Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties (<em>Lactuca sativa</em> L.) and Crop Wild Relatives (<em>Lactuca</em> spp.)

In&#233;s Medina-Lozano; Juan  Ram&#243;n Bertol&#237;n; Raquel Zufiaurre; Aurora D&#237;az

doi:10.3791/61440

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Bioquímica

Улучшенный UPLC-UV метод количественной оценки витамина С в листьях салата(Lactuca sativa L.) и Crop Wild Relatives(Lactuca spp.)

Published: June 30, 2020

doi:

10.3791/61440

Inés Medina-Lozano*^1,4, Juan Ramón Bertolín*^2,4, Raquel Zufiaurre³, Aurora Díaz^1,4

¹Unidad de Hortofruticultura,Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), ²Unidad de Producción y Sanidad Animal,Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), ³Dpto Química Analítica,Escuela Politécnica Superior (Universidad de Zaragoza), ⁴Instituto Agroalimentario de Aragón – IA2 (CITA-Universidad de Zaragoza)

Summary

Мы представляем быстрый и надежный метод количественной оценки витамина С в Lactuca spp. с использованием UPLC-UV, потенциально перенесите его другим растениям. Ключевыми шагами являются подготовка образца и экстракция витамина С в стабильных условиях, снижение дегидроаскорбиновой кислоты до аскорбиновой кислоты и оптимизация хроматографической процедуры.

Abstract

Витамины, особенно витамин С, являются важными микроэлементами, содержащиеся во фруктах и овощах. Витамин С также является одним из основных факторов, способствующих их антиоксидантной способности. Салат является одним из самых популярных овощей среди потребителей во всем мире. Точный протокол для измерения содержания витамина С в салате и других смежных видах имеет решающее значение. Здесь описан метод, использующий сверхвысокую высокую производительность жидкой хроматографии-ультрафиолетовую (UPLC-UV) методику, при которой были оптимизированы методы подготовки образцов, экстракции витаминов и хроматографии.

Образцы были собраны, чтобы представлять все растение, замороженные при -80 градусов по Цельсию и лиофилизированы, чтобы предотвратить нежелательное окисление и сделать их манипуляции легче. Экстракция витамина С осуществлялась в кислых средствах массовой информации, что также способствовало его стабильности. Поскольку витамин С может присутствовать в двух различных межконвертируемых формах, аскорбиновой кислоте (АА) и дегидроаскорбиновой кислоте (DHAA), оба соединения должны быть измерены для точной количественной оценки. DHAA была количественно косвенно после его сокращения до АА, потому что АА показывает более высокую абсорбцию, чем DHAA в УФ-диапазоне спектра. Из одного и того же экстракта были проведены два измерения: одно до и одно после этой реакции на сокращение. В первом случае мы количественно оценивали содержание АА, а во втором мы количественно оценивали сумму АА и DHAA (TAA: общая аскорбиновая кислота) в виде АА. Затем, DHAA количество было косвенно получено путем вычитания АА Исходя из первого измерения от TAA. Они были определены UPLC-UV, используя коммерческий стандарт АА для построения кривой калибровки и оптимизации хроматографической процедуры, для получения пиков АА, которые были полностью решены в течение короткого времени. Этот протокол можно легко экстраполировать на любой другой растительный материал с небольшими изменениями или без них. Его точность выявила статистически значимые различия в противном случае непровереные. Другие сильные и сильные стороны более подробно обсуждаются в рукописи.

Introduction

Культивируемыйсалат (Lactuca sativa L.) является одним из самых производимых и потребляемых листовых овощей во всем мире, с общим производством около 27,3 млн тонн в 2018^{году 1}. Салат воспринимается потребителями как здоровый. Питательные свойства в основном связаны с источником антиоксидантных соединений в культуре, таких как витамин С, среди других, как полифенолы и витамин^{Е 2}. Витамин С является важным микроэлементом для человека в отличие от многих других позвоночных, так как мы не в состоянии производить его из-за мутаций, присутствующих в генном кодировании для последнего шага фермента в биосинтетической^{пути 3}. Это необходимо для нормального метаболизма клеток, а также играет важную роль в иммунной реакции в основном из-за его^{антиоксидантной активности 3,}⁴.

Общий витамин С состоит из аскорбиновой кислоты (АА) и дегидроаскорбиновой кислоты (DHAA). АА является наиболее биологически активной формой витамина, но DHAA (его продукт окисления) также показывает биологическую активность, и он может быть легко преобразован в АА в организме^{человека 5}. Таким образом, количественная оценка обеих форм имеет важное значение для определения общего содержания витамина С любого садоводческого урожая, салат включены.

Для измерения витамина С в овощах используется широкий спектр подходов, основанных на различных аналитических методах, таких как энзиматические, спектрофотометрические и титриметрические^{методы 6,}^7,^8. Хотя эти методы просты, они не являются химически специфическими для AA⁹. Следовательно, предпочтительными являются хроматографические методы, особенно высокой производительности жидкой хроматографии-ультрафиолетовой (HPLC-UV) техника, из-за их более высокой^{точности 10}. HPLC-UV был использован для определения витамина С в большом разнообразии культур, как брокколи, шпинат и салат¹¹^,¹²^,¹³. Тем не менее, одновременная количественная оценка АА и DHAA осложняется из-за низкой абсорбции DHAA в ультрафиолетовом диапазоне спектра. Кроме того, DHAA может быть определена косвенно с помощью уменьшающий агент, который преобразует DHAA в АА, измерения общей аскорбиновой кислоты (TAA), а затем расчета разницы между TAA и АА. Из-за необходимости снижения реакции, в некоторых исследованиях, только АА была количественно¹⁴, которые могут фактически представляют собой недооценку активности витамина С. Эта дополнительная реакция сокращения также необходима для определения DHAA косвенно, даже когда последний прогресс в жидкой хроматографии методы, ультра-высокой производительности жидкой хроматографии (UPLC), используется. Этот шаг также выигрывает от преимуществ, которые UPLC проявляет по сравнению с HPLC: более высокая эффективность и разрешение, повышенная чувствительность, более короткий анализ времени и более низкое^{потребление растворителя 15}. В результате, UPLC-UV техника была использована для количественной оценки витамина С в различных культурах¹⁶.

Кроме того, АА является очень лабильной молекулой; Таким образом, важно разработать протокол, который предотвращает его деградацию во время хранения салата и анализа витамина^{С 9.} В этом контексте следующий протокол предлагает быструю и улучшенную количественную оценку содержания витамина С в салате UPLC-UV, а также эффективную процедуру экстракции. В настоящее исследование были включены не только элитные сорта, но и традиционные ландраки и некоторые дикие родственники из-за их потенциального интереса к разведению сельскохозяйственных культур, в частности, к повышению питательной ценности салата.

Protocol

1. Подготовка растительного материала Образец по крайней мере два листа на растение в 50 мл полипропиленовых труб, внешний (старый) и внутренний (младший) один для того, чтобы представлять более точно все растение. Соберите по крайней мере три биологических репликации для каждого образца. Заморозить их немедленно с помощью жидкого азота и хранить их при -80 градусов по Цельсию до использования. Убедитесь, что жидкий азот не попадает в трубки; в противном случае они могут взорваться при снятии из-за расширения газа во время испарения.ВНИМАНИЕ: Перчатки и щит для лица необходимы из-за потенциальных опасностей, связанных с использованием жидкого азота. Снимите колпачки с трубок и поместите их на подносы в камере замерзать сушилки лиофилизера(Таблицаматериалов ), запрограммированный следующим образом: -25 градусов по Цельсию для 72 ч, -10 градусов по Цельсию за 10 ч, 0 градусов по Цельсию за 10 ч и 20 градусов по Цельсию, по крайней мере 4 ч. Поддерживайте температуру конденсатора и вакуумную константу во время процесса замораживания при температуре -80,2 градусов по Цельсию и 112 мТорр, соответственно. Когда материал полностью высохнет (от 4 до 7 дней в зависимости от растения и степени уплотнения в трубку), сохранить при 4 градусов по Цельсию, -20 градусов по Цельсию или -80 градусов по Цельсию в течение коротких (дней до недель), среднего (месяцев) или длинных (лет) хранения, соответственно. Рекомендуется включить в образец содержащие трубки мешки с бусинками с кремнеземным гелем. Поместите лиофилизированные образцы в 20 мл полипропилевых труб вместе с шарами из нержавеющей стали диаметром 10 мм и измельчите их мультитрубным вихрем, используя интенсивность и время, необходимое для получения мелкой пыли.ПРИМЕЧАНИЕ: В течение всего процесса, защитить образцы от воздействия прямого света. 2. Реагент и приготовление раствора Приготовить растворительное экстракции: 8% уксусной кислоты (v/v), 1% МПА (мета-фосфорная кислота) (w/v), 1 мМ EDTA (этилендиаминтетраацетическая кислота). Рассчитайте общий объем растворителя, необходимый для обработки всего набора образцов с учетом того, что к каждому будет добавлено 5 мл. Чтобы подготовить 1 л раствора, добавьте в колбу: 30 г MPA, 0,372 г обезвоживания ЭДТА, 80 мл уксусной кислоты и 500 мл ультрапурной воды (объемы масштаба и количества соответственно). Печать колбы рот с пластиковой пленкой. После растворения с помощью магнитного мешалки используйте объемную колбу для точного измерения 1 л, добавляя необходимую ультрапурную воду. Подготовь буфер реакции уменьшения (0.5 M Tris (2-amino-2-(гидроксиметил)-1,3-пропанедиол) рН 9.0) и уменьшая раствор (40 mM DTT (1.4-Dithiothreitol) с 0.5 M Tris pH 9.0). Рассчитайте общий объем сокращаемого решения, необходимого для обработки всего набора образцов с учетом того, что к каждому из них будет добавлено 200 МКЛ. Чтобы подготовить 100 мл буфера, добавьте в стакан: 6,055 г Tris и 90 мл ультрачистой воды (объемы масштаба и количества соответственно). Печать стакан рот с пластиковой пленкой. После растворения с помощью магнитного мешалки, отрегулируйте раствор до рН 9.0, добавив 2 M HCl и используйте объемную колбу для точного измерения 100 мл, добавляя необходимую ультрапурную воду. Чтобы подготовить 100 мл уменьшаемого раствора, добавьте в стакан: 0,629 г DTT (чистота: 98%) и 90 мл ранее подготовленного буфера (0,5 М Трис рН 9,0) (2,2,1 – 2,2,2). Масштабируйте объемы и объемы соответственно. Печать стакан рот с пластиковой пленкой. После растворения с помощью магнитного мешалки используйте объемную колбу для точного измерения 100 мл, добавляя необходимый объем буфера 0,5 М Трис рН 9,0.ПРИМЕЧАНИЕ: Решение для сокращения очень нестабильно. Именно поэтому настоятельно рекомендуется свежеприготовленное решение. Серная кислота (0.4 M H2SO4) Рассчитайте общий объем серной кислоты 0,4 М, необходимой для обработки всего набора образцов с учетом того, что к каждому из них будет добавлено 200 МЛ. Чтобы подготовить 100 мл раствора, добавьте в стакан: 80 мл ультрапурной воды, а затем 2,22 мл H2SO4 (чистота: 96%, плотность: 1,84 мл-1). Используйте объемную колбу для точного измерения 100 мл, добавляя необходимую ультрапурную воду.ВНИМАНИЕ: Серная кислота очень коррозионная, поэтому она должна быть обработана с помощью защитного оборудования и под капотом. Кроме того, кислоту следует добавить в ультрапурную воду, а не воду в кислоту, чтобы уменьшить количество паров и избежать несчастных случаев. Гидрохлорная кислота (2 МХК). Для приготовления 100 мл 2 М соляной кислоты добавьте в стакан: 80 мл ультрапурной воды, а затем 6,13 мл HCl (чистота: 37%, плотность: 1,19 мл-1). Печать стакан рот с пластиковой пленкой. Используйте объемную колбу для точного измерения 100 мл, добавляя необходимую ультрапурную воду. Масштаб объемов соответственно.ВНИМАНИЕ: Гидрохлорная кислота очень коррозионная, поэтому она должна быть обработана с помощью защитного оборудования и под капотом. Кроме того, кислоту следует добавить в ультрапурную воду, а не воду в кислоту, чтобы уменьшить количество паров и избежать несчастных случаев. Стандарт АА (запасы и разбавления) Взвешивание ровно 10 мг стандарта АА (чистота: 99%) с использованием точного баланса и добавить 90 мл мобильной фазы (ультрапурный рН воды 2.0 с мимической кислотой). После растворения с помощью магнитного мешалки используйте томтрическую колбу для точного измерения 100 мл, добавляя необходимый объем ультрапурной воды pH 2.0 с кремовой кислотой.ПРИМЕЧАНИЕ: Защитите это решение от воздействия света. Подготовь пять разбавлений из запаса стандарта АА, чтобы получить кривую калибровки в соответствии с инструкциями в таблице 1 и продолжить шаг 5.2. Стандартный (АА) Я НЕ (мкг мл-1) АА (100 мкг мл-1) раствор (ОЛ) Мобильная фаза(КЛ) a 1 0.5 5 995 2 2.5 25 975 3 5 50 950 4 10 100 900 5 25 250 750 a Ультрапурная вода рН 2.0 подкисляется фаминовой кислотой. Таблица 1: Протокол для подготовки пяти стандартов АА (аскорбиновая кислота). Указаны объемы растворителя и растворителя для подготовки каждой из различных концентраций стандартов. 3. Добыча АА и DHAA ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется работать в условиях низкой интенсивности света во время этапов извлечения. В 15 мл полипропиленовая центрифугная трубка добавьте 50 мг лиофилинизированного грунтового образца и 5 мл растворителя экстракции (шаг 2.1). Встряхните смесь с помощью вихря в течение 5 с, а затем орбитальный шейкер в течение 10 минут при 2000 об/мин. Ввести трубку в ультразвуковую ванну в течение 10 минут при комнатной температуре с активацией ультразвука. Центрифуга при 4000 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия. Возьмите супернатант, пройдите его через регенерированный фильтр целлюлозы на 0,22 мкм и храните его в янтарном флаконе 5 мл. Это экстракт 1, который содержит АА и DHAA.ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь путем замораживания экстрактов при температуре -80 градусов по Цельсию и защиты их от воздействия света, как АА и DHAA очень нестабильны и легко деградировать в присутствии света, при высоких температурах или при окислении атмосферы(Дополнительный файл 1). 4. СОКРАЩЕНИЕ DHAA до АА для извлечения TAA Перенесите 200 МКЛ экстракта 1 в 2 мл янтарного флакона для жидкой хроматографии и добавьте 200 мл уменьшаемого раствора (шаг 2.2). Закройте флакон с PTFE-силиконовой вилкой с предварительного открытия и встряхните его вихрем на 5 с. Разрешить раствор стоять в течение 30 минут при комнатной температуре и защитить от света. Добавьте 200 МКЛ из 0,4 М Н2SO4, чтобы остановить реакцию и стабилизировать АА в кислых рН. В результате решение Экстракт 2, который содержит только АА и на самом деле TAA. 5. Определение Подготовка UPLC-UV Подготовь рабочие решения, описанные в таблице 2,соответствующим образом отфильтрованные через фильтры 0,22 мкм, sonicated в течение по крайней мере 10 минут и поместить их в систему UPLC. Включите три модуля UPLC и дождитесь завершения процесса внутренней калибровки. Откройте программное обеспечение (например, Empower 3) и загрузите инструментальную программу, описанную в таблице 2: Empower 3 Вы запустите образцы Метод витамина С UPLC_PDA Используйте быстрый старт. После загрузки программного обеспечения с правильной программой, доступ к консоли управления UPLC: Квартернарий Solvent Manager (ru) Нажмите правую кнопку мыши Запуск консоли. Приступить к подготовке и стабилизации инструмента UPLC: Система Контрольный элемент Стартап. Очистка всех линий UPLC в течение по крайней мере 5 минут: Prime Solvents ЗСМ Проверьте A, B, C, D и печать мыть (ru) Продолжительность прайм-энда и 5 мин. Очистка и очистка инжектора: Prime Solvents СМ Проверьте стиральный растворитель (nogt; 45 s) и проверьте растворитель очистки (Nogt; 35 циклов). Equilibrate UPLC к условиям метода: Equilibrate к методу ЗСМ Поток (0,3 мл мин-1) Растворитель A (2%) Растворитель B (0%) Растворитель C (98%) Растворитель D (0%); Эквилибрировать к методу СМ Образец (5 КК) Колонка (30 градусов по Цельсию) и эквилибрировать к методу Прочие вопросы Проверить лампу на Пресс-старт. Подождите, по крайней мере 1 ч (еще больше времени рекомендуется) для оборудования для стабилизации. Стабильность может быть проверена, проверяя давление в столбце в стартовой консоли : Система Квартернарий Платежеспособный Менеджер (ru) Давление системы ЗСМ. Убедитесь, что нет идентифицируемых тенденций в изменениях давления (либо увеличивается, либо уменьшается), а значение дельты составляет менее 10 пси. На экране «Быстрый старт» заполните матрицу именами стандартов и образцов, которые будут проанализированы. Определение АА в стандартах Передача 1 мл каждого из пяти ранее подготовленных стандартов АА (шаг 2.5.3) на 2 мл янтарных флаконов для жидкой хроматографии. Закройте флакон с ptFE-силиконовой вилкой с предварительной открываемой и впрыснуть 5 МКЛ в инструмент UPLC. Проводите хроматографию в соответствии с процедурой, описанной в таблице 2, начиная с наиболее разбавленной до наиболее концентрированной. Определение АА в образцах Pipette 200 МКЛ экстракта 1 в 2 мл янтарного флакона для жидкой хроматографии и добавить 800 мл ультрачистой воды. Закройте флакон с ptFE-силиконовой вилкой с предварительной открываемой и впрыснуть 5 МКЛ в инструмент UPLC. Проведение хроматографии после процедуры, описанной в таблице 2. Определение TAA в образцах Добавьте 400 мкл ультрачистой воды для извлечения 2. Закройте флакон с ptFE-силиконовой вилкой с предварительной открываемой и впрыснуть 5 МКЛ в инструмент UPLC. Проведение хроматографии после процедуры, описанной в таблице 2. Компоненты и параметры Описание Инструмент Acquity UPLC H-класса Детектор ДЕТЕКТОР КПК для ААЗ 245 нм Программного обеспечения Расширение прав и возможностей 3 Столбца Acquity UPLC HSS T3 (150 мм x 2,1 мм x 1,8 мкм) Канал А CH3OH Канал B/Wash H2O:CH3OH (50:50 v:v) Канал C Ультрапурная вода рН 2.0 подкисляется фаминовойкислотой a Канал D/Seal Wash Ультрачистая вода:ацетонитриле (90:10 v:v) Мобильная фаза 0,3 мл мин-1 из 2%А и 98%C (изократический режим) Температура колонны 30 КК Температура автоамплеера 5 КК Объем инъекций 5 мкл Время удержания АА 1,874 мин. Продолжительность 3 мин. a Неопределенный объем фаминовой кислоты, используемой до корректировки рН Таблица 2: Хроматографическая процедура оптимизирована для определения АА (аскорбиновой кислоты) в экстрактах салата и диких родственников. Описание используемых компонентов, условий и решений. 6. Количественная оценка АА и ДХАА Статистический анализ Определите аналитические параметры хроматографического метода, описанного Бертолином и др.18 (таблица 3).ПРИМЕЧАНИЕ: Значения параметров, представленных в таблице 3, должны быть определены в конкретных экспериментальных условиях. Аналитические параметры метода Значения Линейный диапазон (мкг мл-1) 0.5-25 Линейное уравнение y’53,143.03x R2 0.99998 Предел обнаружения (мг АА г-1 сухого вещества) 0.013 Предел количественной оценки (мг ААг -1 сухого вещества) 0.045 Повторяемость (CV,%) a 1.75 Промежуточная точность (CV,%) a 4.22 Восстановление (Rec, %)b 95,6±2,4 a CV: коэффициент вариации б Анализ восстановления был выполнен с 10 aliquots, содержащих 50 мг того же образца, 5 шипами с 2 мг ААг -1 сухого вещества, и 5 не шип. %Рец (образец AA-AA)/(AA)spiked)x100. Таблица 3: Оптимизированные аналитические параметры для выявления и количественной оценки АА (аскорбиновая кислота) и ТАА (общая аскорбиновая кислота). Линейный диапазон, уравнение и коэффициент определения кривой калибровки (R2), а также пределы обнаружения и количественной оценки АА (то же самое для TAA), а также повторяемость, промежуточная точность и восстановление были получены с объемом впрыска образца 5 йл. Рассчитайте концентрацию АА и ТАА. Откройте стандартные и выборочных хроматограммы: Быстрый старт Просмотр проекта (ru) Каналы (ru) “название стандарта или образца” КПК Ch1 245 nm@1,2 нм. Интегрируйте соответствующий пик (AA или TAA) в стандарты и образцы, нажав на его отправную точку (приблизительно 1,790 мин) и перетащив его с помощью мыши до конца (примерно 1,910 мин). Создайте кривую калибровки, представляющую значения абсорбции, определяемые хроматографически (шаг 5.2.) по отношению к концентрации пяти стандартов АА, подготовленныхвыше (таблица 1). Интерполировать значения абсорбации образцов, определенных шагами 5.3 и 5.4, и получать концентрацию АА и ТАА, соответственно, по следующей формуле:где у является интегрированной пиковой области, х является АА или TAA концентрации в ppm и м и п являются склон и у-перехват полученнойлинии регрессии, соответственно. Для расчета концентрации DHAA примените следующую формулу:ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения общей концентрации DHAA, AA и TAA в мг g-1 сухого веса, значения, полученные непосредственно интерполяции в кривой калибровки должны быть умножены на общий объем экстракта и фактор разбавления применяется, а затем делится на вес образца, используемого для выполнения извлечения.

Representative Results

Количественная оценка витамина С в матрицах Lactuca требует разработки хроматографического подхода, который может обеспечить надежные результаты. На рисунке 1A показана хроматограмма, полученная в результате неоптимизировалипротокол (дополнительный файл 2), который представляет пик АА вместе с неопознанным незначительным “плечом”. Тем не менее, после улучшения экстракции и хроматографических условий, был достигнут решенный пик АА без помех неизвестных соединений(рисунок 1B). Кроме того, использование УФ-оборудования UPLC вместо HPLC-UV позволило нам сократить время удержания (RT) для АА: 1,874 мин в оптимизированных хроматограммах против 2,980 мин в неоптимизированных(рисунок 1), а также времяработы, 3 и 7 минут для оптимизированных и неоптимизировали протоколы соответственно. Рисунок 1: Хроматограммы АА в том же образце салата (коммерческий сорт ‘Bego’a’). (A) HPLC-UV хроматограмма в результате неоптимизировали протокол (условия, описанные в дополнительном файле 2). (B)UPLC-UV хроматограмма, полученная с помощью оптимизированного протокола (условия, описанные в таблице 2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Помехи в пиках АА, как и те, которые наблюдаются на рисунке 1А,постоянно приводили к недооценке содержания витамина С (АА, DHAA и TAA)(рисунок 2)из-за недостаточного разделения во время хроматографического процесса, поскольку перекрывающиеся пиковые области были интегрированы вертикальным падением в самой глубокой точке между ними. Эта предвзятость особенно заметна в случае урожая диких родственников, особенно в DHAA и TAA содержание (Рисунок 2). Рисунок 2: Распределение содержания витамина С. Сплит скрипки участков DHAA, АА и TAA содержание (мг г-1 сухого веса) в коммерческих и традиционных сортов салата и некоторых диких родственников с использованием неоптимизированы и оптимизированы протоколы. Черные линии показывают средние значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Кроме того, использование неоптимизировали протокол помешали нам извлечь какие-либо полезные выводы из результатов, как они показали все образцы, как виды салатов и диких родственников, имеющих аналогичное содержание витамина С. В отличие от этого, оптимизированный протокол позволил нам обнаружить статистически значимые различия между ними для DHAA и TAA содержание (Таблица 4), самые богатые из них диких видов(рисунок 2). Не оптимизировано Оптимизированные F-коэффициент p-значение F-коэффициент p-значение ДХАА 0.460 0,637нс 5.613 0.009** Аа 0.070 0,932нс 1.020 0,374нс Таа 0.015 0,985нс 4.438 0.022* ns, и q указывают на неосвенимые и значимые на plt;0.05 и 0.01, соответственно. Таблица 4: Изменение содержания витамина С. F-коэффициенты (коэффициенты двух отклонений, дисперсия между группами и внутригрупповая дисперсия) и значения значимости от одной стороны ANOVA с учетом типа Lactuca (коммерческие сорта салата, традиционные сорта салата и дикие родственники урожая) для содержания DHAA, AA и TAA в неоптимизированных и оптимизированных протоколах. Дополнительный файл 1: Стабильность АА и TAA при 5 градусов по Цельсию более 24 ч. (A) АА и TAA пиковых областях в течение 24ч.( B ) АА и TAA содержание (мг г-1 сухого веса) в течение 24 ч. Бары представляют собой стандартные отклонения двух технических репликаций (n’2), которые хранятся в автозамомплере при 5 градусов по Цельсию и защищены от воздействия света. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл 2: Основные различия между оптимизированным и неоптимизированным протоколом для извлечения и количественной оценки TAA, AA и DHAA. В обоих случаях образцы были одинаковыми. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Витамин С является очень важным питательным веществом, но это очень лабиновое соединение тоже, так что его UPLC-UV количественной оценки зависит от нескольких факторов, таких как хранение образцов и подготовки, метод извлечения и хроматографических условиях. Поэтому необходима быстрая и простая процедура предотвращения окисления АА (с антиоксидантной силой) до DHAA (без антиоксидантных свойств). Кроме того, крайне важно избегать высокого рН и температурных условий, а также интенсивного света и окисления атмосферы во время обработки образцов для содействия стабильности соединения.

Для сведения к минимуму окисления АА были приняты следующие меры. Прежде всего, образцы были лиофилизированы в качестве исходного материала для обоих протоколов для обеспечения точной количественной оценки содержания витамина С и легко манипулировать образцами. Этот вариант был предпочтительнее мелкой шлифовки, обычно встречается во^{всей литературе 19}, как пыль тает очень быстро, так что вода становится доступной снова. Во время процедуры экстракции, более высокий объем более кислого раствора (8% уксусной кислоты и 1% MPA) был использован в качестве экстрактанта в оптимизированномпротоколе (Дополнительный файл 2), который также выступал в качестве стабилизатора, предотвращая деградацию АА. Это решение также содержало EDTA в качестве хелатирующего агента^{для увеличения стабилизации 16,}в отличие от экстрактанта в неоптимизированномпротоколе (дополнительный файл 2). Кроме того, мы проверили, можно ли усовершенствовать процедуру извлечения с помощью двух последовательных извлечений с 2,5 мл экстрактанта вместо одного с 5 мл и в атмосфере N₂ вместо стандартных атмосферных условий. Наилучшие результаты были достигнуты с использованием только одной экстракции в неизмененной атмосфере, что упростило протокол, сделав ненужные дополнительные шаги (данные не показаны). Другие незначительные изменения были также внесены в протокол для того, чтобы увеличить добычу (т.е. sonication), получить более четкий экстракт (тонкая фильтрация) и уменьшитьпродолжительность протокола (Дополнительный файл 2). Что касается хроматографических условий, то проверка метода была проведена, как^{сообщалось до 18}года, гарантируя хорошие аналитические параметры(таблица 3). Кроме того, использование ультрачистой воды с мякотью кислотой (рН 2.0) и метанолом (98:2 v:v) с потоком 0,3^{мл мин -1,} вместо монопотассий фосфата 30 мМ (pH 3.0) при 1 мл^{мин -1 в качестве} мобильной фазы(дополнительный файл 2),привело к улучшению метода. Наиболее важным достижением, вероятно, было использование системы UPLC вместо HPLC, что позволило нам больше контролировать условия воздействия (например, температуру) и в результате решены пики АА без помех неизвестных соединений, в более короткое время и потребляющих меньше объема экстракта(Дополнительный файл 2).

Тем не менее, существует два основных ограничения этого метода. Первая заключается в том, что DHAA не может быть измерена непосредственно с помощью УФ-детектора из-за его низкой абсорбции в УФ-диапазоне спектра. Важно количественно содержание DHAA, поскольку он представляет определенную биологическую активность и легко кабриолет АА в организме человека⁵. Для этого необходима дополнительная реакция на сокращение DHAA до АА, а также второй хроматографический запуск для того, чтобы измерить TAA, а затем определить DHAA косвенно, вычитая содержание АА из TAA (Рисунок 3). В этом смысле, шаг сокращения был оптимизирован с помощью более высокой концентрации уменьшая агента (DTT), увеличивая время реакции от 5 до 30 минут, и останавливая реакцию с серной кислотой(Дополнительный файл 2). Низкая стабильность АА представляет собой второе ограничение метода. Как А. А. начинает деградировать 4 ч послеизвлечения (дополнительный файл 1), необходимо количественно его в этот промежуток времени. Таким образом, количество образцов для извлечения обусловлено хроматографической процедурой. Поэтому мы предлагаем заморозить их на этом этапе в этом протоколе, хотя в этом случае не все из них могут быть помещены в автоамплеер UPLC для автоматического измерений. К счастью, уменьшенный RT для АА позволил нам получить 3 мин хроматограммы, гораздо короче, чем 7 мин хроматограммы, полученные с помощью HPLC (Дополнительный файл 2). Таким образом, содержание витамина С может быть определено в большом количестве образцов в окне 4 ч.

Рисунок 3: Рабочий процесс количественной оценки витамина С в салате и некоторых диких родственников.
Схематическая диаграмма оптимизированного протокола, показывающая две ветви для определения только АА или АА й DHAA (TAA). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Поскольку витамин С является важным питательным веществом для человека и из-за его важных преимуществ для здоровья, он стал объектом многих исследований. Таким образом, он был количественно в большое разнообразие культур, в том числе салат, один из самых потребляемых овощей во всем мире. Простые классические методы были постепенно заменены жидкими методами хроматографии, потому что они более специфичны и точны^10. Однако, в связи с необходимостью дополнительной реакции для количественной оценки как, А. А. и DHAA через HPLC, в некоторых исследованиях на салат,^{только АА 14} или только TAA¹¹ (без количественной оценки АА до сокращения DHAA в АА) были измерены. Кроме того, лишь немногие авторы количественно АА и DHAA, несмотря на вклад обеих молекул в антиоксидантной активности витамина С². Тем не менее, техника UPLC стала более важной в последнее время из-за его более высокой производительности при измерении витамина С в нескольких^{культурах 16}. Сравнивая результаты, полученные в этом исследовании, с двумя методологиями, UPLC и HPLC, эти преимущества были подтверждены: четко определенные пики АА благодаря более высокой чувствительности, и в очень короткие сроки, были достигнуты, что также подразумевает меньше ресурсов, потребляемых. Несмотря на эффективность UPLC, только Chen et al.^{20 применили} этот метод для измерения содержания витамина С в салате, что все еще привело к недооценке, так как была количественно оценена только форма АА.

Таким образом, эта работа представляет собой первую успешную попытку определить общее содержание витамина С не только в различных сортах салата, но и в некоторых из их диких родственников. Количественная оценка витамина С также имеет важное значение для выбора салатов с более высокой антиоксидантной активностью в рамках программ разведения. В этом смысле, увеличение общего содержания витамина С в салат диких родственников найти здесь и увеличение содержания^{АА сообщили в предыдущих исследованиях 14},^{а также других антиоксидантных соединений 21}, расширяет подходящих кандидатов для улучшения питательной ценности салатов.

В заключение, даже с некоторыми ограничениями, присущими природе витамина С, как и его постепенная деградация через несколько часов после извлечения или необходимость снижения реакции из-за низкой DHAA УФ-абсорбции, он предлагает менее трудоемкий и менее трудоемкий метод для измерения содержания витамина С. Кроме того, он также очень надежный и показывает высокую чувствительность и мощность разрешения. Кроме того, он легко может передаваться не только другим растительным материалам с незначительными изменениями или без них, но и переработанным продуктам, которые поставляют диетическое потребление витамина С человеку, что приводит к широкому спектру будущих применений в новой области тестирования на надежное качество пищевых продуктов.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы с благодарностью признаем Банк зародышевой плазмы Сарагосы (БГХЗ-СИТА, Испания) и Центр генетических ресурсов (СПГ, Вагенинген, Нидерланды) за поставку семян, необходимых для этой работы. Мы благодарим J. A. Aranjuelo, A. Castellanos и “laboratorio de valoraci’n nutritiva” от CITA за техническую поддержку и Д. Л. Гудчайлда за изучение английского языка. Эта работа финансировалась за счет проектов RTA2017-00093-00-00 от Национального института сельскохозяйственных и продовольственных исследований и технологий (INIA) и LMP164_18 от правительства Арагона; и оперативной программой ФЕДЕР Арагон 2014-2020 и Европейским социальным фондом от Европейского Союза (Grupos Consolidados A12-17R: “Grupo de investigaci’en fruticultura: caracterizaci’n, адаптацион у mejora gen’ica” и A14-17R: “Sistemas agroganaderos alimentarios sostenibles” (SAGAS) . I.M.L. был поддержан додокторантным контрактом на подготовку врачей от Министерства науки, инноваций и университетов Испании (MCIU) и Испанского государственного исследовательского агентства (AEI).

Materials

1,4-Dithiothreitol (DTT) ≥98% (Ellman′s reagent)	Roche	10197777001
10 mm f stainless steel ball	Euro Aznar Supplies S.L.	20112100
15 mL polypropylene tube for centrifuge	DeltaLab	429946
2 mL HPLC amber vial	Agilent	5190-9063
2 mL syringe with needle	DeltaLab	JS2
20 mL polypropylene tubes	Dealtalab	202840
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIS) ≥99.9% (titration)	Roche	10708976001
50 mL polypropylene tube	DeltaLab	429951
Acetic acid (CH3COOH) ≥99% purity glacial, ReagentPlus	Sigma-Aldrich	A6283
Acetonitrilo, HPLC super gradient grade (99.9+% CH3CN-0.2 µm filtrated)	Chem-lab	CL00.0189
Acquity UPLC HSS T3 column (150 mm x 2.1 mm x 1.8 µm)	Waters	186003540
Beaker 1 L, 200 mL	DeltaLab	191725, 191722
Dipotassium phosphate (KH₂PO₄)	Panreac	766384	Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium salt (EDTA x 2H2O) 99-101% assay, ACS reagent	Panreac	131669
Fisherbrand Analog MultiTube Vortexer	Thermo Fisher Scientific	15549004
Formic acid 98-100% for HPLC LiChropur	Supelco	5438040100
Freeze dryer VirTis genesis 25EL	VirTis	na
Heidolph Multi Reax mixer	Heidolph	na
Heidolph Reax top mixer	Heidolph	na
Hewlett Packard HPLC 1050 equipped with an eλ Detector	Hewlett Packard	na	Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
Hydrochloric acid (HCl) 37% purity, ACS reagent	Sigma-Aldrich	320331
L-Ascorbic acid ≥99%, ACS reagent	Sigma-Aldrich	255564
Meta-phosphoric acid (MPA) ACS reagent, chips, 33.5-36.5%	Sigma-Aldrich	239275
Methanol ≥99.9% (HPLC supergradient grade)	ChemLab	CL00.0189.2500
Micropipettes 10-1000 μL	Socorex	na
Nucleosil 120 C18 Tracer column (250 mm x 4 mm x 5 µm)	Merck (Sigma-Aldrich)	54919	Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
PTFE-silicone cap with preaperture	Agilent	5190-9067
Refrigerated centrifuge Gyrozen 1248R	Gyrozen	na
Regenerated cellulose filters 0.22 µm (13 mm)	Agilent	1015190-5108
Regenerated cellulose filters 0.45-µm (13 mm)	Labbox	SFCA-145-100	Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
Spectrophotometer Heλios β	Thermo Scientific Corporation	na
Sulfuric acid (H₂SO₄) 95.0-98.0% purity, ACS reagent	Sigma-Aldrich	258105
Ultrapure water	WasserLab	na
Ultrasons H-D	Selecta	na
Volumetric flasks 1 L, 100 mL	DeltaLab	191489, 191486
Waters Acquity UPLC H-Class equipped with a PDA eλ Detector	Waters	na

Referencias

Llorach, R., Martínez-Sánchez, A., Tomás-Barberán, F. A., Gil, M. I., Ferreres, F. Characterisation of polyphenols and antioxidant properties of five lettuce varieties and escarole. Food Chemistry. 108 (3), 1028-1038 (2008).
Carr, A. C., Frei, B. Toward a new recommended dietary allowance for vitamin C based on antioxidant and health effects in humans. American Journal of Clinical Nutrition. 69 (6), 1086-1107 (1999).
Carr, A. C., Vissers, M. C. M. Synthetic or food-derived vitamin C-Are they equally bioavailable. Nutrients. 5 (11), 4284-4304 (2013).
Lee, S. K., Kader, A. A. Preharvest and postharvest factors influencing vitamin C content of horticultural crops. Postharvest Biology and Technology. 20 (3), 207-220 (2000).
Shekhovtsova, T. N., Muginova, S. V., Luchinina, J. A., Galimova, A. Z. Enzymatic methods in food analysis: determination of ascorbic acid. Analytica Chimica Acta. 573-574, 125-132 (2006).
Zhan, L., et al. Light exposure during storage preserving soluble sugar and L-ascorbic acid content of minimally processed romaine lettuce (Lactuca sativa L.var. longifolia). Food Chemistry. 136 (1), 273-278 (2013).
Malejane, D. N., Tinyani, P., Soundy, P., Sultanbawa, Y., Sivakumar, D. Deficit irrigation improves phenolic content and antioxidant activity in leafy lettuce varieties. Food Science and Nutrition. 6 (2), 334-341 (2017).
Tarrago-Trani, M. T., Phillips, K. M., Cotty, M. Matrix-specific method validation for quantitative analysis of vitamin C in diverse foods. Journal of Food Composition and Analysis. 26 (1-2), 12-25 (2012).
Klimczak, I., Gliszczyńska-Świgło, A. Comparison of UPLC and HPLC methods for determination of vitamin C. Food Chemistry. 175, 100-105 (2015).
Złotek, U., Świeca, M., Jakubczyk, A. Effect of abiotic elicitation on main health-promoting compounds, antioxidant activity and commercial quality of butter lettuce (Lactuca sativa L.). Food Chemistry. 148, 253-260 (2014).
Koh, E., Charoenprasert, S., Mitchell, A. E. Effect of organic and conventional cropping systems on ascorbic acid, vitamin C, flavonoids, nitrate, and oxalate in 27 varieties of spinach (Spinacia oleracea L). Journal of Agricultural and Food Chemistry. 60 (12), 3144-3150 (2012).
Kałuzewicz, A., et al. The influence of short-term storage on the content of flavonoids and vitamin C in Broccoli. European Journal of Horticultural Science. 77 (3), 137-143 (2012).
van Treuren, R., van Eekelen, H. D. L. M., Wehrens, R., de Vos, R. C. H. Metabolite variation in the lettuce gene pool: towards healthier crop varieties and food. Metabolomics. 14 (11), 1-14 (2018).
Swartz, M. E. UPLC: An introduction and review. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 28 (7), 1253-1263 (2005).
Spínola, V., Mendes, B., Câmara, J. S., Castilho, P. C. An improved and fast UHPLC-PDA methodology for determination of L-ascorbic and dehydroascorbic acids in fruits and vegetables. Evaluation of degradation rate during storage. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403 (4), 1049-1058 (2012).
Ball, G. F. M. . Water-soluble vitamin assays in human nutrition. , (1994).
Bertolín, J. R., et al. Simultaneous determination of carotenoids, tocopherols, retinol and cholesterol in ovine lyophilised samples of milk, meat, and liver and in unprocessed/raw samples of fat. Food Chemistry. 257, 182-188 (2018).
Spínola, V., Llorent-Martínez, E. J., Castilho, P. C. Determination of vitamin C in foods: Current state of method validation. Journal of Chromatography A. 1369, 2-17 (2014).
Chen, Y., et al. radiation is beneficial for yield and quality of indoor cultivated lettuce. Frontiers in Plant Science. 10, 1-10 (2019).
Damerum, A., et al. Elucidating the genetic basis of antioxidant status in lettuce (Lactuca sativa). Horticulture Research. 2 (15055), 1-13 (2015).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artículo

Medina-Lozano, I., Bertolín, J. R., Zufiaurre, R., Díaz, A. Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties (Lactuca sativa L.) and Crop Wild Relatives (Lactuca spp.). J. Vis. Exp. (160), e61440, doi:10.3791/61440 (2020).