयोग किया जाता है। पूरक चित्रा 3 चोटी निर्धारण, पृष्ठभूमि घटाव और चोटियों के एकीकरण की इस प्रक्रिया को दिखाता है।

Representative Results

यहां दिखाए गए परिणामों का उद्देश्य तकनीकी और जैविक स्तरों पर भिन्नता के अनुसार प्राप्त संभावित परिणामों को चित्रित करना है । पहला, नए बनाम वृद्ध स्तंभों(चित्रा 1)और ताजा बनाम संग्रहित नमूनों(चित्रा 3)का उपयोग करके विश्लेषण द्वारा उदाहरण दिया गया है, और दूसरा दो अलग-अलग पौध प्रणालियों, ए थैलियाना (चित्रा 1, चित्रा 3)और एल जैपोनिकस (चित्रा 2)से अर्क का मूल्यांकन करके। एक इष्टतम सैक्स-एचपीएलसी रन को चित्र 1ए\u2012Cपर दर्शाया गया है, जो प्रस्फुटन गिनती के बाद ए थैलियाना अर्क से प्राप्त एक पूर्ण इनोसिटोल पॉलीफॉस्फेट स्पेक्ट्रम दिखाता है। ध्यान दें कि चोटियों को अच्छी तरह से अलग किया जाता है और पहले5,,7वर्णित क्रोमेग्राफिक गतिशीलता के आधार पर विभिन्न आइसोमर्स (या एनेंटिमर-जोड़े) को सौंपा जा सकता है। चित्रा 2 एल जैपोनिकस रोपण के एक सैक्स-एचपीएलसी विश्लेषण का प्रतिनिधि परिणाम दिखाता है जो अरबीडोप्सिस रोपण के समान परिस्थितियों में उगाए गए थे और लेबल किए गए थे। जबकि संभवतः सभी आईएनएसपी प्रजातियों और चोटियों कि अरबीडोप्सिस से जाना जाता है देखा जा सकता है, वहां रिश्तेदार के बारे में काफी मतभेद है (जैसे, isomers के बीच अनुपात) विशिष्ट InsP isomers की राशि, जब दोनों प्रजातियों के प्रोफाइल की तुलना । उदाहरण के लिए, लोटस अर्क ने अरबीडोप्सिस की तुलना में आईएनएसपी3सी,आईएनएसपी4बी,आईएनएसपी5बी और कम आईएनएसपी3ए,आईएनएसपी4ए,आईएनएसपी5ए और आईएनएसपी5सी को दिखाया जो आगे की जांच के लिए जगह छोड़ता है । चित्रा 2डी अरबीडोप्सिस और लोटसके बीच आईएनएसपी आइसोमर्स के बीच विभिन्न अनुपातों को दर्शाता है। चित्रा 3 एक नमूना है कि निष्कर्षण के बाद विभाजित किया गया था की दो InsP प्रोफाइल से पता चलता है । पहली छमाही का तुरंत विश्लेषण किया गया और दूसरी छमाही एक दिन बाद, भंडारण के बाद-८० डिग्री सेल्सियस । ध्यान दें कि चित्रा 3ए\u2012Cऔर चित्रा 3 डी पर विभिन्न नमूनों (यानी, काले और लाल रेखाओं) के बीच केवल मामूली अंतर देखा जाता है। यह दिखाता है कि एक फ्रीज-गल चक्र नमूने को नुकसान नहीं पहुंचाता है और विधि स्वयं प्रजनन योग्य परिणाम उत्पन्न करती है। चित्रा 1: इस प्रोटोकॉल के साथ किए गए एक सफल और असफल सैक्स-एचपीएलसी विश्लेषण की विशिष्ट आईएनएसपी प्रोफ़ाइल। (एक\u2012C) 17 दिन पुराने जंगली प्रकार(कर्नल-0) अरबीडोप्सिस रोपण का सैक्स-एचपीएलसी प्रोफाइल[3एच]- मायो-इनोसिटोल के साथ रेडियोलेबल।myo उसी दिन ग्लोबल आईएनएसपी एक्सट्रैक्पन और एसएक्स-एचपीएलसी रन का प्रदर्शन किया गया। (A)पूर्ण स्पेक्ट्रा; (बी, सी) ए में दिखाए गए प्रोफाइल के जूम-इन। सभी दृश्यमान चोटियों को हाइलाइट किया गया है और इसी आईएनएसपी प्रजातियों को सौंपा गया है। प्रकाशित क्रोमेग्राफिक मोबिलिटीज5,,7के आधार पर, आईएनएसपी4ए संभावित आईएनएस (1,4,5,6) पी4 या आईएनएस (3,4,5,6) पी4,आईएनपी5ए का प्रतिनिधित्व करता है, आईएनपी5 [2-ओह], आईएनएसपी5b InsP5 [4-OH] या इसके एंटिओमेरिक फॉर्म InsP5 [6-OH] का प्रतिनिधित्व करता है, और आईएनएसपी5सी आईएनपी5 [1-ओह] या इसके एन्टियोमेरिक फॉर्म InsP5 [3-OH] का प्रतिनिधित्व करता है। आईएनएसपी3ए-सी,आईएनएसपी4बी,आईएनएसपी7और आईएनएसपी8 की आइसोमेरिक प्रकृति अभी भी अज्ञात है। पैनल(डी)समान रूप से उगाए गए पौधों की एक सैक्स-एचपीएलसी प्रोफाइल दिखाता है, लेकिन एक वृद्ध कॉलम (>40 रन) का उपयोग कर रहा है। अन्य आईएनएसपी प्रजातियों की तुलना में आईएनएसपी6 की स्पष्ट कमी और पीपी-आईएनएसपी की अनुपस्थिति दिखाई दे रही है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । चित्रा 2: एल जैपोनिकस पौधों का प्रतिनिधि आईएनएसपी प्रोफाइल। 17 दिन पुराने जंगली प्रकार (गिफू) एल जैपोनिकस रोपण के सैक्स-एचपीएलसी प्रोफाइल(एक\u2012C)[3एच]-मायो-इनोसिटोल के साथ रेडियोलेबल ।myo (A)पूर्ण स्पेक्ट्रा; (बी, सी) ए में दिखाए गए प्रोफाइल के जूम-इन। सभी दृश्यमान चोटियों को हाइलाइट किया गया है और इसी आईएनएसपी प्रजातियों को सौंपा गया है। प्रकाशित क्रोमेग्राफिक गतिशीलता के आधार पर5,,7,InsP4a की संभावना आईएनएस (1,4,5,6) पी4 या आईएनएस (3,4,5,6) पी4,आईएनपी5बी की संभावना आईएनपी5 [4-ओह] या इसके एनेंटीओमेरिक फॉर्म InsP5 [6-OH], का प्रतिनिधित्व करती है। और InsP5c की संभावना InsP5 [1-ओह] या उसके enantiomeric फार्म InsP5 [3-ओह] का प्रतिनिधित्व करता है । आईएनएसपी3ए-सी,आईएनएसपी4बी,आईएनएसपी7और आईएनएसपी8 की आइसोमेरिक प्रकृति अज्ञात है। (घ)ए थैलियाना (चित्रा 1 ए\u2012C से डेटा) और एल जैपोनिकस (चित्रा 2ए-सीसे डेटा) की व्यक्तिगत आईएनपी प्रजातियों (elution25\u201296से कुल गतिविधि के% में) के बीच तुलना । Figure 2 कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । चित्रा 3: एसैक्स-एचपीएलसी विश्लेषणों की पुन: उत्पन्नता को दर्शाते हुए एक स्प्लिट नमूने की आईएनपी प्रोफाइल। (एक\u2012C) 17 दिन पुराने जंगली प्रकार(कर्नल-0) अरबीडोप्सिस रोपण के सैक्स-एचपीएलसी प्रोफाइल[3एच]-मायो-इनोसिटोल के साथ रेडियोलेबल।myo रन से पहले, नमूना विभाजित किया गया था और एक आधा तुरंत चलाने के लिए और दूसरे आधे एक दिन बाद भंडारण के बाद-८० डिग्री सेल्सियस (एक)पूर्ण स्पेक्ट्रा; (बी, सी) ए में दिखाए गए प्रोफाइल के जूम-इन। सभी दृश्यमान चोटियों को हाइलाइट किया गया है और इसी आईएनएसपी प्रजातियों को सौंपा गया है। प्रकाशित क्रोमेग्राफिक मोबिलिटीज5,,7के आधार पर, आईएनएसपी4ए संभावित आईएनएस (1,4,5,6) पी4 या आईएनएस (3,4,5,6) पी4,आईएनपी5ए का प्रतिनिधित्व करता है, आईएनपी5 [2-ओह], InsP5a InsP5 [2-OH], InsP5b का प्रतिनिधित्व करता है InsP5 [4-OH] या इसके enantiomeric फार्म InsP5 [6-ओह], और InsP5c InsP5 [1-OH] या उसके enantiomeric फार्म InsP5 [3-ओह] का प्रतिनिधित्व करता है । आईएनएसपी3ए-सी,आईएनएसपी4बी,आईएनएसपी7और आईएनएसपी8 की आइसोमेरिक प्रकृति अभी भी अज्ञात है। पैनल डी आईएनएसपी6 और पीपी-आईएनपी आईएनएसपी7 और आईएनएसपी8 के दोनों रनों की मात्रा दिखाता है । मान राशि का प्रतिनिधित्व करते हैं (%) सभी आईएनएसपी के सापेक्ष संबंधित आईएसएसपी प्रजातियों में से (कुल गतिविधि 25-96 से) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । पूरक चित्रा 1: प्रकाश प्रस्फुटन काउंटर का उपयोग करके तरल प्रस्फुटन गणना के लिए सॉफ्टवेयर सेटिंग्स। सॉफ्टवेयर संस्करण दिखाने वाले स्क्रीनशॉट, साथ ही इस प्रोटोकॉल के साथ किए गए[3एच] नमूनों की प्रस्फुटन गिनती के लिए उपयोग की जाने वाली सेटिंग्स को चित्रित किया गया है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें । पूरक चित्रा 2: डेटा सामान्यीकरण का प्रतिनिधि उदाहरण। एक वर्कशीट का स्क्रीनशॉट सभी चरणों और सूत्रों को सामान्य करने के लिए इस्तेमाल किया SAX-HPLC एक दूसरे के लिए चलाता है दिखाता है । सरलीकरण के लिए नमूनों के केवल अंश 25-35 दर्शाए गए हैं। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें । पूरक चित्रा 3: पीक दृढ़ संकल्प, पृष्ठभूमि घटाव और विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एकीकरण। (A)सैक्स-एचपीएलसी विश्लेषण से डेटा सॉफ्टवेयर (मिनट 28-96) में लोड किया जाता है और पीक एनालाइजर टूल का चयन किया जाता है। (BB\u2012ई) आधार रेखा को व्यक्तिगत चोटियों के बीच अंक स्थापित करके मैन्युअल रूप से परिभाषित किया गया है और पृष्ठभूमि को घटाया जाता है। (च) चोटियों का निर्धारण मैन्युअल रूप से उपस्थिति और प्रकाशित क्रोमेग्राफिक मोबिलिटीज 5,7के आधार पर कियाजाताहै । (जी)पीक रेंज को सीपीएम मूल्यों द्वारा मैन्युअल रूप से परिभाषित किया जाता है। (ज)चोटियों को एकीकृत और सभी चोटियों के% के रूप में गणना की जाती है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

यहां हम पौधे के अर्क में पीपी-इन्सेस सहित आईएनपी की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक बहुमुखी और संवेदनशील विधि प्रस्तुत करते हैं और इस विधि को स्थापित करने के तरीके पर व्यावहारिक सुझाव प्रदान करते हैं। भले ही प्रोटोकॉल आम तौर पर मजबूत होता है, लेकिन सबऑप्टिमल रन और विश्लेषण हो सकते हैं। ज्यादातर मामलों में, उन रनों की पहचान एक मजबूत कमी या अत्यधिक फॉस्फोरलेटेड आईएनएसपी, विशेष रूप से पीपी-आईएनपी प्रजाति आईएसएसपी7 और आईएनएसपी8के पूर्ण नुकसान से की जा सकती है। संभावित कारण पौधे की सामग्री के माइक्रोबियल संदूषण और पौधे सामग्री के अपर्याप्त पीसने और विगलन के कारण निष्कर्षण के दौरान अंतर्जात संयंत्र पीपी-इन्स्प हाइड्रोलाइज के अपर्याप्त निष्क्रियता हो सकते हैं जो निष्कर्षण बफर के तत्काल संपर्क में नहीं होंगे। इसके अलावा कारणों में बेअसर बफर, या बस अपर्याप्त नमूना सामग्री के अपर्याप्त या अतिरिक्त अतिरिक्त इसके अलावा द्वारा गलत पीएच समायोजन शामिल हैं। उत्तरार्द्ध पीपी-इन्स्प्स का पता लगाना मुश्किल बना सकता है, क्योंकि वे अक्सर कोशिकाओं में बहुत कम मात्रा में मौजूद होते हैं। चरण 3.5 के दौरान नमूना सामग्री या अक्षम सुखाने की अधिकता परक्लोरिक एसिड को कमजोर करने का कारण बन सकती है, इसलिए अपर्याप्त एंजाइम निष्क्रियता और आईएनएसपी6 और पीपी-आईएनएसपी का एक विशिष्ट नुकसान भी हो सकता है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली पौधे की सामग्री की मात्रा के साथ-साथ रेडियोलेबल को लागत और प्रदर्शन के आधार पर अनुकूलित किया गया था, और इसलिए यह सबसे कम राशि के करीब है जो अभी भी इष्टतम परिणाम प्रदान करने के लिए पर्याप्त है। इसके अलावा कॉलम राल धीरे-धीरे अपनी रिजॉल्यूशन कैपेसिटी को ढीला कर देगा। इस प्रक्रिया का पहला संकेत है (लेखकों के लिए पूरी तरह से स्पष्ट नहीं कारणों के लिए) एचपीएलसी स्पेक्ट्रम में पीपी-इन्स्प्स जैसी उच्च फॉस्फोरीलेटेड आईएनएसपी प्रजातियों का एक विशिष्ट नुकसान है। आगे की उम्र बढ़ने के साथ, यहां तक कि InsP6 को कॉलम(चित्रा 1D)द्वारा ठीक से हल नहीं किया जाएगा। इसलिए, सटीक परिणाम सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त कॉलम का उपयोग, साथ ही नमूने की सावधानीपूर्वक हैंडलिंग और एचपीएलसी घटकों का उचित रखरखाव महत्वपूर्ण है।

नमूनों और रन की तुलना करते समय, खासकर जब विभिन्न उपकरणों (जैसे, एचपीएलसी सिस्टम और कॉलम) या विभिन्न दिनों में उत्पन्न होता है, तो नमूनों को एक दूसरे को सामान्य करना महत्वपूर्ण है (जैसा कि चरण 7.3 में वर्णित है) और उसी तरह उनका विश्लेषण करना। केवल सामान्यीकरण के माध्यम से एक ही ग्राफ(चित्र 3)में कई नमूनों को दिखाना संभव और सटीक है। कुल InsPs, या किसी अन्य विशिष्ट आईएसएसपी प्रजातियों के सापेक्ष व्यक्तिगत आईएनएसपी के परिमाणीकरण के लिए, जब तक केवल सापेक्ष मूल्यों और पूर्ण मूल्यों को नहीं दिखाया जाता है, तब तक सामान्यीकरण करना आवश्यक नहीं है। आदर्श रूप से, InsP प्रोफाइल और मात्रा दोनों दिखाए जाते हैं। हालांकि, कुछ मामलों में एक ही ग्राफ में पर्याप्त रूप से दो या अधिक रन दिखाना संभव नहीं है। विभिन्न प्रतिधारण समय या पृष्ठभूमि गतिविधि के विभिन्न स्तरों से अकेले अकांक्षित सैक्स-एचपीएलसी प्रोफाइल की तुलना करना मुश्किल हो सकता है। यही सच है जब कई नमूनों की तुलना करने की जरूरत है । ऐसे मामलों में, व्यक्तिगत चोटी क्वांटिफिकेशन के लिए एक अतिरिक्त सॉफ्टवेयर (जैसे, मूल) का उपयोग करके एक और मूल्यांकन आवश्यक है।

लेखकों को पता है कि यहां वर्णित प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया जा सकता है और प्रत्येक व्यक्तिगत शोध प्रश्न के अनुकूल होने की आवश्यकता है। हालांकि इस प्रोटोकॉल में अरबीडोप्सिस अर्क,7,17 के लिए अनुकूलित किया जा रहा है, यह विधि बहुमुखी है और अन्य पौधों की प्रजातियों के InsP प्रोफाइल का निर्धारण करने में भी मदद कर सकती है। यहां हम एल जैपोनिकसके लिए पहली बार आईएनएसपी प्रोफाइल पेश करके इस संभावना का उदाहरण देते हैं, जिसके लिए लेबलिंग शर्तों, आईएनएसपी निष्कर्षण या सैक्स-एचपीएलसी रन(चित्रा 2)में कोई संशोधन की आवश्यकता नहीं थी। विशेष रूप से, जबकि कुल मिलाकर समान, एल जैपोनिकस और अरबीडोप्सिस आईएनएसपी प्रोफाइल के बीच मतभेद देखे जाते हैं। उदाहरण के लिए, एल में जैपोनिकस आईएनएसपी5 [4-ओह] या इसके एंटिओमेरिक फॉर्म आईएनपी5 [6-ओह] आईएनपी5 [1-ओह] या इसके एंटियोमेरिक फॉर्म आईएनएसपी की तुलना में अधिक प्रचुर मात्रा में हैं5 [3-ओह] अरबीडोप्सिसकी तुलना में, जहां InsP5 [1-OH] या इसके enantiomeric रूप InsP5 [3-ओह] प्रमुख InsP5 प्रजातियां हैं । इसी तरह, हम आशा करते हैं कि मीडिया संरचना में परिवर्तन,[3एच]-मायो-इनोसिटोल एकाग्रता, पौधों की आयु, पर्यावरणीय स्थितियों (जैसे, प्रकाश और तापमान), रासायनिक यौगिकों या अन्य कारकों के बीच पौधे-माइक्रोबियल इंटरैक्शन के विश्लेषण के अलावा, परीक्षण और अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है।myo

इस विधि की एक महत्वपूर्ण खामी जिस पर विचार करने की आवश्यकता है वह यह है कि लेबलिंग एक (बाँझ) तरल संस्कृति में की जाती है, जो अधिकांश भूमि पौधों के लिए शारीरिक वातावरण का प्रतिनिधित्व नहीं करती है। इसके अलावा, मायो-इनोसिटोल कीmyoउच्च लागत के कारण, लेबलिंग समाधान की मात्रा और संस्कृति पोत का आकार आम तौर पर सीमित होता है, जो उपयोग किए जा सकने वाले पौधों के आकार को भी प्रतिबंधित करता है। तरल संस्कृति में खेती से सीधे तौर पर घुसपैठ करके बचा जा सकता है उदाहरण के लिए मिट्टी में उगाए गए पौधों की पत्तियों के साथ [1H]-myo-inositol और बाद में यहां वर्णित प्रोटोकॉल का पालन, जैसा कि पहले10रिपोर्ट किया गया था ।myo

वैकल्पिक तरीकों की तुलना में इस प्रोटोकॉल की कई कमियां हैं, जैसे कि टीओ2 पुल-डाउन पेज या मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित तकनीकों के बाद। [3एच]-मायो-इनोसिटोल लेबलिंग के कारण, केवल आईएनपी प्रजातियां जो सीधे रेडियोलेबेल्ड मायो-इनोसिटोलसे निकलती हैं, अंत में पता लगाया जाएगा।myo यहां वर्णित विधि अन्य आईएनएस आइसोमर्स जैसे स्काइलो-इनोसिटोल और अन्य आइसोमर्स के लिए अंधी है जिनमें से कुछ की पहचान कुछ पौधों में की गई है44. इसके अलावा, अन्य रास्तों से प्राप्त मायो-इन्सेप्स को बाहर रखा जाएगा, जिनमें मायो-इनोसिटोल myoऔर मायो-इनोसिटोल-3-फॉस्फेटके आइसोलेट के माध्यम से ग्लूकोज-6-फॉस्फेट के डी नोवो संश्लेषण द्वारा संश्लेषित किए गए, जो मायो-इनोसिटॉल-3-फॉस्फेटसिंथास (एमआईपीएस) प्रोटीन45 द्वाराउत्प्रेमित होंगे। यद्यपि[32पी] या[33पी]-ऑर्थो-फॉस्फेटका उपयोग वैकल्पिक लेबल के रूप में किया जा सकता है, उनका उपयोग एक बड़ा नुकसान बन गया है, क्योंकि प्रचुर मात्रा में न्यूक्लियोटिड्स और इसके डेरिवेटिव सहित हर फॉस्फेट युक्त अणु को लेबल किया जाएगा। उन अणुओं को इस प्रोटोकॉल के साथ भी निकाला जा सकता है और एसएक्स कॉलम से बांध दिया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप उच्च स्तर की पृष्ठभूमि गतिविधि होगी जो व्यक्तिगत आईएनएसपी चोटियों की पहचान में हस्तक्षेप करेगी5। इसके अलावा,[32पी]- या[33पी] लेबल वाले आईएनपी और पीपी-आईएनपीएस की मात्रा फॉस्फेट और पायरोफॉस्फेट मोइटी टर्नओवर से दृढ़ता से प्रभावित हो सकती है और इनोसिटोल प्रजातियों के लिए बड़े पैमाने पर रीडआउट की रिपोर्ट नहीं कर सकती है।

दूसरी ओर,[3एच]-मायो-इनोसिटोल विशेष रूप से मायो-इनोसिटोलयुक्त अणुओं को लेबल करता है।myo इस मामले में इंसिप्स, इनोसिटोल युक्त लिपिड, जैसे फॉस्फोरिनोसिटाइड्स, और गैलेक्टिनोल इस मामले में लेबल किए गए हैं। हालांकि, इस प्रोटोकॉल के साथ केवल InsPs का विश्लेषण किया जाएगा, क्योंकि लिपिड निष्कर्षण बफर में अघुलनशील हैं और गैलेक्टिनॉल एसएक्स कॉलम से नहीं बांधता है।

अब तक,टीओ2 पुलडाउन/पेज द्वारा निर्धारित एक की तुलना में मायो-इनोसिटोल लेबलिंग द्वारा उत्पन्न संयंत्र InsP प्रोफ़ाइल से अंतर अज्ञात रहता है, क्योंकि पौधों में ऐसी तुलना नहीं की गई है ।myo पशु कोशिकाओं में हाल ही मेंकिएगए एक अध्ययन में इस प्रश्न का समाधान किया गया था . उस काम में, आईएनएसपी6 का एक पूल जो[3एच]-मायो-इनोसिटोल लेबलिंग द्वारा अदृश्य है, जिसे सीधे ग्लूकोज-6-फॉस्फेट से प्राप्त किया जाना चाहिए, की पहचान स्तनधारी सेल लाइनों के पेज जैल के साथ सैक्स-एचपीएलसी प्रोफाइल की तुलना करके की गई थी ।myo फास्फेट भुखमरी के 24 एच के परिणामस्वरूप आईएनएसपी6 की 150% वृद्धि हुई जब टीओ2 पुलडाउन का उपयोग करके शुद्ध इन्स्प्स के पेज जैल की मात्रा निर्धारित की गई। सक्सेना-एचपीएलसी[3एच]-मायो-इनोसिटोल-लेबल कोशिकाओं का विश्लेषण, जिन्हें समान रूप से माना जाता था, केवल [3 एच]-आईएनएसपीmyo6के15%की वृद्धि दिखाई । जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, आईएनएसपी5 से कम InsPs ज्यादातर मामलों में पेज विश्लेषण के साथ अज्ञेय हैं। सैक्स-एचपीएलसी द्वारा अपनाई जाने वाली रेडियोलाबेलिंग पसंद की विधि प्रतीत होती है, जब तक कि अत्यधिक नकारात्मक आवेशित अणुओं के इस समूह का पता लगाने के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्रिक प्रोटोकॉल अनुकूलित नहीं होते हैं।

एक अन्य शेष चुनौती सैक्स-एचपीएलसी विश्लेषण (या आईएनएसपी विश्लेषण के लिए किसी अन्य विधि में)10, 17,17में एंटिसोमर्स को अलग करना है। इस चुनौती से चिरल चयनकर्ताओं के अलावा, यानी एल-आर्जिनिन अमीड जैसे एनेंटीोप्योर यौगिकों से निपटा जा सकता है जो संबंधित एनेंटियोमेरिक अणुओं के साथ बातचीत करते हैं ताकि डायस्टेरियोमिक कॉम्प्लेक्स बनाए जा सकें जिन्हें10अलग किया जा सकता है । हमारी जानकारी के लिए, इस दृष्टिकोण को केवल एनेंटियोमेरिक आईएनपी5 आइसोमर्स5 [1-ओह] और आईएनएसपी5 [3-ओह] को एनएमआर द्वारा10विश्लेषण करने के लिए लागू किया गया है । अन्य एन्टियोमेरिक जोड़े के भेदभाव या चिरल सैक्स-एचपीएलसी विश्लेषण या चिरल पेज आधारित तरीकों द्वारा एंटिसोमर्स के सफल भेदभाव की अभी तक रिपोर्ट नहीं की गई है और इसे और विकसित किया जाना चाहिए । फॉस्फोरस उपलब्धता द्वारा पीपी-इनएसपी के संरक्षित संश्लेषण और संरक्षित नियमन को ध्यान में रखते हुए, हम कल्पना करते हैं कि विशेष रूप से गैर-रेडियोधर्मी तरीके जैसे पृष्ठ या एमएस-आधारित तरीके, पोषक तत्वों के विश्लेषण के साथ, फसलों में पोषक तत्वों की कमी का निदान करने के लिए डिज़ाइन किए गए रिमोट सेंसिंग डेटा को जांचने के लिए जमीनी सत्य प्रयासों में मदद करेंगे17,18,24,,25।,, हालांकि, यहां प्रस्तुत विधि वर्तमान में अभी भी InsP विश्लेषण के लिए सोने के मानक पर विचार किया जा सकता है और पौधों में इन पेचीदा दूतों के नए कार्यों की खोज करने के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई जाएगी ।

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

इस काम को जर्मनी की उत्कृष्टता रणनीति के तहत ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन) द्वारा वित्त पोषित किया गया था-EXC-२०७०-३९०७३२३२४ (फेनोरोब), अनुसंधान प्रशिक्षण समूह GRK2064 और व्यक्तिगत अनुसंधान अनुदान SCHA1274/4-1 और SCHA1274/5-1 G.S.S. हम तकनीकी सहायता के लिए ली श्ल्टर और ब्रिजित यूबरबाख को भी धन्यवाद देते हैं ।

Materials

Centrifuge Eppendorf AG model: 5430 R
Diammonium hydrogen phosphate, ≥97 % Carl Roth GmbH + Co. KG 0268.1
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate, ≥99 %, p.a., ACS Carl Roth GmbH + Co. KG 8043.2
Falcon 12-well clear flat bottom TC-treated multiwell cell culture plate, with lid, individually wrapped, sterile Corning Inc. 353043
Fraction collector LAMBDA Instruments GmbH model: OMNICOLL single channel collector
Growth incubator poly klima GmbH model: PK 520-LED
HPLC pumps Kontron Instruments model: 420
HPLC syringe for Rheodyne valves, 1 mL Hamilton Company 81365
Injector for HPLC Supelco model: Rheodyne 9725
Inositol, myo-[1,2-3H(N)] American Radiolabeled Chemicals Inc. ART 0261
Liquid nitrogen University, Chemistry Department
Liquid scintillation counter PerkinElmer Inc model: TRI-CARB 2900TR
Micro pestle Carl Roth GmbH + Co. KG CXH7.1
Mixed cellulose Eester filter, ME range (ME 24), plain, 0.2 µm pore size, 47 mm circle GE Healthcare Life Sciences 10401770
Mixer for HPLC Kontron Instruments model: M 800
Murashige & Skoog medium, salt mixture Duchefa Biochemie M0221
OriginPro software OriginLab Corp.
Orthophosphoric acid, ≥85 %, p.a., ISO Carl Roth GmbH + Co. KG 6366.1
Partisphere 5 µm SAX cartridge column, 125 x 4.6 mm Hichrom Limited 4621-0505
Perchloric acid, 70 %, 99.999 % trace metals basis Sigma-Aldrich 311421
Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile Greiner Bio One International GmbH 688161
pH-indicator paper pH 5.5 – 9.0, Neutralit Merck KGaA 109564
Phytagel Sigma-Aldrich P8169
Potassium carbonate Carl Roth GmbH + Co. KG P743.2
Safe-Lock tubes, 1.5 mL Eppendorf AG 30120086
Sample loop for 9725 injectors, volume 2 mL, PEEK Supelco 57648
SNAPTWIST scintillation vial, 6.5 mL Simport Scientific Inc. S207-5
Sterile bench LaboGene model: ScanLaf MARS 900
Sucrose, ≥99,5 %, p.a. Carl Roth GmbH + Co. KG 4621.1
Ultima-Flo AP liquid scintillation cocktail PerkinElmer Inc 6013599
Ultra-pure deionized water Milli-Q
Wrenchless WVS End Fitting Kit Hichrom Limited 4631-1001
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Berridge, M. J., Irvine, R. F. Inositol Phosphates and Cell Signaling. Nature. 341 (6239), 197-205 (1989).
  2. Streb, H., Irvine, R. F., Berridge, M. J., Schulz, I. Release of Ca-2+ from a Nonmitochondrial Intracellular Store in Pancreatic Acinar-Cells by Inositol-1,4,5-Trisphosphate. Nature. 306 (5938), 67-69 (1983).
  3. Krinke, O., Novotna, Z., Valentova, O., Martinec, J. Inositol trisphosphate receptor in higher plants: is it real. Journal of Experimental Botany. 58 (3), 361-376 (2007).
  4. Kuo, H. F., et al. Arabidopsis inositol pentakisphosphate 2-kinase, AtIPK1, is required for growth and modulates phosphate homeostasis at the transcriptional level. Plant Journal. 80 (3), 503-515 (2014).
  5. Kuo, H. F., et al. Arabidopsis inositol phosphate kinases IPK1 and ITPK1 constitute a metabolic pathway in maintaining phosphate homeostasis. Plant Journal. 95 (4), 613-630 (2018).
  6. Gillaspy, G. E., Capelluto, D. G. S. . Lipid-mediated Protein Signaling. , 141-157 (2013).
  7. Stevenson-Paulik, J., Bastidas, R. J., Chiou, S. T., Frye, R. A., York, J. D. Generation of phytate-free seeds in Arabidopsis through disruption of inositol polyphosphate kinases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (35), 12612-12617 (2005).
  8. Lemtiri-Chlieh, F., MacRobbie, E. A. C., Brearley, C. A. Inositol hexakisphosphate is a physiological signal regulating the K+-inward rectifying conductance in guard cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8687-8692 (2000).
  9. Lee, H. S., et al. InsP6-sensitive variants of the Gle1 mRNA export factor rescue growth and fertility defects of the ipk1 low-phytic-acid mutation in Arabidopsis. Plant Cell. 27 (2), 417-431 (2015).
  10. Blüher, D., et al. A 1-phytase type III effector interferes with plant hormone signaling. Nature Communications. 8, (2017).
  11. Murphy, A. M., Otto, B., Brearley, C. A., Carr, J. P., Hanke, D. E. A role for inositol hexakisphosphate in the maintenance of basal resistance to plant pathogens. Plant Journal. 56 (4), 638-652 (2008).
  12. Poon, J. S. Y., Le Fevre, R. E., Carr, J. P., Hanke, D. E., Murphy, A. M. Inositol hexakisphosphate biosynthesis underpins PAMP-triggered immunity to Pseudomonas syringae pv. tomato in Arabidopsis thaliana but is dispensable for establishment of systemic acquired resistance. Molecular Plant Pathology. 21 (3), 376-387 (2020).
  13. Wild, R., et al. Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains. Science. 352 (6288), 986-990 (2016).
  14. Shears, S. B. Inositol pyrophosphates: Why so many phosphates. Advances in Biological Regulation. 57, 203-216 (2015).
  15. Shears, S. B. Intimate connections: Inositol pyrophosphates at the interface of metabolic regulation and cell signaling. Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1897-1912 (2018).
  16. Desai, M., et al. Two inositol hexakisphosphate kinases drive inositol pyrophosphate synthesis in plants. Plant Journal. 80 (4), 642-653 (2014).
  17. Laha, D., et al. VIH2 Regulates the Synthesis of Inositol Pyrophosphate InsP8 and Jasmonate-Dependent Defenses in Arabidopsis. Plant Cell. 27 (4), 1082-1097 (2015).
  18. Laha, D., et al. Arabidopsis ITPK1 and ITPK2 Have an Evolutionarily Conserved Phytic Acid Kinase Activity. Acs Chemical Biology. 14 (10), 2127-2133 (2019).
  19. Dorsch, J. A., et al. Seed phosphorus and inositol phosphate phenotype of barley low phytic acid genotypes. Phytochemistry. 62 (5), 691-706 (2003).
  20. Flores, S., Smart, C. C. Abscisic acid-induced changes in inositol metabolism in Spirodela polyrrhiza. Planta. 211 (6), 823-832 (2000).
  21. Brearley, C. A., Hanke, D. E. Inositol phosphates in barley (Hordeum vulgare L) aleurone tissue are stereochemically similar to the products of breakdown of InsP(6) in vitro by wheat-bran phytase. Biochemical Journal. 318, 279-286 (1996).
  22. Laha, N. P., et al. ITPK1-Dependent Inositol Polyphosphates Regulate Auxin Responses in Arabidopsis thaliana. bioRxiv. , (2020).
  23. Laha, D., et al. Inositol Polyphosphate Binding Specificity of the Jasmonate Receptor Complex. Plant Physiology. 171 (4), 2364-2370 (2016).
  24. Dong, J. S., et al. Inositol Pyrophosphate InsP(8) Acts as an Intracellular Phosphate Signal in Arabidopsis. Molecular Plant. 12 (11), 1463-1473 (2019).
  25. Zhu, J., et al. Two bifunctional inositol pyrophosphate kinases/phosphatases control plant phosphate homeostasis. Elife. 8, (2019).
  26. Couso, I., et al. Synergism between Inositol Polyphosphates and TOR Kinase Signaling in Nutrient Sensing, Growth Control, and Lipid Metabolism in Chlamydomonas. Plant Cell. 28 (9), 2026-2042 (2016).
  27. Ito, M., et al. Hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the quantitative analysis of mammalian-derived inositol poly/pyrophosphates. Journal of Chromatography A. 1573, 87-97 (2018).
  28. Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Inositol Phosphates Purification Using Titanium Dioxide Beads. Bio-Protocol. 8 (15), (2018).
  29. Loss, O., Azevedo, C., Szijgyarto, Z., Bosch, D., Saiardi, A. Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates. Jove-Journal of Visualized Experiments. (55), e3027 (2011).
  30. Harmel, R. K., et al. Harnessing C-13-labeled myo-inositol to interrogate inositol phosphate messengers by NMR Electronic supplementary information (ESI) available. Chemical Science. 10 (20), 5267-5274 (2019).
  31. Azevedo, C., Saiardi, A. Extraction and analysis of soluble inositol polyphosphates from yeast. Nature Protocols. 1 (5), 2416-2422 (2006).
  32. Shears, S. B., Miller, G. J. . Inositol Phosphates: Methods and Protocols. , 1-28 (2020).
  33. Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Importance of Radioactive Labelling to Elucidate Inositol Polyphosphate Signalling. Topics in Current Chemistry. 375 (1), (2017).
  34. Stevenson-Paulik, J., et al. Inositol phosphate metabolomics: Merging genetic perturbation with modernized radiolabeling methods. Methods. 39 (2), 112-121 (2006).
  35. Liu, C., Riley, A. M., Yang, X., Shears, S. B., Potter, B. V. L. Synthesis and Biological Activity of d- and l-chiro-Inositol 2,3,4,5-Tetrakisphosphate: Design of a Novel and Potent Inhibitor of Ins(3,4,5,6)P4 1-Kinase/Ins(1,3,4)P3 5/6-Kinase. Journal of Medicinal Chemistry. 44 (18), 2984-2989 (2001).
  36. Hughes, P. J., Hughes, A. R., Putney, J. W., Shears, S. B. The regulation of the phosphorylation of inositol 1,3,4-trisphosphate in cell-free preparations and its relevance to the formation of inositol 1,3,4,6-tetrakisphosphate in agonist-stimulated rat parotid acinar cells. Journal of Biological Chemistry. 264 (33), 19871-19878 (1989).
  37. Shears, S. B., Kirk, C. J., Michell, R. H. The pathway of myo-inositol 1,3,4-trisphosphate dephosphorylation in liver. The Biochemical journal. 248 (3), 977-980 (1987).
  38. Stevenson-Paulik, J., Odom, A. R., York, J. D. Molecular and Biochemical Characterization of Two Plant Inositol Polyphosphate 6-/3-/5-Kinases. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42711-42718 (2002).
  39. Stephens, L. R., Hawkins, P. T., Downes, C. P. An analysis of myo-[3H]inositol trisphosphates found in myo-[3H]inositol prelabelled avian erythrocytes. The Biochemical journal. 262 (3), 727-737 (1989).
  40. Saiardi, A., et al. Mammalian inositol polyphosphate multikinase synthesizes inositol 1,4,5-trisphosphate and an inositol pyrophosphate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (5), 2306 (2001).
  41. Azevedo, C., Burton, A., Bennett, M., Onnebo, S. M. N., Saiardi, A., Barker, C. J. . Inositol Phosphates and Lipids: Methods and Protocols. , 73-85 (2010).
  42. Saiardi, A., Caffrey, J. J., Snyder, S. H., Shears, S. B. The Inositol Hexakisphosphate Kinase Family: CATALYTIC FLEXIBILITY AND FUNCTION IN YEAST VACUOLE BIOGENESIS. Journal of Biological Chemistry. 275 (32), 24686-24692 (2000).
  43. Brearley, C. A., Hanke, D. E. Inositol phosphates in the duckweed Spirodela polyrhiza L. Biochemical Journal. 314, 215-225 (1996).
  44. Pollard, J. K., Steward, F. C., Shantz, E. M. Hexitols in Coconut Milk – Their Role in Nurture of Dividing Cells. Plant Physiology. 36 (4), 492 (1961).
  45. Donahue, J. L., et al. The Arabidopsis thaliana Myo-inositol 1-phosphate synthase1 gene is required for Myo-inositol synthesis and suppression of cell death. Plant Cell. 22 (3), 888-903 (2010).
  46. Desfougeres, Y., Wilson, M. S. C., Laha, D., Miller, G. J., Saiardi, A. ITPK1 mediates the lipid-independent synthesis of inositol phosphates controlled by metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (49), 24551-24561 (2019).

Tags

Inositol PolyphosphatesRadiolabelingSAX-HPLCPlant MetabolismPlant DevelopmentExtractionQuantificationLotus SeedsMyo-inositolSample PreparationHPLC Setup

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Gaugler, P., Gaugler, V., Kamleitner, M., Schaaf, G. Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC. J. Vis. Exp. (160), e61495, doi:10.3791/61495 (2020).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image