Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties (<em>Lactuca sativa</em> L.) and Crop Wild Relatives (<em>Lactuca</em> spp.)

In&#233;s Medina-Lozano; Juan  Ram&#243;n Bertol&#237;n; Raquel Zufiaurre; Aurora D&#237;az

doi:10.3791/61440

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Bioquímica

שיטת UPLC-UV משופרת לכימות ויטמין C בזני חסה(לקטוקה סאטיבה L.) וקרובי משפחה פראיים(Lactuca spp.)

Published: June 30, 2020

doi:

10.3791/61440

Inés Medina-Lozano*^1,4, Juan Ramón Bertolín*^2,4, Raquel Zufiaurre³, Aurora Díaz^1,4

¹Unidad de Hortofruticultura,Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), ²Unidad de Producción y Sanidad Animal,Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), ³Dpto Química Analítica,Escuela Politécnica Superior (Universidad de Zaragoza), ⁴Instituto Agroalimentario de Aragón – IA2 (CITA-Universidad de Zaragoza)

Summary

אנו מציגים שיטה מהירה ואמינה לכמת ויטמין C ב Lactuca spp. באמצעות UPLC-UV, פוטנציאל להעברה לצמחים אחרים. השלבים העיקריים הם הכנת המדגם וחילוץ ויטמין C בתנאים יציבים, הפחתה של חומצה דהידרואסקורבית לחומצה אסקורבית ואופטימיזציה של ההליך הכרומטוגרפי.

Abstract

ויטמינים, במיוחד ויטמין C, הם מיקרונוטריינטים חשובים שנמצאו בפירות וירקות. ויטמין C הוא גם תורם מרכזי ליכולת נוגדת החמצון שלהם. חסה הוא אחד הירקות הפופולריים ביותר בקרב צרכנים ברחבי העולם. פרוטוקול מדויק למדיסת תכולת ויטמין C חסה ומינים קשורים אחרים הוא קריטי. אנו מתארים כאן שיטה באמצעות אולטרה ביצועים גבוהים נוזלי כרומטוגרפיה אולטרה סגול (UPLC-UV) טכניקה, שבו הכנת מדגם, מיצוי ויטמין ותנאי כרומטוגרפיה היו אופטימיזציה.

דגימות נאספו כדי לייצג את הצמח כולו, קפוא ב -80 מעלות צלזיוס וlyophilized כדי למנוע חמצון לא רצוי והפוך את המניפולציה שלהם קלה יותר. החילוץ של ויטמין C בוצע בתקשורת חומצית, אשר גם תרם ליציבותו. כמו ויטמין C יכול להיות נוכח בשתי צורות שונות interconvertible, חומצה אסקורבית (AA) וחומצה dehydroascorbic (DHAA), שתי התרכובות יש למדוד לכמת מדויק. DHAA היה לכמת בעקיפין לאחר ההפחתה שלה AA כי AA מראה ספיגה גבוהה יותר מאשר DHAA בטווח UV של הספקטרום. מאותה תמצית בוצעו שתי מדידות, אחת לפני והשנייה לאחר אותה תגובת הפחתה. במקרה הראשון, כימתנו את תוכן ה-AA, ובמקרה השני כימתנו את הסכום של AA ו-DHAA (TAA: חומצה אסקורבית מוחלטת) בצורה של AA. לאחר מכן, כמות DHAA הושגה בעקיפין על ידי חיסור AA מגיע מהמדידה הראשונה מת”א. הם נקבעו על ידי UPLC-UV, באמצעות תקן AA מסחרי כדי לבנות עקומת כיול ולייטוב ההליך הכרומטוגרפי, כדי להשיג פסגות AA שנפתרו לחלוטין בזמן קצר. פרוטוקול זה יכול להיות מוערך בקלות לכל חומר צמח אחר עם שינויים קלים או ללא שינויים. הדיוק שלו חשף הבדלים משמעותיים סטטיסטית שלא ניתן היה יהיה להם. חוזקות ומגבלות אחרות נדונים לעומק בכתב היד.

Introduction

חסה מעובדת(Lactuca sativa L.) הוא אחד הירקות העלים המיוצרים והנצרכים ביותר בעולם, עם ייצור כולל של כ-27.3 מיליון טון בשנת 2018¹. חסה נתפסת כבריאה על ידי הצרכנים. המאפיינים התזונתיים מיוחסים בעיקר למקור של תרכובות נוגדות חמצון ביבול, כגון ויטמין C, בין היתר כמו פוליפנולים וויטמין E². ויטמין C הוא מיקרונוטרינט חיוני עבור בני אדם שלא כמו בעלי חוליות רבים אחרים, כפי שאנו לא יכולים לייצר אותו בשל מוטציות הנוכחי בקידוד הגן עבור אנזים השלב האחרון במסלול biosynthetic³. הוא נדרש עבור חילוף חומרים נורמלי של תאים וזה גם ממלא תפקיד חשוב בתגובות חיסוניות בעיקר בשל פעילות נוגדת חמצון שלה^3,⁴.

סה”כ ויטמין C מורכב חומצה אסקורבית (AA) וחומצה dehydroascorbic (DHAA). AA היא הצורה הפעילה ביותר מבחינה ביולוגית של הוויטמין, אבל DHAA (מוצר החמצון שלה) גם מראה פעילות ביולוגית וזה יכול בקלות להמיר AA בגוף האדם^5. לכן, לכמת את שתי הצורות חשוב לקבוע את התוכן הכולל של ויטמין C של כל יבול גננות, חסה כלולה.

מגוון רחב של גישות המבוססות על טכניקות אנליטיות שונות שימשו כדי למדוד ויטמין C בירקות, כגון אנזימטי, ספקטרופוטומטרי,^{ושיטות titrimetric 6}^,⁷^,⁸. למרות שיטות אלה הן פשוטות, הם אינם ספציפיים מבחינה כימית עבור AA⁹. כתוצאה מכך, שיטות כרומטוגרפיות מועדפות, במיוחד את ביצועים גבוהים נוזל כרומטוגרפיה אולטרה סגול (HPLC-UV) טכניקה, בגלל הדיוק הגבוה שלהם^10. HPLC-UV שימש כדי לקבוע ויטמין C במגוון גדול של יבולים, כמו ברוקולי, תרד^{וחסה 11,}^12,¹³. עם זאת, הכימות בו זמנית של AA ו DHAA מסובך בשל הספיגה הנמוכה של DHAA בטווח UV של הספקטרום. לחלופין, ניתן לקבוע DHAA בעקיפין באמצעות סוכן הפחתת הממיר DHAA ל- AA, מדידת חומצה אסקורבית מוחלטת (TAA), ולאחר מכן חישוב ההבדל בין TAA ו- AA. בשל הצורך של תגובת הפחתה, במחקרים מסוימים, רק AA כבר כמת¹⁴, אשר למעשה יכול לייצג הערכה נמוכה של פעילות ויטמין C. תגובה זו הפחתה נוספת יש צורך גם כדי לקבוע DHAA בעקיפין גם כאשר ההתקדמות האחרונה בטכניקות כרומטוגרפיה נוזלית, כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים במיוחד (UPLC), משמש. שלב זה נהנה גם מהיתרונות ש-UPLC מציגה בהשוואה ל-HPLC: יעילות ורזולוציה גבוהות יותר, רגישות מוגברת, ניתוח זמן קצר יותר וצריכת ממסים נמוכה^{יותר 15}. כתוצאה מכך, טכניקת UPLC-UV נוצלה לכמת ויטמין C בגידולים^{שונים 16}.

בנוסף, AA היא מולקולה מאוד labile; לכן, חשוב לפתח פרוטוקול המונע את השפלה שלו במהלך אחסון חסה וניתוח ויטמין C⁹. בהקשר זה, הפרוטוקול הבא מציע כימות מהירה ומשופרת של תכולת ויטמין C חסה על ידי UPLC-UV, כמו גם הליך חילוץ יעיל. לא רק cultivars האליטה נכללו במחקר הנוכחי, אלא גם landraces מסורתיים וכמה קרובי משפחה פראיים בשל העניין הפוטנציאלי שלהם גידול יבול, במיוחד בשיפור הערך התזונתי של חסה.

Protocol

1. הכנת חומר צמחי דגימה לפחות שני עלים לכל צמח בצינורות פוליפרופילן 50 מ”ל, בחוץ (מבוגר) פנימי (צעיר) אחד על מנת לייצג בצורה מדויקת יותר את הצמח כולו. אסוף לפחות שלושה משכפלים ביולוגיים עבור כל דגימה. להקפיא אותם מיד באמצעות חנקן נוזלי ולאחסן אותם ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. ודא חנקן נוזלי לא להיכנס לצינורות; אחרת הם עלולים להתפוצץ כאשר הוסרו עקב הרחבת הגז במהלך אידוי.התראה: כפפות ומגן פנים נדרשים בשל הסכנות האפשריות הקשורות לשימוש בחנקן נוזלי. מוציאים את המכסים מהצינורות וממקמים אותם על המגשים בתוך תא מייבש ההקפאהשלהליופילייזר (טבלת החומרים) המתוכנת כדלקמן: -25 °C ל-72 שעות, -10°C ל-10 שעות, 0°C ל-10 שעות ו-20 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות לפחות. שמור על טמפרטורת העיב ועל קבוע הוואקום במהלך תהליך הייבש ב-80.2°C ו-112 mTorr, בהתאמה. כאשר החומר יבש לחלוטין (בין 4 ל-7 ימים בהתאם לצמח ולדרגת הדחיסה לתוך הצינור), שמור ב- 4 °C, -20°C או -80°C למשך זמן קצר (ימים עד שבועות), אחסון בינוני (חודשים) או ארוך (שנים), בהתאמה. מומלץ להכליל שקיות המכילות חרוזי ג’ל סיליקה בצינורות המכילים דגימה. מניחים את הדגימות lyophilized לתוך 20 mL צינורות פוליפרופילן יחד עם כדורי נירוסטה בקוטר 10 מ”מ לטחון אותם עם מערבולת multitube באמצעות העוצמה והזמן הדרוש כדי להשיג אבק דק.הערה: במהלך התהליך כולו, הגן על הדגימות מפני חשיפה לאור ישיר. 2. הכנת ריאה ופתרון להכין את פתרון החילוץ ממס: 8% חומצה אצטית (v /v), 1% MPA (חומצה מטה זרחתית) (w / v), 1 mM EDTA (חומצה אתילנדיאמין טטראצטי). חשב את הנפח הכולל של ממס הדרוש כדי לעבד את כל הקבוצה של דגימות תוך לקיחת בחשבון כי 5 מ”ל יתווספו לכל אחד. כדי להכין 1 L של הפתרון, להוסיף בקבוקון: 30 גרם של MPA, 0.372 גרם של EDTA מיובש, 80 מ”ל של חומצה אצטית ו 500 מ”ל של מים אולטרה-תכליתיים (נפחים וכמויות בקנה מידה בהתאם). לאטום את הפה בקבוקון עם סרט פלסטיק. לאחר התמוססות בעזרתו של ערבוב מגנטי, השתמשו במבחנות נפחיות כדי למדוד במדויק 1 L, ולהוסיף את המים האולטרה-תכליתיים הדרושים. הכן את מאגר תגובת הפחתה (0.5 M Tris (2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) pH 9.0) והפחתת פתרון (40 mM DTT (1,4-Dithiothreitol) עם 0.5 M Tris pH 9.0). לחשב את הנפח הכולל של הפחתת הפתרון הדרוש כדי לעבד את כל הקבוצה של דגימות תוך לוקח בחשבון כי 200 μL יתווספו לכל אחד מהם. כדי להכין 100 מ”ל של המאגר, להוסיף לבקת: 6.055 גרם של Tris ו 90 מ”ל של מים אולטרה-תכליתיים (קנה מידה נפחים וכמויות בהתאם). לאטום את הפה עם סרט פלסטיק. לאחר מומס בעזרתו של ערבוב מגנטי, להתאים את הפתרון pH 9.0 על ידי הוספת 2 M HCl ולהשתמש בקבוקון נפח כדי למדוד במדויק 100 מ”ל, הוספת המים אולטרה פורים הדרושים. כדי להכין 100 מ”ל של פתרון הצמצום, הוסף לבקת: 0.629 גרם DTT (טוהר: 98%) ו- 90 מ”ל של המאגר (0.5 M Tris pH 9.0) שהוכן בעבר (2.2.1 עד 2.2.2). שנה קנה מידה של אמצעי אחסון וכמויות בהתאם. לאטום את הפה עם סרט פלסטיק. לאחר מומס בעזרתו של ערבוב מגנטי, להשתמש בקבוקון נפח כדי למדוד במדויק 100 מ”ל, הוספת הנפח הדרוש של מאגר 0.5 M Tris pH 9.0.הערה: הפתרון להפחתת אינו יציב. לכן מומלץ מאוד פתרון טרי. חומצה גופרתית (0.4 M H2 SO4) לחשב את הנפח הכולל של 0.4 M חומצה גופרתית הדרושה כדי לעבד את כל הסט של דגימות לוקח בחשבון כי 200 μL יתווספו לכל אחד. כדי להכין 100 מ”ל של הפתרון, להוסיף לבקת: 80 מ”ל של מים אולטרה-תכליתיים ולאחר מכן 2.22 מ”ל של H2SO4 (טוהר: 96%, צפיפות: 1.84 גרםמ”ל -1). השתמש בקבוקון נפח כדי למדוד במדויק 100 מ”ל, הוספת המים אולטרה תכליתיים הדרושים.התראה: חומצה גופרתית היא מאוד מאכל, אז זה חייב להיות מטופל באמצעות ציוד מגן מתחת למכסה המנוע. בנוסף, יש להוסיף את החומצה למים אולטרה-תכליתיים, ולא למים לחומצה, כדי להפחית אדים ולהימנע מתאונות. חומצה הידרוכלורית (2 M HCl). כדי להכין 100 מ”ל של חומצה הידרוכלורית 2 M, להוסיף לבקת: 80 מ”ל של מים אולטרה-תכליתיים ולאחר מכן 6.13 מ”ל של HCl (טוהר: 37%, צפיפות: 1.19 gL-1). לאטום את הפה עם סרט פלסטיק. השתמש בקבוקון נפח כדי למדוד במדויק 100 מ”ל, הוספת המים אולטרה תכליתיים הדרושים. שנה קנה מידה של אמצעי אחסון בהתאם.התראה: חומצה הידרוכלורית היא מאוד קורוזיבית, אז זה צריך להיות מטופל באמצעות ציוד מגן מתחת למכסה המנוע. בנוסף, יש להוסיף את החומצה למים אולטרה-תכליתיים, ולא למים לחומצה, כדי להפחית אדים ולהימנע מתאונות. תקן AA (מלאי ודילול) לשקול בדיוק 10 מ”ג של תקן AA (טוהר: 99%) באמצעות איזון מדויק ולהוסיף 90 מ”ל של שלב נייד (pH מים אולטרה פורה 2.0 עם חומצה פורמית). לאחר מומס בעזרתו של ערבוב מגנטי, להשתמש בקבוקון נפח כדי למדוד במדויק 100 מ”ל, הוספת הנפח הדרוש של pH מים אולטרה פורה 2.0 עם חומצה פורמית.הערה: הגן על פתרון מניות זה מפני החשיפה לאור. הכן חמישה דילולים מהמלאי של תקן AA כדי להשיג עקומת כיול בהתאם להוראות בטבלה 1 והמשך לשלב 5.2. סטנדרטי [AA] מה אתה עושה? (μg מ”ל-1) AA (100 μg מ”ל-1) פתרון(μL) שלב נייד (μL) 1 0.5 5 995 2 2.5 25 975 3 5 50 950 4 10 100 900 5 25 250 750 a מים אולטרה פוריים pH 2.0 חומצי על ידי חומצה פורמית. טבלה 1: פרוטוקול להכנת חמישה סטנדרטים של AA (חומצה אסקורבית). כרכים של solute וממס כדי להכין כל אחד מהריכוזים השונים של הסטנדרטים מצוינים. 3. חילוץ של AA ו-DHAA הערה: מומלץ לעבוד בתנאים של עוצמת אור נמוך במהלך שלבי החילוץ. לצינור צנטריפוגה פוליפרופילן 15 מ”ל, להוסיף 50 מ”ג של דגימת קרקע lyophilized ו 5 מ”ל של ממס החילוץ (שלב 2.1). מנערים את התערובת בעזרת מערבולת של 5 שניות ולאחר מכן שייקר מסלולי במשך 10 דקות ב-2000 סל”ד. להציג את הצינור באמבט אולטראסוניות במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם אולטרסאונד מופעל. צנטריפוגה ב 4,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° C. קח את supernatant, להעביר אותו דרך 0.22 μm מחדש תאית מסנן ולאחסן אותו בקבוקון ענבר 5 מ”ל. זוהי תמצית 1, המכילה AA ו- DHAA.הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן על ידי הקפאת תמציות ב -80 °C והגנה עליהם מפני חשיפה לאור כמו AA ו DHAA הם מאוד לא יציבים ומשפילים בקלות בנוכחות אור, בטמפרטורות גבוהות או תחת אטמוספרהחמצון (קובץ משלים 1). 4. הפחתה DHAA AA לחלץ TAA להעביר 200 μL של תמצית 1 בקבוקון ענבר 2 מ”ל עבור כרומטוגרפיה נוזלית ולהוסיף 200 μL של הפתרון הפחתת (שלב 2.2). סגור את הבקבוקון עם תקע PTFE-סיליקון עם פתיחה מוקדמת ולנער אותו עם מערבולת עבור 5 s. אפשר לפתרון לעמוד במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ולהגן מפני אור. להוסיף 200 μL של 0.4 M H2 SO4 כדי לעצור את התגובה ולייצב AA בחומציות pH. הפתרון שנוצר הוא תמצית 2, המכילה רק AA והוא למעשה TAA. 5. נחישות הכנת UPLC-UV הכן את פתרונות העבודה המתוארים בטבלה 2, מסוננים בהתאם באמצעות מסנני 0.22 μm, sonicated למשך 10 דקות לפחות והמקם אותם במערכת UPLC. הפעל את שלושת מודולי UPLC והמתן לסיום תהליך הכיול הפנימי. פתח את התוכנה (לדוגמה, העצם 3) וטען את התוכנית האינסטרומנטלית המתוארת בטבלה 2: העצם 3 | הפעל דוגמאות | שיטת ויטמין C | UPLC_PDA | השתמש ב’התחלה מהירה’. לאחר טעינת התוכנה עם התוכנית הנכונה, גישה למסוף הניהול של UPLC: מנהל ממסים Quaternary | לחץ על לחצן העכבר הימני | הפעל מסוף. המשך להכנה וייצוב של מכשיר UPLC: מערכת | בקרה | אתחול. טהר את כל קווי UPLC למשך 5 דקות לפחות: ממיסים ראשוניים | QSM | בדיקת שטיפת ים A, B, C, D ו- Seal | משך הפריים > 5 דקות. נקה ונקה את המזרק: ממיסים ראשוניים | SM | בדוק ממיס לשטוף (> 45 s) ובדוק ממס טיהור (> 35 מחזורים). לשוויון UPLC לתנאי השיטה: שיוויון לשיטה | QSM | זרימה (0.3 מ”ל מינימום-1)| ממס A (2%) | ממס B (0%) | ממס C (98%) | ממס D (0%) שוויון לשיטה | SM | דוגמה (5 °C) | עמוד (30 °C) ו- Equilibrate לשיטה | אחרים | בדוק מנורה על | לחץ על התחל. המתן לפחות 1 שעה (אפילו יותר זמן מומלץ) עבור הציוד לייצב. ניתן לאמת את היציבות בבדיקת הלחץ בעמודה במסוף ההפעלה: מערכת | מנהל ממסים קווטרנריים | לחץ מערכת QSM. ודא שאין מגמות הניתנות לזיהוי בשינויי לחץ (עליות או ירידות) וערך הדלתא קטן מ- 10 psi. במסך QuickStart, מלא את המטריצה בשמות הסטנדרטים והדוגמאות שיש לנתח. קביעת AA בסטנדרטים העבר 1 מ”ל מכל אחד מחמשת תקני AA שהוכנו בעבר (שלב 2.5.3) ל-2 בקבוקונים ענבר מ”ל עבור כרומטוגרפיה נוזלית. סגור את הבקבוקון עם תקע PTFE-סיליקון עם פתיחה מראש והזרק 5 μL במכשיר UPLC. לבצע את הכרומטוגרפיה בעקבות ההליך המתואר בטבלה 2 החל מדולל ביותר לריכוז ביותר. קביעת AA בדגימות פיפטה 200 μL של תמצית 1 ב בקבוקון ענבר 2 מ”ל עבור כרומטוגרפיה נוזלית ולהוסיף 800 μL של מים אולטרה פורים. סגור את הבקבוקון עם תקע PTFE-סיליקון עם פתיחה מראש והזרק 5 μL במכשיר UPLC. ביצוע הכרומטוגרפיה לאחר ההליך המתואר בטבלה 2. קביעת ת”א בדגימות להוסיף 400 μL של מים אולטרה פורים לחלץ 2. סגור את הבקבוקון עם תקע PTFE-סיליקון עם פתיחה מראש והזרק 5 μL במכשיר UPLC. ביצוע הכרומטוגרפיה לאחר ההליך המתואר בטבלה 2. רכיבים ופרמטרים תיאור כלי זיכוי UPLC H-קלאס גלאי מחשבי כף יד eρ גלאי עבור AA = 245 נה”מ תוכנה העצם 3 עמודה זיכוי UPLC HSS T3 (150 מ”מ x 2.1 מ”מ x 1.8 μm) ערוץ א’ CH3הו ערוץ B/Wash H2O:CH3OH (50:50 v:v) ערוץ ג’ מים אולטרה פוריים pH 2.0 חומצי על ידי חומצה פורמיתa ערוץ D/אטם לשטוף מים אולטרה פורים:אצטוניטריל (90:10 v:v) שלב נייד 0.3 מ”למינימום -1 מתוך 2%A + 98%C (מצב אי-קרטטי) טמפרטורת עמודה 30°C טמפרטורת התועמלות האוטומטית 10° צלזיוס נפח הזרקה 5 μL זמן שמירה AA 1.874 דקות זמן ריצה 3 דקות a נפח לא מוגדר של חומצה נפחית formic המשמש עד התאמת pH טבלה 2: הליך כרומטוגרפי הממוטב כדי לקבוע AA (חומצה אסקורבית) בתמציות של חסה וקרובי משפחה פראיים. תיאור הרכיבים, התנאים והפתרונות המועסקים. 6. כימות AA ו-DHAA ניתוח סטטיסטי לקבוע את הפרמטרים האנליטיים של השיטה הכרומטוגרפית כפי שתואר על ידי Bertolín ואח ’18 (טבלה 3).הערה: יש להגדיר את ערכי הפרמטרים המוצגים בטבלה 3 בתנאים ניסיוניים ספציפיים. פרמטרים אנליטיים של השיטה ערכים טווח ליניארי (μg mL-1) 0.5-25 משוואה ליניארית y= 53,143.03x ת”א 35 0.99998 מגבלת זיהוי (מ”ג AA g-1 של חומר יבש) 0.013 מגבלת כימות (מ”ג AA g-1 של חומר יבש) 0.045 יכולת חזרה (קורות חיים,%) 1.75 דיוק ביניים (CV,%) 4.22 שחזור (Rec,%) 23:00:00 – ± a קורות חיים: מקדם וריאציה ב. התאוששות תוואי בוצע עם 10 aliquots המכיל 50 מ”ג של אותה מדגם, 5 זינק עם 2 מ”ג של AA g-1 של חומר יבש, ו 5 לא זינק. %rec=([AA]זינק מדגם-[AA]לדוגמה)/([AA]זינק)x100. טבלה 3: פרמטרים אנליטיים ממוטבים לזיהוי וכמות של AA (חומצה אסקורבית) ו-TAA (חומצה אסקורבית כוללת). הטווח ליניארי, המשוואה ומקדם הקביעה של עקומת הכיול (R2),כמו גם מגבלות הזיהוי והכימות של AA (זהה ל-TAA), ויכולת חזרה, דיוק ביניים והתאוששות הושגו עם נפח הזרקה לדוגמה של 5 μL. חשב את ריכוז AA ו- TAA. פתח את הכרומטורמות הרגילות והמדגם: QuickStart | עיין בפרוייקט | ערוצי | “שם של תקן או דוגמה” | מחשב כף יד Ch1 245 nm@1.2 נה”מ. שלב את הפסגה המתאימה (AA או TAA) בתקנים ובדוגמאות על-ידי לחיצה על נקודת ההתחלה שלו (כ- 1.790 דקות) וגרירתה עם העכבר לנקודת הסיום שלו (כ- 1.910 דקות). בנה עקומת כיול המייצגת את ערכי הספיגה שנקבעו כרומטוגרפית (שלב 5.2) כנגד ריכוז חמשת תקני ה-AA שהוכנולעיל (טבלה 1). אינטרפול ערכי הספיגה של הדגימות שנקבעו בשלבים 5.3 ו- 5.4 והשג את ריכוז AA ו-TAA, בהתאמה, עם הנוסחה הבאה:כאשר y הוא אזור השיא המשולב, x הוא AA או ריכוז TAA בppm ו m ו- n הם המדרון ו- y-יירוט של קו רגרסיה שהושג, בהתאמה. לחישוב הריכוז של DHAA, החל את הנוסחה הבאה:הערה: כדי להשיג את הריכוזים הכוללים של DHAA, AA ו- TAA ב מ”ג-1 של משקל יבש, הערכים שהושגו ישירות אינטרפולציה בעקומת הכיול יצטרכו להיות מוכפלים על ידי נפח התמצית הכולל ואת גורם דילול מוחל, ולאחר מכן מחולק על ידי המשקל של המדגם המשמש לביצוע החילוץ.

Representative Results

כימות ויטמין C במטריצות לקטוקה דורשת פיתוח של גישה כרומטוגרפית שיכולה להבטיח תוצאות אמינות. איור 1א מציג כרומטוגרמה הנובעת מפרוטוקול לא ממוטב(קובץ משלים 2),המציג שיא AA יחד עם “כתף” קטנה לא מזוהה. אף על פי כן, לאחר שיפור החילוץ ותנאים כרומטוגרפיים, שיא AA נפתר ללא הפרעות של תרכובות לא ידועות הושג(איור 1B). בנוסף, השימוש בציוד UPLC-UV במקום HPLC-UV אפשר לנו להפחית את זמן השמירה (RT) עבור AA: 1.874 דקות כרומטוגרמות ממוטבות לעומת 2.980 דקות בפרוטוקולים שאינם ממוטבים(איור 1), כמו גםאת זמני הריצה, 3 ו-7 דקות עבור הפרוטוקולים הממוטבים ולא ממוטבים, בהתאמה. איור 1: כרומטוגרמות של AA באותה דגימת חסה (cultivar מסחרי ‘Begoña’). (A) כרומטוגרמה HPLC-UV הנובעת פרוטוקול לא ממוטב (תנאים המתוארים בקובץ משלים 2). (ב)כרומטוגרמה UPLC-UV שהושגה עם הפרוטוקול הממוטב (תנאים המתוארים בטבלה 2). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. הפרעות בפסגות AA, כמו אלה שנצפו בדמות 1A, גרמו באופן עקבי להמעיט בערך הוויטמין C (AA, DHAA ו-TAA) בשל הפרדה לא מספקתבמהלךהתהליך הכרומטוגרפי, כאשר אזורי השיא החופפים שולבו על ידי ירידה אנכית בנקודה העמוקה ביותר ביניהם. הטיה זו בולטת במיוחד במקרה של קרובי משפחה פראיים יבול, במיוחד בתוכן DHAA ו TAA (איור 2). איור 2: הפצת תכולת ויטמין C. חלקות כינור מפוצלות של תוכן DHAA, AA ו-TAA(מ”ג-1 במשקל יבש) בזני חסה מסחריים ומסורתיים וכמה קרובי משפחה פראיים באמצעות פרוטוקולים לא ממוטבים וממוטבים. קווים שחורים מציגים את ערכי ממוצע. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. יתר על כן, השימוש בפרוטוקול לא ממוטב מנע מאיתנו לחלץ כל מסקנה שימושית מהתוצאות כפי שהם הראו את כל הדגימות, שני סוגי חסה וקרובי משפחה פראיים, בעל תוכן ויטמין C דומה. לעומת זאת, הפרוטוקול הממוטב אפשר לנו לזהות הבדלים משמעותיים סטטיסטית ביניהם עבור תוכן DHAA ו-TAA(טבלה 4),העשירים ביותר הם מיני הבר (איור 2). לא ממוטב ממוטב יחס F p- ערך יחס F p- ערך תפריט: אה לה לה 4 0.460 0.637ns 5.613 0.009** Aa 0.070 0.932ns 1.020 0.374ns ת”א (ת” 0.015 0.985ns 4.438 0.022* ns, * ו- ** מציינים לא משמעותי ומשמעותי ב- p<0.05 ו- 0.01, בהתאמה. טבלה 4: וריאציה בתוכן של ויטמין C. יחסי F (מנה של שתי שונות, השונות בין הקבוצה והשונות בתוך הקבוצה) וערכי משמעות מ- ANOVA חד-כיוון בהתחשב בסוג Lactuca (זני חסה מסחריים, זני חסה מסורתיים וקרובי משפחה פראיים) עבור תוכן DHAA, AA ו-TAA בפרוטוקולים לא ממוטבים וממוטבים. קובץ משלים 1: יציבות AA ו-TAA ב- 5 °C מעל 24 שעות. (A) אזורי שיא AA ו- TAA לאורך 24 שעות (ב)AA ו- TAA תוכן (מ”גg -1 של משקל יבש) לאורך 24 שעות. מייצגים את סטיות התקן של שני משכפלים טכניים (n=2) השמורים במשכך האוטומטי ב- 5°C ומוגנים מפני חשיפה לאור. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. קובץ משלים 2: ההבדלים העיקריים בין הפרוטוקול הממוטב לפרוטוקול שאינו ממוטב עבור חילוץ מכמת מכמת של ת”א, AA ו-DHAA. הדגימות בהן נעשה שימוש היו זהות בשני המקרים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

ויטמין C הוא חומר מומר חשוב מאוד, אבל זה תרכובת מאוד labile מדי, כך כימות UPLC-UV שלה תלוי בגורמים מרובים, כגון אחסון והכנה מדגם, שיטת החילוץ ותנאים כרומטוגרפיים. לכן, הליך מהיר ופשוט כדי למנוע חמצון AA (עם כוח נוגד חמצון) DHAA (ללא תכונות נוגדות חמצון) היה צורך. זה היה גם קריטי כדי למנוע pH גבוה ותנאי טמפרטורה, כמו גם אור אינטנסיבי ואווירה חמצון במהלך טיפול מדגם כדי לקדם את היציבות של המתחם.

כדי למזער חמצון AA, ננקטו הצעדים הבאים. קודם כל, הדגימות היו lyophilized כחומר התחלתי עבור שני הפרוטוקולים כדי להבטיח כימות מדויקת של תוכן ויטמין C ולטפל בקלות דגימות. אפשרות זו העדיפה על פני שחיקה עדינה, הנפוצה^{לאורך הספרות 19}, כמו האבק מפשיר מהר מאוד כך המים הופכים זמינים שוב. במהלך הליך החילוץ, נפח גבוה יותר של פתרון חומצי יותר (8% חומצה אצטית ו-1% MPA) שימש כתמצית בפרוטוקול האופטימלי(קובץ משלים 2),שגם שימש כמייצב על ידי מניעת השפלה של AA. פתרון זה הכיל גם EDTA כסוכן chelating כדי להגדיל^{את ייצוב 16}, בניגוד לחילוץ בפרוטוקול לא ממוטב (קובץ משלים 2). יתר על כן, בדקנו אם הליך החילוץ יכול להיות משופר באמצעות שתי עקירות רצופות עם 2.5 מ”ל של מיצוי במקום אחד עם 5 מ”ל ותחת אטמוספרה N_{2 במקום} התנאים האטמוספריים הסטנדרטיים. התוצאות הטובות ביותר הושגו באמצעות חילוץ אחד בלבד תחת אטמוספרה לא שונה, אשר פישט את הפרוטוקול על ידי ביצוע שלבים נוספים מיותרים (הנתונים לא מוצגים). שינויים קלים אחרים הוכנסו גם בפרוטוקול כדי לשפר את החילוץ (כלומר, sonication), להשיג תמצית ברורה יותר (סינון חכם יותר) ולהפחית את משך הפרוטוקול(קובץ משלים 2). לגבי התנאים הכרומטוגרפיים, האימות של השיטה בוצע כפי^{שדווח לפני 18}, הבטחת פרמטרים אנליטיים טובים(טבלה 3). חוץ מזה, השימוש במים אולטרה-פוריים עם חומצה פורמית (pH 2.0) ומתנול (98:2 v:v) עם זרימה של 0.3 מ”ל^{מינימום -1,} במקום מונופוטאסיום פוספט 30 מ”ר (pH 3.0) ב 1 מ”ל^{מינימום -1 כשידר} נייד(קובץ משלים 2),הביא בשיטה משופרת. ההתקדמות החשובה ביותר הייתה ככל הנראה באמצעות מערכת UPLC במקום HPLC, אשר אפשרה לנו שליטה רבה יותר של תנאי השפעה (כמו הטמפרטורה) וכתוצאה מכך נפתרו פסגות AA ללא הפרעות על ידי תרכובות לא ידועות, בזמן קצר יותר וצריכת פחות נפח שלתמצית (קובץ משלים 2).

עם זאת, ישנן שתי מגבלות עיקריות של שיטה זו. הראשון הוא כי DHAA לא ניתן למדוד ישירות באמצעות גלאי UV בשל ספיגתו הנמוכה בטווח UV של הספקטרום. חשוב לכמת את תוכן DHAA כי הוא מציג פעילות ביולוגית מסוימת והוא בקלות להמרה AA בגוף האדם^5. כך נדרשת תגובה נוספת לצמצום DHAA ל-AA, יחד עם ריצה כרומטוגרפית שנייה על מנת למדוד את ת”א ולאחר מכן לקבוע את DHAA בעקיפין על-ידי חיסור תוכן AAמת”א (איור 3). במובן זה, שלב ההפחתה כבר אופטימיזציה באמצעות ריכוז גבוה יותר של סוכן הפחתת (DTT), הגדלת זמן התגובה מ 5 כדי 30 דקות, ולעצור את התגובה עם חומצה גופרתית(קובץ משלים 2). היציבות הנמוכה של AA מהווה את המגבלה השנייה של השיטה. כמו AA מתחיל להשפיל 4 שעות לאחר החילוץ(קובץ משלים 1),יש צורך לכמת אותו במרווח זמן זה. לכן, מספר הדגימות לחלץ מותנה על ידי ההליך הכרומטוגרפי. לכן אנו מציעים להקפיא אותם בשלב זה בפרוטוקול זה, אם כי במקרה זה, לא כולם יכולים להיות ממוקמים בsampler האוטומטי UPLC להימדד באופן אוטומטי. למרבה המזל, RT מופחת עבור AA אפשרה לנו להשיג 3 דקות כרומטוגרם, הרבה יותר קצר מאשר 7 דקות כרומטוגרם שהושג באמצעות HPLC(קובץ משלים 2). לפיכך, ניתן לקבוע תכולת ויטמין C במספר גבוה של דגימות בחלון של 4 שעות.

איור 3: זרימת עבודה של כימות ויטמין C חסה וכמה קרובי משפחה פראיים.
דיאגרמה סכמטית של הפרוטוקול הממוטב המציגה שני ענפים לקביעת AA או AA בלבד + DHAA (TAA). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

כמו ויטמין C הוא חומר מתזונה חיוני עבור בני אדם בשל היתרונות הבריאותיים החשובים שלה, זה הפך להיות האובייקט של מחקרים רבים. לכן, הוא כבר מכמת במגוון רחב של יבולים, כולל חסה, אחד הירקות הנצרכים ביותר ברחבי העולם. שיטות קלאסיות פשוטות הוחלפו בהדרגה על ידי טכניקות כרומטוגרפיה נוזלית כי הם ספציפיים יותר^{ומדויקים 10}. עם זאת, בשל הצורך בתגובה נוספת לכמת את שניהם, AA ו DHAA באמצעות HPLC, במחקרים מסוימים על חסה, רק AA¹⁴ או רק TAA¹¹ (מבלי לכמת AA לפני הפחתה של DHAA לתוך AA) נמדדו. יתר על כן, רק כמה מחברים יש לכמת AA ו DHAA, למרות התרומה של שתי מולקולות לפעילות נוגדת חמצון ויטמין C². אף על פי כן, טכניקת UPLC הפכה חשובה יותר בתקופה האחרונה בשל הביצועים הגבוהים שלה בעת מדידת ויטמין C במספר יבולים¹⁶. השוואת התוצאות שהתקבלו במחקר זה עם שתי מתודולוגיות, UPLC ו- HPLC, יתרונות אלה אושרו: פסגות AA מוגדרות היטב הודות לרגישות גבוהה יותר, ובזמנים קצרים מאוד, הושגו, אשר גם מרמז על פחות משאבים נצרכו. למרות יעילות UPLC, רק חן ואח ‘.^{20 יישמו טכניקה} זו כדי למדוד את תכולת ויטמין C חסה, אשר עדיין הוביל הערכה נמוכה כמו רק טופס AA היה לכמת.

לסיכום, עבודה זו מייצגת את הניסיון המוצלח הראשון לקבוע את תכולת ויטמין C הכוללת לא רק בזני חסה שונים, אלא גם בחלק מקרוביהם הפראיים. כימות ויטמין C חיונית גם לבחירת חסה עם פעילות נוגדת חמצון גבוהה יותר בתוך תוכניות רבייה. במובן זה, תכולת ויטמין C הכוללת המוגברת של קרובי משפחה פראיים חסה נמצא כאן ואת תוכן AA מוגברת^{שדווחה במחקרים קודמים 14}, כמו גם תרכובות נוגדות חמצון^{אחרות 21}, מרחיב את המועמדים המתאימים כדי לשפר את הערך התזונתי של חסה.

לסיכום, אפילו עם כמה מגבלות הטמונות בטבעו של ויטמין C, כמו ההשפלה ההדרגתית שלה כמה שעות לאחר שחולץ או הצורך בתגובת הפחתה בשל DHAA נמוך UV-ספיגה, הוא מציע פחות עבודה אינטנסיבית ושיטה פחות זמן רב כדי למדוד תוכן ויטמין C. בנוסף, הוא גם חזק מאוד ומראה רגישות גבוהה וכוח של רזולוציה. יתר על כן, זה ניתן להעברה בקלות לא רק לחומרים צמחיים אחרים עם שינויים קלים או ללא שינויים, אלא גם מוצרים מעובדים המספקים את הצריכה התזונתית של ויטמין C לבני אדם, אשר גורם למגוון רחב של יישומים עתידיים בתחום המתעוררים של בדיקות לאיכות מזון אמינה.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מכירים בהכרת תודה בבנק החיידקים ירקות של סרגוסה (BGHZ-CITA, ספרד) והמרכז למשאבים גנטיים (CNG, Wageningen, הולנד) לאספקת הזרעים הדרושים לעבודה זו. אנו מודים J.A. A. Aranjuelo, א. Castellanos ו “מעבדה דה valoración nutritiva” מ CITA לתמיכה טכנית D.L. גודצ’יילד לסקירת השפה האנגלית. עבודה זו מומנה על ידי הפרויקטים RTA2017-00093-00-00-00 מהמכון הלאומי לחקלאות ומזון מחקר וטכנולוגיה (INIA) LMP164_18 מ ממשלת אראגון; ועל ידי התוכנית התפעולית FEDER Aragón 2014-2020 והקרן החברתית האירופית מהאיחוד האירופי [Grupos Consolidados A12-17R: “Grupo de investigación en fruticultura: caracterización, adaptación y mejora genéica” ו- A14-17R: “סיסטמאס אגרוגנאדרו alimentarios sostenibles” (SAGAS)]. I.M.L. נתמך על ידי חוזה קדם-רופא להכשרת רופאים ממשרד המדע הספרדי, חדשנות ואוניברסיטאות (MCIU) וסוכנות המחקר הממלכתית הספרדית (AEI).

Materials

1,4-Dithiothreitol (DTT) ≥98% (Ellman′s reagent)	Roche	10197777001
10 mm f stainless steel ball	Euro Aznar Supplies S.L.	20112100
15 mL polypropylene tube for centrifuge	DeltaLab	429946
2 mL HPLC amber vial	Agilent	5190-9063
2 mL syringe with needle	DeltaLab	JS2
20 mL polypropylene tubes	Dealtalab	202840
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIS) ≥99.9% (titration)	Roche	10708976001
50 mL polypropylene tube	DeltaLab	429951
Acetic acid (CH3COOH) ≥99% purity glacial, ReagentPlus	Sigma-Aldrich	A6283
Acetonitrilo, HPLC super gradient grade (99.9+% CH3CN-0.2 µm filtrated)	Chem-lab	CL00.0189
Acquity UPLC HSS T3 column (150 mm x 2.1 mm x 1.8 µm)	Waters	186003540
Beaker 1 L, 200 mL	DeltaLab	191725, 191722
Dipotassium phosphate (KH₂PO₄)	Panreac	766384	Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium salt (EDTA x 2H2O) 99-101% assay, ACS reagent	Panreac	131669
Fisherbrand Analog MultiTube Vortexer	Thermo Fisher Scientific	15549004
Formic acid 98-100% for HPLC LiChropur	Supelco	5438040100
Freeze dryer VirTis genesis 25EL	VirTis	na
Heidolph Multi Reax mixer	Heidolph	na
Heidolph Reax top mixer	Heidolph	na
Hewlett Packard HPLC 1050 equipped with an eλ Detector	Hewlett Packard	na	Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
Hydrochloric acid (HCl) 37% purity, ACS reagent	Sigma-Aldrich	320331
L-Ascorbic acid ≥99%, ACS reagent	Sigma-Aldrich	255564
Meta-phosphoric acid (MPA) ACS reagent, chips, 33.5-36.5%	Sigma-Aldrich	239275
Methanol ≥99.9% (HPLC supergradient grade)	ChemLab	CL00.0189.2500
Micropipettes 10-1000 μL	Socorex	na
Nucleosil 120 C18 Tracer column (250 mm x 4 mm x 5 µm)	Merck (Sigma-Aldrich)	54919	Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
PTFE-silicone cap with preaperture	Agilent	5190-9067
Refrigerated centrifuge Gyrozen 1248R	Gyrozen	na
Regenerated cellulose filters 0.22 µm (13 mm)	Agilent	1015190-5108
Regenerated cellulose filters 0.45-µm (13 mm)	Labbox	SFCA-145-100	Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
Spectrophotometer Heλios β	Thermo Scientific Corporation	na
Sulfuric acid (H₂SO₄) 95.0-98.0% purity, ACS reagent	Sigma-Aldrich	258105
Ultrapure water	WasserLab	na
Ultrasons H-D	Selecta	na
Volumetric flasks 1 L, 100 mL	DeltaLab	191489, 191486
Waters Acquity UPLC H-Class equipped with a PDA eλ Detector	Waters	na

Referencias

Llorach, R., Martínez-Sánchez, A., Tomás-Barberán, F. A., Gil, M. I., Ferreres, F. Characterisation of polyphenols and antioxidant properties of five lettuce varieties and escarole. Food Chemistry. 108 (3), 1028-1038 (2008).
Carr, A. C., Frei, B. Toward a new recommended dietary allowance for vitamin C based on antioxidant and health effects in humans. American Journal of Clinical Nutrition. 69 (6), 1086-1107 (1999).
Carr, A. C., Vissers, M. C. M. Synthetic or food-derived vitamin C-Are they equally bioavailable. Nutrients. 5 (11), 4284-4304 (2013).
Lee, S. K., Kader, A. A. Preharvest and postharvest factors influencing vitamin C content of horticultural crops. Postharvest Biology and Technology. 20 (3), 207-220 (2000).
Shekhovtsova, T. N., Muginova, S. V., Luchinina, J. A., Galimova, A. Z. Enzymatic methods in food analysis: determination of ascorbic acid. Analytica Chimica Acta. 573-574, 125-132 (2006).
Zhan, L., et al. Light exposure during storage preserving soluble sugar and L-ascorbic acid content of minimally processed romaine lettuce (Lactuca sativa L.var. longifolia). Food Chemistry. 136 (1), 273-278 (2013).
Malejane, D. N., Tinyani, P., Soundy, P., Sultanbawa, Y., Sivakumar, D. Deficit irrigation improves phenolic content and antioxidant activity in leafy lettuce varieties. Food Science and Nutrition. 6 (2), 334-341 (2017).
Tarrago-Trani, M. T., Phillips, K. M., Cotty, M. Matrix-specific method validation for quantitative analysis of vitamin C in diverse foods. Journal of Food Composition and Analysis. 26 (1-2), 12-25 (2012).
Klimczak, I., Gliszczyńska-Świgło, A. Comparison of UPLC and HPLC methods for determination of vitamin C. Food Chemistry. 175, 100-105 (2015).
Złotek, U., Świeca, M., Jakubczyk, A. Effect of abiotic elicitation on main health-promoting compounds, antioxidant activity and commercial quality of butter lettuce (Lactuca sativa L.). Food Chemistry. 148, 253-260 (2014).
Koh, E., Charoenprasert, S., Mitchell, A. E. Effect of organic and conventional cropping systems on ascorbic acid, vitamin C, flavonoids, nitrate, and oxalate in 27 varieties of spinach (Spinacia oleracea L). Journal of Agricultural and Food Chemistry. 60 (12), 3144-3150 (2012).
Kałuzewicz, A., et al. The influence of short-term storage on the content of flavonoids and vitamin C in Broccoli. European Journal of Horticultural Science. 77 (3), 137-143 (2012).
van Treuren, R., van Eekelen, H. D. L. M., Wehrens, R., de Vos, R. C. H. Metabolite variation in the lettuce gene pool: towards healthier crop varieties and food. Metabolomics. 14 (11), 1-14 (2018).
Swartz, M. E. UPLC: An introduction and review. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 28 (7), 1253-1263 (2005).
Spínola, V., Mendes, B., Câmara, J. S., Castilho, P. C. An improved and fast UHPLC-PDA methodology for determination of L-ascorbic and dehydroascorbic acids in fruits and vegetables. Evaluation of degradation rate during storage. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403 (4), 1049-1058 (2012).
Ball, G. F. M. . Water-soluble vitamin assays in human nutrition. , (1994).
Bertolín, J. R., et al. Simultaneous determination of carotenoids, tocopherols, retinol and cholesterol in ovine lyophilised samples of milk, meat, and liver and in unprocessed/raw samples of fat. Food Chemistry. 257, 182-188 (2018).
Spínola, V., Llorent-Martínez, E. J., Castilho, P. C. Determination of vitamin C in foods: Current state of method validation. Journal of Chromatography A. 1369, 2-17 (2014).
Chen, Y., et al. radiation is beneficial for yield and quality of indoor cultivated lettuce. Frontiers in Plant Science. 10, 1-10 (2019).
Damerum, A., et al. Elucidating the genetic basis of antioxidant status in lettuce (Lactuca sativa). Horticulture Research. 2 (15055), 1-13 (2015).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artículo

Medina-Lozano, I., Bertolín, J. R., Zufiaurre, R., Díaz, A. Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties (Lactuca sativa L.) and Crop Wild Relatives (Lactuca spp.). J. Vis. Exp. (160), e61440, doi:10.3791/61440 (2020).