Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties (<em>Lactuca sativa</em> L.) and Crop Wild Relatives (<em>Lactuca</em> spp.)

In&#233;s Medina-Lozano; Juan  Ram&#243;n Bertol&#237;n; Raquel Zufiaurre; Aurora D&#237;az

doi:10.3791/61440

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Bioquímica

Marul Çeşitleri C Vitamini Quantification için Geliştirilmiş UPLC-UV Yöntemi(Lactuca sativa L.) ve Crop Wild Relatives(Lactuca spp.)

Published: June 30, 2020

doi:

10.3791/61440

Inés Medina-Lozano*^1,4, Juan Ramón Bertolín*^2,4, Raquel Zufiaurre³, Aurora Díaz^1,4

¹Unidad de Hortofruticultura,Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), ²Unidad de Producción y Sanidad Animal,Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), ³Dpto Química Analítica,Escuela Politécnica Superior (Universidad de Zaragoza), ⁴Instituto Agroalimentario de Aragón – IA2 (CITA-Universidad de Zaragoza)

Summary

Biz Lactuca spp C vitamini ölçmek için hızlı ve güvenilir bir yöntem salıyoruz. Önemli adımlar, kararlı koşullar altında numune hazırlama ve C vitamini ekstraksiyonu, dehidroaskorbik asitin askorbik aside indirgenmesi ve kromatografik prosedürün optimizasyonudur.

Abstract

Vitaminler, özellikle C vitamini, meyve ve sebzelerde bulunan önemli mikro besinlerdir. C vitamini de antioksidan kapasitesine önemli bir katkıda bulunmaktadır. Marul dünya çapında tüketiciler arasında en popüler sebze biridir. Marul ve diğer ilgili türlerde C vitamini içeriğini ölçmek için doğru bir protokol çok önemlidir. Burada numune hazırlama, vitamin ekstraksiyonu ve kromatografi koşullarının optimize edildiği ultra-yüksek performanslı sıvı kromatografi-ultraviyole (UPLC-UV) tekniğini kullanarak bir yöntem tanımladık.

Numuneler tüm bitkiyi temsil etmek için toplanmış, -80 °C’de dondurulmuş ve istenmeyen oksidasyonu önlemek ve manipülasyonlarını kolaylaştırmak için lyophilized. C vitamini ekstraksiyonu asidik ortamda gerçekleştirildi ve bu da stabilitesine katkıda bulundu. C vitamini iki farklı dönüştürülebilir formlarda mevcut olabilir gibi, askorbik asit (AA) ve dehidroaskorbik asit (DHAA), her iki bileşikler doğru niceleme için ölçülmelidir. AA spektrumun UV aralığında DHAA daha yüksek bir absorptivity gösterir çünkü DHAA AA için azaltılmasından sonra dolaylı olarak sayısallaştırılmıştır. Aynı ekstreden, biri bu azaltma reaksiyonundan önce ve biri sonra olmak üzere iki ölçüm yapılmıştır. İlk durumda, AA içeriğini ölçtük, ikincisinde ise AA ve DHAA (TAA: total askorbik asit) toplamını AA şeklinde ölçtük. Daha sonra, DHAA miktarı dolaylı olarak TAA’dan gelen ilk ölçümden gelen AA çıkarılarak elde edilebilmektedir. Onlar UPLC-UV tarafından, bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak ve kromatografik prosedürü optimize etmek için ticari bir AA standardı kullanarak, tamamen kısa sürede çözüldü AA zirveleri elde etmek için tespit edildi. Bu protokol kolayca hafif veya hiç değişiklik ile diğer bitki malzemeye ekstrapolated olabilir. Doğruluğu istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar aksi algılanmayan ortaya koymuştur. Diğer güçlü yönleri ve sınırlamaları daha derinlemesine makale ele alınmıştır.

Introduction

Ekili marul(Lactuca sativa L.) 2018 yılında yaklaşık 27,3 milyon ton toplam üretimi ile dünyaçapında en çok üretilen ve tüketilen yapraklı sebzelerden biridir. Marul tüketiciler tarafından sağlıklı olarak algılanır. Besin özellikleri esas olarak polifenoller ve E^{vitamini 2}gibi diğerleri arasında, C vitamini gibi ürün, antioksidan bileşiklerin kaynağıatfedilir. C vitamini diğer birçok omurgalı aksine insanlar için gerekli bir mikro besindir, biz biyosentetik^yol3 son adım enzim için gen kodlama mevcut mutasyonlar nedeniyle üretmek mümkün değildir. Bu normal bir hücre metabolizması için gereklidir ve aynı zamanda antioksidan aktivitesi^nedeniyleesas olarak bağışıklık yanıtlarında önemli bir rol oynar 3^,⁴.

Toplam C vitamini askorbik asit oluşur (AA) ve dehidroaskorbik asit (DHAA). AA vitaminin en biyolojik olarak aktif formudur, ama DHAA (oksidasyon ürünü) da biyolojik aktivite gösterir ve kolayca insan vücudunda AA dönüştürülebilir⁵. Bu nedenle, her iki formları nicel herhangi bir bahçecilik ürün toplam C vitamini içeriğini belirlemek için önemlidir, marul dahil.

Enzimatik, spektrofotometrik ve titrimetrik^yöntemler^6,⁷^,⁸gibi sebzelerde C vitamini ölçmek için farklı analitik tekniklere dayalı yaklaşımlar geniş bir yelpazede kullanılmıştır. Bu yöntemler basit olmasına rağmen, kimyasal Olarak AA⁹için özel değildir. Sonuç olarak, kromatografik yöntemler tercih edilir, özellikle yüksek performanslı sıvı kromatografi-ultraviyole (HPLC-UV) tekniği, yüksek doğruluk nedeniyle¹⁰. HPLC-UV brokoli, ıspanak ve marul^11,^12,¹³gibi bitkilerin büyük bir çeşitlilik, C vitamini belirlemek için kullanılmıştır. Ancak, AA ve DHAA eşzamanlı nicel lik spektrumUN UV aralığında DHAA düşük absorptivity nedeniyle karmaşıktır. Alternatif olarak, DHAA dolaylı olarak DHAA’yı AA’ya dönüştüren bir azaltıcı ajan kullanılarak, toplam askorbik asit (TAA) ölçümü ve sonra TAA ile AA arasındaki farkın hesaplanması ile belirlenebilir. Bir azalma reaksiyonu gerekliliği nedeniyle, Bazı çalışmalarda, sadece AA sayısal olmuştur¹⁴, aslında C vitamini aktivitesinin bir küçümseme temsil edebilir. Sıvı kromatografi tekniklerinde son ilerleme, ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi (UPLC) kullanıldığında bile dolaylı olarak DHAA’yı belirlemek için bu ek azaltma reaksiyonu da gereklidir. Bu adım aynı zamanda UPLC’nin HPLC ile karşılaştırıldığında sergilediği avantajlardan da yararlanır: daha yüksek verimlilik ve çözünürlük, artan hassasiyet, daha kısa zaman analizi ve daha düşük solvent tüketimi^15. Sonuç olarak, UPLC-UV tekniği farklı bitkileri C vitamini ölçmek için kullanılmıştır^16.

Buna ek olarak, AA çok labile moleküldür; bu nedenle, marul depolama ve C vitamini^analizi9 sırasında bozulmasını önleyen bir protokol geliştirmek önemlidir. Bu bağlamda, aşağıdaki protokol UPLC-UV ile marul C vitamini içeriğinin hızlı ve geliştirilmiş bir nicelik, hem de verimli bir ekstraksiyon prosedürü sunuyor. Sadece elit çeşitleri mevcut çalışmada yer almış, ama aynı zamanda geleneksel landraces ve bazı yabani akrabaları nedeniyle ürün ıslahı potansiyel ilgi nedeniyle, özellikle marul besin değerinin iyileştirilmesi.

Protocol

1. Bitki malzemesi hazırlama 50 mL polipropilen tüpler, bir dış (eski) ve bir iç (genç) bir daha doğru tüm bitki temsil etmek için bitki başına en az iki yaprak örnekleyin. Her örnek için en az üç biyolojik kopya toplayın. Sıvı nitrojen kullanarak hemen dondurun ve kullanıma kadar -80 °C’de saklayın. Sıvı nitrojen tüpler içine almaz emin olun; aksi takdirde buharlaşma sırasında gaz genişlemesi nedeniyle çıkarıldığında patlayabilir.DİkKAT: Eldiven ve yüz kalkanı sıvı nitrojen kullanımı ile ilgili potansiyel tehlikeler nedeniyle gereklidir. Tüplerden kapakları çıkarın ve aşağıdaki şekilde programlanmış lyophilizer(Malzeme Tablosu)dondurucu haznesinde tepsilere yerleştirin: -25 °C 72 saat, -10 °C 10 saat, 0 °C 10 saat ve 20 °C en az 4 saat. Donma-kurutma işlemi sırasında kondansatör sıcaklığını ve vakum sabitini sırasıyla -80,2 °C ve 112 mTorr’da koruyun. Malzeme tamamen kuruduğunda (bitkiye ve tüpe sıkıştırma derecesine bağlı olarak 4 ila 7 gün arasında), sırasıyla 4 °C, -20 °C veya -80 °C’de kısa (günler arası), orta (ay) veya uzun (yıl) depolama için saklayın. Örnek içeren tüplere silika jel boncuk içeren torbaların eklenmesi önerilir. Lyophilized örnekleri 10 mm çapında paslanmaz çelik toplar ile birlikte 20 mL polipropilen tüpler içine yerleştirin ve ince bir toz elde etmek için gerekli yoğunluk ve zaman kullanarak bir multitube girdap ile öğütün.NOT: Tüm işlem boyunca, örnekleri doğrudan ışığa maruz kalmaktan koruyun. 2. Reaktif ve çözelti hazırlama Solvent ekstraksiyon çözeltisini hazırlayın: %8 asetik asit (v/v), %1 MPA (meta-fosforik asit) (w/v), 1 mM EDTA (etilendimamintetraasetik asit). Her birine 5 mL eklanacağını göz önünde bulundurarak tüm numune kümesini işlemek için gereken toplam çözücü hacmini hesaplayın. Çözeltinin 1 L’sini hazırlamak için bir şişeye ekleyin: 30 g MPA, 0.372 g EDTA dehidrat, 80 mL asetik asit ve 500 mL ultrasaf su (buna göre ölçek hacimleri ve miktarları). Şişe ağzını plastik filmle kapatın. Bir kez manyetik karıştırıcı yardımıyla çözülmüş, doğru 1 L ölçmek için bir hacimsel şişe kullanın, gerekli ultrasaf su ekleyerek. Redüksiyon reaksiyonu tamponu (0,5 M Tris (2-amino-2-(hidroksemilen)-1,3-propanediol) pH 9.0) ve azaltıcı çözeltiyi (40 mM DTT (1,4-Dithiothreitol) ile 0,5 M Tris pH 9.0) hazırlayın. Her birine 200°L ekeceğini göz önünde bulundurarak tüm numune kümesini işlemek için gereken azaltma çözeltisinin toplam hacmini hesaplayın. Tampon 100 mL hazırlamak için, bir kabı ekleyin: Tris 6.055 g ve ultrasaf su 90 mL (buna göre ölçek hacimleri ve miktarları). Plastik film ile beher ağız mühür. Manyetik karıştırıcı yardımıyla çözüldükten sonra, 2 M HCl ekleyerek çözeltiyi pH 9.0’a ayarlayın ve gerekli ultrasaf suyu ekleyerek 100 mL’yi doğru bir şekilde ölçmek için hacimsel bir şişe kullanın. Azaltma çözeltisinin 100 mL’ini hazırlamak için bir kabı ekleyin: 0,629 g DTT (saflık: ) ve tamponun 90 mL’si (0,5 M Tris pH 9,0) daha önce hazırlanmış (2,2,1 ila 2,2,2). Hacimleri ve miktarları buna göre ölçeklendirin. Plastik film ile beher ağız mühür. Manyetik karıştırıcı yardımıyla çözüldükten sonra, 100 mL’yi doğru bir şekilde ölçmek için hacimsel bir şişe kullanın ve gerekli tampon hacmini 0,5 M Tris pH 9,0 olarak ekledi.NOT: Azaltıcı çözüm çok kararsız. Bu nedenle yeni yapılmış bir çözüm şiddetle tavsiye edilir. Sülfürik asit (0.4 M H2SO4) Her birine 200 μL eklenmiş olacağını göz önünde bulundurarak tüm numune setini işlemek için gereken 0,4 M sülfürik asit hacmini hesaplayın. Çözeltinin 100 mL’sini hazırlamak için bir kabı ekleyin: 80 mL ultrasaf su ve 2,22 mL H2SO4 (saflık: , yoğunluk: 1,84 g mL-1). Gerekli ultrasaf suyu ekleyerek 100 mL’yi doğru bir şekilde ölçmek için hacimsel bir şişe kullanın.DİkKAT: Sülfürik asit çok aşındırıcıdır, bu nedenle koruyucu ekipmanlar kullanılarak ve başlık altında kullanılmalıdır. Buna ek olarak, asit ultrasaf suya eklenmelidir, ve asit su değil, dumanı azaltmak ve kazaları önlemek için. Hidroklorik asit (2 M HCl). 2 M hidroklorik asit 100 mL hazırlamak için, bir kabı ekleyin: 80 mL ultrasaf su ve sonra 6.13 mL HCl (saflık: 37%, yoğunluk: 1.19 g mL-1). Plastik film ile beher ağız mühür. Gerekli ultrasaf suyu ekleyerek 100 mL’yi doğru bir şekilde ölçmek için hacimsel bir şişe kullanın. Hacimleri buna göre ölçeklendirin.DİkKAT: Hidroklorik asit çok aşındırıcıdır, bu nedenle koruyucu ekipman kullanılarak ve başlık altında ele alınmalıdır. Buna ek olarak, asit ultrasaf suya eklenmelidir, ve asit su değil, dumanı azaltmak ve kazaları önlemek için. AA standardı (stok ve seyreltmeler) AA standardının tam 10 mg ağırlığında (saflık: 99%) hassas bir denge kullanarak ve 90 mL mobil faz ekleyin (formik asit ile ultra saf su pH 2.0). Manyetik karıştırıcı yardımıyla çözüldükten sonra, 100 mL’yi doğru bir şekilde ölçmek için hacimsel bir şişe kullanın ve formik asitle gerekli ultrasaf su pH 2.0 hacmini ilave edin.NOT: Bu stok çözeltisini ışığa maruz kalmaktan koruyun. Tablo 1’deki talimatları izleyerek kalibrasyon eğrisi elde etmek için AA standardının stoğundan beş seyreltme hazırlayın ve adım 5.2 ile devam edin. Standart [AA] (μg mL-1) AA (100 μg mL-1) çözeltisi (3L) Mobil faz (3L)a 1 0.5 5 995 2 2.5 25 975 3 5 50 950 4 10 100 900 5 25 250 750 bir Ultrasaf su pH 2.0 formik asit ile asitlendirilir. Tablo 1: Protokol AA (askorbik asit) beş standart hazırlamak için. Standartların farklı konsantrasyonlarının her birini hazırlamak için çözünür ve çözücü hacimleri belirtilir. 3. AA ve DHAA çıkarma NOT: Çıkarma adımları sırasında düşük ışık yoğunluğu koşullarında çalışması tavsiye edilir. 15 mL polipropilen santrifüj tüpüne 50 mg liyofilize zemin numunesi ve 5 mL ekstraksiyon çözücü (adım 2.1) ekleyin. 2000 rpm de 5 s ve daha sonra 10 dakika için bir orbital shaker için bir girdap kullanarak karışımı çalkalayın. Ultrason aktive ile oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bir ultrasonik banyotüp tanıtın. 4 °C’de 10 dk için 4.000 x g santrifüj. Supernatant alın, bir 0.22 μm rejenere selüloz filtre ile geçmek ve 5 mL kehribar şişe de saklayın. Bu, AA ve DHAA içeren Extract 1’dir.NOT: Protokol burada -80 °C’de ekstrelerin dondurulması ve AA ve DHAA’nın ışık varlığında, yüksek sıcaklıklarda veya oksitleyici atmosferlerde kolayca bozulması nedeniyle ışığa maruz kalmalarını koruyarak duraklatılabilir (Ek Dosya 1). 4. TAA ayıklamak için AA DHAA azaltma Sıvı kromatografisi için 200 μL ekstresi 1’den 2 mL’lik kehribar şişeye aktarın ve azaltıcı çözeltinin 200 μL’sini ekleyin (adım 2.2). Şişeyi ptfe-silikon fişi ile önceden açarak kapatın ve 5 s’lik bir girdap la sallayın. Çözeltinin oda sıcaklığında 30 dk bekletin ve ışıktan koruyun. Reaksiyonu durdurmak ve asidik pH’da AA’yı stabilize etmek için 200 μL 0,4 M H2SO4 ekleyin. Ortaya çıkan çözüm Extract 2, sadece AA içerir ve aslında TAA olduğunu. 5. Belirlenmesi UPLC-UV preparat Tablo 2’deaçıklanan çalışma çözümlerini hazırlayın, 0,22 μm filtrelerden uygun şekilde filtreedin, en az 10 dakika sonicated ve UPLC sistemine yerleştirin. Üç UPLC modülünü açın ve dahili kalibrasyon işleminin tamamlanmasını bekleyin. Yazılımı açın (örn. Empower 3) ve Tablo 2’deaçıklanan enstrümantal programı yükleyin : Empower 3 | Çalıştırma Örnekleri | C vitamini yöntemi | UPLC_PDA | QuickStart’ı kullanın. Yazılım doğru programla yüklendikten sonra UPLC yönetim konsoluna erişin: Quaternary Solvent Manager | Sağ fare düğmesine tıklayın | Başlat Konsolu. UPLC cihazının hazırlanmasına ve stabilizasyonuna devam edin: Sistem | Kontrol | Başlangıç. En az 5 dakika için tüm UPLC hatları temizleme: Prime Çözücüler | QSM | A, B, C, D ve Seal Wash kontrol edin | Asal süre > 5 dk. Temizleme ve enjektör temiz: Prime Çözücüler | SM | Yıkama çözücü (> 45 s) ve Kontrol Temizleme çözücü (> 35 döngü). UPLC’yi yöntem koşullarına göre dengeleyin: Yönteme denge | QSM | Akış (0,3 mL dk-1) | Çözücü A (%2) | Solvent B (%0) | Solvent C () | Solvent D (%0); Yönteme Denge | SM | Örnek (5 °C) | Kolon (30 °C) ve Yönteme Denge | Diğer | Lambayı Aç | Başlat’a basın. Ekipmanın stabilize edilebis olması için en az 1 saat (daha fazla zaman önerilir) bekleyin. Kararlılık, Başlat Konsolu’ndaki sütundaki basıncı kontrol ederek doğrulanabilir : Sistem | Kuaternerlik Solvent Yöneticisi | QSM Sistem Basıncı. Basınç değişikliklerinde (artar veya azalır) tanımlanabilir eğilimler olmadığından ve delta değerinin 10 psi’den az olduğundan emin olun. QuickStart ekranında, matrisi analiz edilecek standartların ve örneklerin adlarıyla doldurun. Standartlarda AA tayini Daha önce hazırlanmış beş AA standardının her birinin 1 mL’ini (adım 2.5.3) sıvı kromatografisi için 2 mL kehribar şişesine aktarın. Şişeyi ptfe-silikon fişi ile önceden açarak kapatın ve UPLC aletine 5°L enjekte edin. En seyreltilmiş ten en yoğuna kadar Tablo 2’de açıklanan prosedürü takiben kromatografiyi uygulayın. Örneklerde AA tayini Pipet 200 μL Ekstrakt 1 sıvı kromatografi için 2 mL kehribar şişe ve ultrasaf su 800 μL ekleyin. Şişeyi ptfe-silikon fişi ile önceden açarak kapatın ve UPLC aletine 5°L enjekte edin. Tablo 2’deaçıklanan prosedürü izleyerek kromatografiyi gerçekleştirin. Örneklerde TAA tayini Extract 2’ye 400 μL ultra saf su ekleyin. Şişeyi ptfe-silikon fişi ile önceden açarak kapatın ve UPLC aletine 5°L enjekte edin. Tablo 2’deaçıklanan prosedürü izleyerek kromatografiyi gerçekleştirin. Bileşenler ve parametreler Açıklama Enstrüman Beraat UPLC H-Sınıfı Dedektörü AA=245 nm için PDA eλ Dedektörλabs Yazılım Güçlendir in 3 Sütun Beraat UPLC HSS T3 (150 mm x 2,1 mm x 1,8 μm) Kanal A CH3OH Kanal B/Yıkama H2O:CH3OH (50:50 v:v) Kanal C Ultrasaf su pH 2.0 formik asit ile asitlenmişbir Kanal D/Mühür Yıkama Ultrasaf su:asetonitril (90:10 v:v) Mobil faz 0.3 mL min-1 / 2%A + 98%C (isokratik mod) Sütun sıcaklığı 30 °C Otomatik numune alma sıcaklığı 5 °C Enjeksiyon hacmi 5 μL AA bekletme süresi 1.874 dk Çalışma süresi 3 dk bir pH ayarı kadar kullanılan formik asit belirsiz hacmi Tablo 2: Marul ve yabani akrabalardan alınan özlerde AA (askorbik asit) belirlemek için optimize edilmiş kromatografik prosedür. Kullanılan bileşenlerin, koşulların ve çözümlerin tanımı. 6. AA ve DHAA’nın nicelleştirilmesi İstatistiksel analiz Bertolín ve ark.18 tarafından açıklandığı gibi kromatografik yöntemin analitik parametrelerini belirleyin (Tablo 3).NOT: Tablo 3’te sunulan parametrelerin değerlerinin belirli deneysel koşullar altında tanımlanması gerekmektedir. Yöntemin analitik parametreleri Değer Doğrusal aralık (3g mL-1) 0.5-25 Doğrusal denklem y=53,143.03x R2 0.99998 Algılama sınırı (mg AA g-1 kuru madde) 0.013 Kantifikasyon sınırı (mg AA g-1 kuru madde) 0.045 Tekrarlanabilirlik (CV, %)a 1.75 Ara hassasiyet (CV, %)a 4.22 Kurtarma (Rec, %)b 95,6±2,4 bir CV: değişim katsayısı b İyileşme telbettei aynı numunenin 50 mg’ını içeren 10 aliquot, kuru maddeden 2 mg AA g-1 ve 5 çivili olmayan 5 ile yapıldı. %Rec=([AA]çivili örnek-[AA]örnek)/([AA]çivili)x100. Tablo 3: AA (askorbik asit) ve TAA (toplam askorbik asit) saptanması ve ölçülmesi için optimize edilmiş analitik parametreler. Doğrusal aralık, denklem ve kalibrasyon (R2) ) eğrisinin tayin katsayısı ile AA’nın algılama ve niceleme sınırları (TAA için aynıdır) ve 5 μL’lik numune enjeksiyon hacmi ile tekrarlanabilirlik, ara hassasiyet ve geri kazanım elde edilebildi. AA ve TAA konsantrasyonu hesaplayın. Standart ve örnek kromatogramları açın: QuickStart | Projeye Gözat | Kanallar | “standart veya örnek adı” | PDA Ch1 245 nm@1.2 nm. Başlangıç noktasına (yaklaşık 1.790 dk) tıklayarak ve fareyle bitiş noktasına (yaklaşık 1.910 dk) sürükleyerek ilgili tepeyi (AA veya TAA) standartlara ve numunelere entegre edin. Yukarıda hazırlanan beş AA standardının konsantrasyonuna karşı kromatografik olarak belirlenen emici değerleri (adım 5.2.) temsil eden bir kalibrasyon eğrisi oluşturun(Tablo 1). 5.3 ve 5.4 adımlarında belirlenen numunelerin emicideğerlerini enterpolasyona tabi tartırın ve sırasıyla AA ve TAA konsantrasyonu elde etmek için aşağıdaki formülle:y entegre pik alanı olduğu yerde, x ppm ve m ve n’deki AA veya TAA konsantrasyonu sırasıyla elde edilen regresyon hattının eğimi ve y-keseğidir. DHAA konsantrasyonu hesaplamak için aşağıdaki formülü uygulayın:NOT: Kuru ağırlığın mg g-1’inde DHAA, AA ve TAA’nın toplam konsantrasyonlarını elde etmek için, kalibrasyon eğrisinde doğrudan interpolasyon elde edilen değerlerin toplam ekstre hacmi ve uygulanan seyreltme faktörü ile çarpılması ve ekstraksiyonun gerçekleştirilmesinde kullanılan numunenin ağırlığına bölünmesi gerekir.

Representative Results

Lactuca matrislerinde C vitamini niceliği, güvenilir sonuçlar elde eden bir kromatografik yaklaşımın geliştirilmesini gerektirir. Şekil 1A, tanımlanmamış bir minör “omuz” ile birlikte bir AA zirvesi sunan, optimize edilmemiş bir protokolden(Ek Dosya 2)kaynaklanan bir kromatogram gösterir. Bununla birlikte, ekstraksiyon ve kromatografik koşulları iyileştirdikten sonra, bilinmeyen bileşiklerin müdahalesi olmadan çözülmüş bir AA zirvesi elde edilmiştir(Şekil 1B). Buna ek olarak, HPLC-UV yerine UPLC-UV ekipmanlarının kullanımı bize AA için tutma süresini (RT) azaltmak için izin: 1.874 dk optimize kromatogramlar karşı 2.980 dk olmayan optimize edilmiş olanlar(Şekil 1),yanı sıra çalışma süreleri, 3 ve 7 dakika optimize edilmiş ve optimize olmayan protokoller için, sırasıyla. Şekil 1: Aynı marul örneğinde AA’nın kromatogramları (ticari çeşit ‘Begoña’). (A) Optimize edilmeyen bir protokolden kaynaklanan HPLC-UV kromatogramı (Ek Dosya 2’de açıklanan koşullar). (B) UPLC-UV kromatogramı optimize edilmiş protokol ile elde edilir (Tablo 2’deaçıklanan koşullar). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 1A’dagözlenenler gibi AA zirvelerindeki parazitler, kromatografik süreç sırasında yetersiz ayrılma nedeniyle C vitamini (AA, DHAA ve TAA) içeriğinin(Şekil 2)hafife düşmesine neden oldu, çünkü örtüşen tepe alanları aralarındaki en derin noktada dikey bir düşüşle entegre edildi. Bu sapma özellikle DHAA ve TAA içeriğinde (Şekil 2)bitki yabani akrabaları durumunda özellikle fark edilir. Şekil 2: C vitamini içeriğinin dağılımı. Ticari ve geleneksel marul çeşitleri ve bazı yabani akrabaları olmayan optimize edilmiş ve optimize protokolleri kullanarak DHAA, AA ve TAA içeriği (mg g-1 kuru ağırlık) Split keman arsalar. Siyah çizgiler ortalama değerleri gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Ayrıca, optimize edilmeyen bir protokolün kullanımı, benzer bir C vitamini içeriğine sahip tüm numuneleri, her iki marul türünü ve yabani akrabaları gösterdikleri için sonuçlardan yararlı bir sonuç çıkarmamızı engelledi. Buna karşılık, optimize edilmiş protokol, DHAA ve TAA içeriği(Tablo 4),en zenginleri yabani türler olarak istatistiksel olarak anlamlı farklar tespit etmemizi sağladı (Şekil 2). Optimize edilmeyen Optimize F oranı p-değer F oranı p-değer DHAA 0.460 0,637ns 5.613 0.009** Acar 0.070 0,932ns 1.020 0,374ns Tan 0.015 0,985ns 4.438 0.022* ns, * ve ** sırasıyla p<0.05 ve 0.01'de anlamlı ve anlamlı olmayanı gösterir. Tablo 4: C vitamini içeriğindeki değişim. Dhaa, AA ve TAA içeriği için, dhaa, AA ve TAA içeriği için Lactuca (ticari marul çeşitleri, geleneksel marul çeşitleri ve kırpma yabani akrabaları) türünü göz önünde bulundurarak tek yönlü ANOVA’dan f oranları (iki varyans, grup içi varyans ve grup içi varyans arasındaki bölüm) ve anlamlılık değerleri. Ek Dosya 1: AA ve TAA stabilitesi 5 °C’de 24 saat üzerindedir. (A) AA ve TAA tepe alanları boyunca 24 saat boyunca (B) AA ve TAA içeriği (mg g-1 kuru ağırlık) boyunca 24 saat boyunca. Çubuklar, 5 °C’de otonumunede tutulan ve ışığa maruz kalmaktan korunan iki teknik kopyanın (n=2) standart sapmalarını temsil eder. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız. Ek Dosya 2: TAA, AA ve DHAA çıkarma ve niceleme için optimize edilmiş ve optimize edilmeyen protokol arasındaki temel farklar. Kullanılan örnekler her iki durumda da aynıydı. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

C vitamini çok önemli bir besindir, ama çok da labile bileşiktir, bu nedenle UPLC-UV nicelliği numune depolama ve hazırlama, ekstraksiyon yöntemi ve kromatografik koşullar gibi birden fazla faktöre bağlıdır. Bu nedenle, aa önlemek için hızlı ve basit bir prosedür (antioksidan güç ile) DHAA oksidasyonu (antioksidan özellikleri olmadan) gerekli oldu. Ayrıca yüksek pH ve sıcaklık koşulları önlemek için çok önemliydi, yanı sıra yoğun ışık ve bileşik istikrarı nı teşvik etmek için numune tedavisi sırasında bir oksitleyici atmosfer.

AA oksidasyonunu en aza indirmek için aşağıdaki önlemler alınmıştır. Her şeyden önce, c vitamini içeriğinin doğru bir şekilde ölçülmesini sağlamak ve numuneleri kolayca işlemek için her iki protokol için de başlangıç malzemesi olarak numuneler manipüle edildi. Bu seçenek ince taşlama yerine tercih edildi, yaygın literatür boyunca bulunan¹⁹, su tekrar kullanılabilir hale gelir böylece toz çok hızlı bir şekilde çözülür gibi. Ekstraksiyon işlemi sırasında, daha asidik çözeltinin daha yüksek bir hacmi (%8 asetik asit ve %1 MPA) optimize edilmiş protokolde ekstraktöz olarak kullanılmıştır(Ek Dosya 2),aa bozulmasını önleyerek stabilizatör olarak da hareket etti. Bu çözüm aynı zamanda sabitleme artırmak için bir şelat ajan olarak EDTA içeriyordu¹⁶, non-optimize protokol ayıklayıcı aksine(Ek Dosya 2). Ayrıca, ekstraksiyon prosedürünün standart atmosferkoşulları yerine 5 mL’lik tek bir atmosfer yerine 2,5 mL çıkarma maddesi içeren iki ardışık ekstraksiyon kullanılarak geliştirilip geliştirilemeyeceğini test ettik. En iyi sonuçlara, gereksiz ek adımlar (veri gösterilmez) yaparak protokolü basitleştiren değiştirilmemiş bir atmosfer altında yalnızca bir çıkarma kullanılarak ulaşıldı. Diğer küçük değişiklikler de çıkarma geliştirmek için protokol de tanıtıldı (yani, sonication), daha net bir ekstre (ince filtrasyon) elde etmek ve protokol süresini azaltmak(Ek Dosya 2). Kromatografik koşullara ilişkin olarak, yöntemin doğrulaması^18’denönce bildirildiği gibi gerçekleştirildi ve iyi analitik parametreler garanti edildi (Tablo 3). Ayrıca, formik asit (pH 2.0) ve metanol (98:2 v:v) ile 0.3 mL min^-1 akış, yerine monopotasyum fosfat 30 mM (pH 3.0) 1 mL min^-1 mobil faz olarak ultrasaf su kullanımı(Ek Dosya 2),geliştirilmiş bir yöntem ile sonuçlandı. En önemli ilerleme büyük olasılıkla bir HPLC yerine bir UPLC sistemi kullanarak, hangi bize etkileyen koşulların daha fazla kontrol izin (sıcaklık gibi) ve bilinmeyen bileşikler tarafından girişim olmadan çözülmüş AA zirveleri sonuçlanan, daha kısa bir süre içinde ve ekstre daha az hacim tüketen(Ek Dosya 2).

Yine de, bu yöntemin iki ana sınırlamaları vardır. Bunlardan ilki, DHAA’nın spektrumun UV aralığındaki düşük erepliği nedeniyle doğrudan UV dedektörü kullanılarak ölçülemeyeceğidir. Bazı biyolojik aktivite sunar ve kolayca insan vücudunda AA dönüştürülebilir çünkü DHAA içeriği ölçmek için önemlidir⁵. Bunun için, TAA’yı ölçmek ve daha sonra TAA’dan AA içeriğini çıkararak dolaylı olarak DHAA’yı belirlemek için ikinci bir kromatografik çalışmayla birlikte, DHAA’yı AA’ya düşürmek için ek bir tepki gereklidir(Şekil 3). Bu anlamda, azaltma adımı azaltma maddesi daha yüksek bir konsantrasyon kullanılarak optimize edilmiştir (DTT), 5 ila 30 dk reaksiyon süresini artırarak, ve sülfürik asit ile reaksiyon durdurma(Ek Dosya 2). AA’nın düşük stabilitesi yöntemin ikinci sınırlamasını oluşturur. AA çıkarmadan sonra 4 saat bozulmaya başladığında(Ek Dosya 1),bu zaman aralığında ölçmek gerekir. Yani, ayıklamak için örnek sayısı kromatografik prosedür tarafından koşullandırılmıştır. Bu nedenle bu protokoldeki bu adımda onları dondurmayı öneriyoruz, ancak bu durumda, hepsi otomatik olarak ölçülmek üzere UPLC autosampler’ına yerleştirilemedi. Neyse ki, AA için azaltılmış RT bize 3 dakika kromatogramlar elde etmek için izin, çok 7 dk kromatogramlar HPLC kullanılarak elde daha kısa(Ek Dosya 2). Bu nedenle, C vitamini içeriği 4 saat pencerede örnek yüksek sayıda tespit edilebilir.

Şekil 3: Marul ve bazı yabani akrabalarıc vitamini niceliksel iş akışı.
Yalnızca AA veya AA + DHAA (TAA) belirlenmesi için iki dalı gösteren optimize edilmiş protokolün şematik diyagramı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

C vitamini insanlar için gerekli bir besin olduğu ve önemli sağlık yararları nedeniyle, birçok çalışmanın nesnesi haline gelmiştir. Bu nedenle, marul, dünya çapında en çok tüketilen sebze biri de dahil olmak üzere bitkileri, büyük bir çeşitlilik ölçüldü olmuştur. Basit klasik yöntemler yavaş yavaş sıvı kromatografi teknikleri ile değiştirilmiştir çünkü daha spesifik ve doğru¹⁰. Ancak, hplc üzerinden her iki, AA ve DHAA ölçmek için ek bir reaksiyon ihtiyacı nedeniyle, marul bazı çalışmalarda, sadece AA¹⁴ veya sadece TAA¹¹ (AA aa azalma önce AA ölçülme olmadan) ölçüldü. Ayrıca, sadece birkaç yazar AA ve DHAA sayısal var, C vitamini antioksidan aktivitesi her iki molekülün katkısına rağmen². Yine de, UPLC tekniği çeşitli bitkileri C vitamini ölçerken yüksek performansı nedeniyle son zamanlarda daha önemli hale gelmiştir¹⁶. Bu çalışmada elde edilen sonuçları iki metodoloji, UPLC ve HPLC ile karşılaştırarak, bu avantajlar teyit edilmiştir: iyi tanımlanmış AA zirveleri daha yüksek bir duyarlılık sayesinde, ve çok kısa bir süre içinde, aynı zamanda daha az kaynak tüketilen anlamına gelir elde edilmiştir. UPLC verimliliğirağmen, sadece Chen ve ark²⁰ marul C vitamini içeriğini ölçmek için bu tekniği uyguladık, hala sadece AA formu sayısal olarak bir küçümseme yol açtı.

Özetle, bu çalışma sadece farklı marul çeşitleri değil, aynı zamanda bazı yabani akrabaları toplam C vitamini içeriğini belirlemek için ilk başarılı girişimi temsil eder. C vitamini nicelik de üreme programları içinde yüksek antioksidan aktivitesi ile marul seçmek için gereklidir. Bu anlamda, marul yabani akrabalarında artan toplam C vitamini içeriği ve daha önceki çalışmalarda bildirilen artan AA içeriği¹⁴, yanı sıra diğer antioksidan bileşikler²¹, marul besin değerini artırmak için uygun adaylar genişletiyor.

Sonuç olarak, c vitamini doğasına doğasında bazı sınırlamalar bile, onun kademeli bozulma birkaç saat ayıklandıktan sonra veya düşük DHAA UV-absorptivity nedeniyle bir azalma reaksiyonu ihtiyacı gibi, daha az emek yoğun ve daha az zaman alan bir yöntem C vitamini içeriğini ölçmek için sunuyor. Ayrıca, aynı zamanda çok sağlam ve yüksek hassasiyet ve çözünürlük gücü gösterir. Ayrıca, sadece hafif ya da hiç değişiklik olmayan diğer bitkisel malzemelere değil, aynı zamanda insanlara C vitamini besin alımını sağlayan işlenmiş ürünlere de kolayca aktarılabilir, bu da gelişmekte olan gıda kalitesi için test alanında gelecekteki uygulamaların geniş bir yelpazesine yol açabiliyor.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz minnetle Sebze Germplasm Bankası Zaragoza (BGHZ-CITA, İspanya) ve Genetik Kaynaklar Merkezi (CNG, Wageningen, Hollanda) bu iş için gerekli tohumları temin için kabul ediyoruz. J. A. Aranjuelo, A. Castellanos ve CITA’dan “laboratorio de valoración nutritiva” ve İngilizce’yi gözden geçiren D. L. Goodchild’a teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Tarım ve Gıda Araştırma ve Teknoloji Enstitüsü (INIA) ve Aragón Hükümeti’nden LMP164_18 RTA2017-00093-00-00 projeleri tarafından finanse edilmiştir; ve FEDER Aragón 2014-2020 Operasyonel Programı ve Avrupa Birliği’nden Avrupa Sosyal Fonu [Grupos Consolidados A12-17R: “Grupo de investigación en fruticultura: caracterización, adaptación y mejora genéica” ve A14-17R: “Sistemas agroganaderos alimentarios sostenibles” (SAGAS)]. I.M L. İspanya Bilim, Yenilik ve Üniversiteler Bakanlığı (MCIU) ve İspanya Devlet Araştırma Ajansı ‘ndan (AEI) doktor eğitimi için doktora öncesi bir sözleşme ile desteklendi.

Materials

1,4-Dithiothreitol (DTT) ≥98% (Ellman′s reagent)	Roche	10197777001
10 mm f stainless steel ball	Euro Aznar Supplies S.L.	20112100
15 mL polypropylene tube for centrifuge	DeltaLab	429946
2 mL HPLC amber vial	Agilent	5190-9063
2 mL syringe with needle	DeltaLab	JS2
20 mL polypropylene tubes	Dealtalab	202840
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIS) ≥99.9% (titration)	Roche	10708976001
50 mL polypropylene tube	DeltaLab	429951
Acetic acid (CH3COOH) ≥99% purity glacial, ReagentPlus	Sigma-Aldrich	A6283
Acetonitrilo, HPLC super gradient grade (99.9+% CH3CN-0.2 µm filtrated)	Chem-lab	CL00.0189
Acquity UPLC HSS T3 column (150 mm x 2.1 mm x 1.8 µm)	Waters	186003540
Beaker 1 L, 200 mL	DeltaLab	191725, 191722
Dipotassium phosphate (KH₂PO₄)	Panreac	766384	Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium salt (EDTA x 2H2O) 99-101% assay, ACS reagent	Panreac	131669
Fisherbrand Analog MultiTube Vortexer	Thermo Fisher Scientific	15549004
Formic acid 98-100% for HPLC LiChropur	Supelco	5438040100
Freeze dryer VirTis genesis 25EL	VirTis	na
Heidolph Multi Reax mixer	Heidolph	na
Heidolph Reax top mixer	Heidolph	na
Hewlett Packard HPLC 1050 equipped with an eλ Detector	Hewlett Packard	na	Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
Hydrochloric acid (HCl) 37% purity, ACS reagent	Sigma-Aldrich	320331
L-Ascorbic acid ≥99%, ACS reagent	Sigma-Aldrich	255564
Meta-phosphoric acid (MPA) ACS reagent, chips, 33.5-36.5%	Sigma-Aldrich	239275
Methanol ≥99.9% (HPLC supergradient grade)	ChemLab	CL00.0189.2500
Micropipettes 10-1000 μL	Socorex	na
Nucleosil 120 C18 Tracer column (250 mm x 4 mm x 5 µm)	Merck (Sigma-Aldrich)	54919	Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
PTFE-silicone cap with preaperture	Agilent	5190-9067
Refrigerated centrifuge Gyrozen 1248R	Gyrozen	na
Regenerated cellulose filters 0.22 µm (13 mm)	Agilent	1015190-5108
Regenerated cellulose filters 0.45-µm (13 mm)	Labbox	SFCA-145-100	Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
Spectrophotometer Heλios β	Thermo Scientific Corporation	na
Sulfuric acid (H₂SO₄) 95.0-98.0% purity, ACS reagent	Sigma-Aldrich	258105
Ultrapure water	WasserLab	na
Ultrasons H-D	Selecta	na
Volumetric flasks 1 L, 100 mL	DeltaLab	191489, 191486
Waters Acquity UPLC H-Class equipped with a PDA eλ Detector	Waters	na

Referencias

Llorach, R., Martínez-Sánchez, A., Tomás-Barberán, F. A., Gil, M. I., Ferreres, F. Characterisation of polyphenols and antioxidant properties of five lettuce varieties and escarole. Food Chemistry. 108 (3), 1028-1038 (2008).
Carr, A. C., Frei, B. Toward a new recommended dietary allowance for vitamin C based on antioxidant and health effects in humans. American Journal of Clinical Nutrition. 69 (6), 1086-1107 (1999).
Carr, A. C., Vissers, M. C. M. Synthetic or food-derived vitamin C-Are they equally bioavailable. Nutrients. 5 (11), 4284-4304 (2013).
Lee, S. K., Kader, A. A. Preharvest and postharvest factors influencing vitamin C content of horticultural crops. Postharvest Biology and Technology. 20 (3), 207-220 (2000).
Shekhovtsova, T. N., Muginova, S. V., Luchinina, J. A., Galimova, A. Z. Enzymatic methods in food analysis: determination of ascorbic acid. Analytica Chimica Acta. 573-574, 125-132 (2006).
Zhan, L., et al. Light exposure during storage preserving soluble sugar and L-ascorbic acid content of minimally processed romaine lettuce (Lactuca sativa L.var. longifolia). Food Chemistry. 136 (1), 273-278 (2013).
Malejane, D. N., Tinyani, P., Soundy, P., Sultanbawa, Y., Sivakumar, D. Deficit irrigation improves phenolic content and antioxidant activity in leafy lettuce varieties. Food Science and Nutrition. 6 (2), 334-341 (2017).
Tarrago-Trani, M. T., Phillips, K. M., Cotty, M. Matrix-specific method validation for quantitative analysis of vitamin C in diverse foods. Journal of Food Composition and Analysis. 26 (1-2), 12-25 (2012).
Klimczak, I., Gliszczyńska-Świgło, A. Comparison of UPLC and HPLC methods for determination of vitamin C. Food Chemistry. 175, 100-105 (2015).
Złotek, U., Świeca, M., Jakubczyk, A. Effect of abiotic elicitation on main health-promoting compounds, antioxidant activity and commercial quality of butter lettuce (Lactuca sativa L.). Food Chemistry. 148, 253-260 (2014).
Koh, E., Charoenprasert, S., Mitchell, A. E. Effect of organic and conventional cropping systems on ascorbic acid, vitamin C, flavonoids, nitrate, and oxalate in 27 varieties of spinach (Spinacia oleracea L). Journal of Agricultural and Food Chemistry. 60 (12), 3144-3150 (2012).
Kałuzewicz, A., et al. The influence of short-term storage on the content of flavonoids and vitamin C in Broccoli. European Journal of Horticultural Science. 77 (3), 137-143 (2012).
van Treuren, R., van Eekelen, H. D. L. M., Wehrens, R., de Vos, R. C. H. Metabolite variation in the lettuce gene pool: towards healthier crop varieties and food. Metabolomics. 14 (11), 1-14 (2018).
Swartz, M. E. UPLC: An introduction and review. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 28 (7), 1253-1263 (2005).
Spínola, V., Mendes, B., Câmara, J. S., Castilho, P. C. An improved and fast UHPLC-PDA methodology for determination of L-ascorbic and dehydroascorbic acids in fruits and vegetables. Evaluation of degradation rate during storage. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403 (4), 1049-1058 (2012).
Ball, G. F. M. . Water-soluble vitamin assays in human nutrition. , (1994).
Bertolín, J. R., et al. Simultaneous determination of carotenoids, tocopherols, retinol and cholesterol in ovine lyophilised samples of milk, meat, and liver and in unprocessed/raw samples of fat. Food Chemistry. 257, 182-188 (2018).
Spínola, V., Llorent-Martínez, E. J., Castilho, P. C. Determination of vitamin C in foods: Current state of method validation. Journal of Chromatography A. 1369, 2-17 (2014).
Chen, Y., et al. radiation is beneficial for yield and quality of indoor cultivated lettuce. Frontiers in Plant Science. 10, 1-10 (2019).
Damerum, A., et al. Elucidating the genetic basis of antioxidant status in lettuce (Lactuca sativa). Horticulture Research. 2 (15055), 1-13 (2015).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artículo

Medina-Lozano, I., Bertolín, J. R., Zufiaurre, R., Díaz, A. Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties (Lactuca sativa L.) and Crop Wild Relatives (Lactuca spp.). J. Vis. Exp. (160), e61440, doi:10.3791/61440 (2020).