Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties (<em>Lactuca sativa</em> L.) and Crop Wild Relatives (<em>Lactuca</em> spp.)

In&#233;s Medina-Lozano; Juan  Ram&#243;n Bertol&#237;n; Raquel Zufiaurre; Aurora D&#237;az

doi:10.3791/61440

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Bioquímica

Amélioration de la méthode UPLC-UV pour la quantification de la vitamine C dans les variétés delaitue (Lactuca sativa L.) et Crop Wild Relatives(Lactuca spp.)

Published: June 30, 2020

doi:

10.3791/61440

Inés Medina-Lozano*^1,4, Juan Ramón Bertolín*^2,4, Raquel Zufiaurre³, Aurora Díaz^1,4

¹Unidad de Hortofruticultura,Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), ²Unidad de Producción y Sanidad Animal,Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), ³Dpto Química Analítica,Escuela Politécnica Superior (Universidad de Zaragoza), ⁴Instituto Agroalimentario de Aragón – IA2 (CITA-Universidad de Zaragoza)

Summary

Nous présentons une méthode rapide et fiable pour quantifier la vitamine C dans Lactuca spp. en utilisant UPLC-UV, potentiellement transférable à d’autres plantes. Les étapes clés sont la préparation de l’échantillon et l’extraction de la vitamine C dans des conditions stables, la réduction de l’acide déshydroascorbique à l’acide ascorbique et l’optimisation de la procédure chromatographique.

Abstract

Les vitamines, en particulier la vitamine C, sont d’importants micronutriments que l’on retrouve dans les fruits et légumes. La vitamine C est également un contributeur majeur à leur capacité antioxydante. La laitue est l’un des légumes les plus populaires parmi les consommateurs du monde entier. Un protocole précis pour mesurer la teneur en vitamine C de la laitue et d’autres espèces apparentées est crucial. Nous décrivons ici une méthode utilisant la technique ultra-haute performance chromatographie-ultraviolette liquide (UPLC-UV), dans laquelle les conditions de préparation d’échantillons, d’extraction de vitamines et de chromatographie ont été optimisées.

Des échantillons ont été prélevés pour représenter l’ensemble de la plante, congelée à -80 °C et lyophilisée pour prévenir l’oxydation indésirable et faciliter leur manipulation. L’extraction de la vitamine C a été effectuée dans les médias acides, ce qui a également contribué à sa stabilité. Comme la vitamine C peut être présente sous deux formes interconvertibles différentes, l’acide ascorbique (AA) et l’acide déshydroascorbique (DHAA), les deux composés doivent être mesurés pour une quantification précise. Le DHAA a été quantifié indirectement après sa réduction à AA parce que l’AA montre une absorptivity plus élevée que DHAA dans la gamme UV du spectre. À partir du même extrait, deux mesures ont été effectuées, une avant et une après cette réaction de réduction. Dans le premier cas, nous quantifiions la teneur en AA, et dans le second, nous avons quantifié la somme d’AA et de DHAA (TAA : acide ascorbique total) sous forme d’AA. Ensuite, la quantité de DHAA a été obtenue indirectement en soustrayant aa provenant de la première mesure de TAA. Ils ont été déterminés par UPLC-UV, en utilisant une norme commerciale AA pour construire une courbe d’étalonnage et d’optimiser la procédure chromatographique, pour obtenir des pics AA qui ont été complètement résolus en peu de temps. Ce protocole pourrait être facilement extrapolé à tout autre matériau végétal avec des changements légers ou nuls. Son exactitude a indiqué des différences statistiquement significatives autrement non perçues. D’autres points forts et limitations sont discutés plus en profondeur dans le manuscrit.

Introduction

La laitue cultivée(Lactuca sativa L.) est l’un des légumes feuillus les plus produits et consommés dans le monde, avec une production totale d’environ 27,3 millions de tonnes en 2018¹. La laitue est perçue comme saine par les consommateurs. Les propriétés nutritionnelles sont principalement attribuées à la source de composés antioxydants dans la culture, tels que la vitamine C, entre autres comme les polyphénols et la vitamine E². La vitamine C est un micronutriment essentiel pour l’homme contrairement à beaucoup d’autres vertébrés, car nous sommes incapables de le produire en raison de mutations présentes dans le codage génétique pour l’enzyme de dernière étape dans la voie biosynthétique³. Il est nécessaire pour un métabolisme cellulaire normal et il joue également un rôle important dans les réponses immunitaires principalement en raison de son activité^{antioxydante 3}^,⁴.

La vitamine C totale est composée d’acide ascorbique (AA) et d’acide déshydroascorbique (DHAA). AA est la forme la plus biologiquement active de la vitamine, mais DHAA (son produit d’oxydation) montre également l’activité biologique et il peut être facilement converti en AA dans le corps humain⁵. Par conséquent, la quantification des deux formes est importante pour déterminer la teneur totale en vitamine C de toute culture horticole, laitue incluse.

Une grande variété d’approches basées sur différentes techniques analytiques ont été employées pour mesurer la vitamine C dans les légumes, telles que les méthodes enzymatiques, spectrophotométriques, et titrimétriques^6,^7,^8. Bien que ces méthodes soient simples, elles ne sont pas chimiquement spécifiques pour AA⁹. Par conséquent, les méthodes chromatographiques sont préférées, en particulier la technique de chromatographie liquide-ultraviolet (HPLC-UV) haute performance, en raison de leur précision^{plus élevée 10}. HPLC-UV a été utilisé pour déterminer la vitamine C dans une grande diversité de cultures, comme le brocoli, épinards et laitue¹¹^,¹²^,¹³. Cependant, la quantification simultanée d’AA et de DHAA est compliquée en raison de la faible absorptivity de DHAA dans la gamme UV du spectre. Alternativement, DHAA peut être déterminé indirectement en utilisant un agent réducteur qui convertit DHAA en AA, en mesurant l’acide ascorbique total (TAA), puis en calculant la différence entre TAA et AA. En raison de la nécessité d’une réaction de réduction, dans certaines études, seulement AA a été quantifié¹⁴, qui pourrait effectivement représenter une sous-estimation de l’activité de la vitamine C. Cette réaction de réduction supplémentaire est également nécessaire pour déterminer indirectement le DHAA, même lorsque la dernière avancée des techniques de chromatographie liquide, la chromatographie liquide ultra-performante (UPLC), est utilisée. Cette étape bénéficie également des avantages que l’UPLC présente par rapport à HPLC : efficacité et résolution plus élevées, sensibilité accrue, analyse plus courte du temps et consommation de solvants^{plus faible 15}. En conséquence, la technique UPLC-UV a été utilisée pour quantifier la vitamine C dans différentes cultures¹⁶.

En outre, AA est une molécule très labile; ainsi, il est important de développer un protocole qui empêche sa dégradation pendant le stockage de laitue et l’analyse de la vitamine C^9. Dans ce contexte, le protocole suivant offre une quantification rapide et améliorée de la teneur en vitamine C dans la laitue par UPLC-UV, ainsi qu’une procédure d’extraction efficace. Non seulement les cultivars d’élite ont été inclus dans la présente étude, mais aussi les variétés locales traditionnelles et certains parents sauvages en raison de leur intérêt potentiel pour la sélection des cultures, en particulier dans l’amélioration de la valeur nutritive de la laitue.

Protocol

1. Préparation des matières végétales Échantillonner au moins deux feuilles par plante dans des tubes de polypropylène de 50 mL, une externe (plus ancienne) et une externe (plus jeune) afin de représenter plus précisément l’ensemble de la plante. Recueillir au moins trois répliques biologiques pour chaque échantillon. Congelez-les immédiatement à l’aide d’azote liquide et conservez-les à -80 °C jusqu’à utilisation. Assurez-vous que l’azote liquide n’entre pas dans les tubes; sinon, ils pourraient exploser lorsqu’ils sont enlevés en raison de l’expansion du gaz pendant la vaporisation.ATTENTION : Des gants et un écran facial sont nécessaires en raison des dangers potentiels associés à l’utilisation d’azote liquide. Retirer les bouchons des tubes et les placer sur les plateaux dans la chambre de sécheuse du lyophiliseur (tableau desmatériaux)programmée comme suit : -25 °C pour 72 h, -10 °C pendant 10 h, 0 °C pendant 10 h et 20 °C pendant au moins 4 h. Maintenir la température du condenseur et la constante du vide pendant le processus de séchage au gel à -80,2 °C et 112 mTorr, respectivement. Lorsque le matériau est complètement sec (entre 4 et 7 jours selon la plante et le degré de compactage dans le tube), conservez à 4 °C, -20 °C ou -80 °C pour un stockage court (jours à semaines), moyen (mois) ou long (années), respectivement. L’inclusion de sacs contenant des perles de gel de silice dans les tubes contenant de l’échantillon est recommandée. Placez les échantillons lyophilisés dans des tubes en polypropylène de 20 mL ainsi que des boules d’acier inoxydable de 10 mm de diamètre et broyez-les avec un vortexer multitube en utilisant l’intensité et le temps nécessaires pour obtenir une poussière fine.REMARQUE : Pendant tout le processus, protégez les échantillons contre l’exposition à la lumière directe. 2. Préparation des reagents et des solutions Préparer la solution d’extraction des solvants : 8 % d’acide acétique (v/v), 1 % de MPA (acide métaphosphorique) (w/v), 1 mM d’EDTA (acide éthylènediaminetétraacetic). Calculer le volume total de solvant nécessaire pour traiter l’ensemble des échantillons en tenant compte du fait que 5 mL seront ajoutés à chacun. Pour préparer 1 L de la solution, ajouter à un flacon : 30 g de MPA, 0,372 g de déshydratation EDTA, 80 mL d’acide acétique et 500 mL d’eau ultrapure (volumes d’échelle et quantités en conséquence). Sceller la bouche du flacon avec du film plastique. Une fois dissous à l’aide d’un agitateur magnétique, utilisez un flacon volumétrique pour mesurer avec précision 1 L, en ajoutant l’eau ultrapure nécessaire. Préparer le tampon de réaction de réduction (0,5 M Tris (2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) pH 9.0) et la solution réducteur (40 mM DTT (1,4-Dithiothreitol) avec 0,5 M Tris pH 9,0). Calculez le volume total de solution de réduction nécessaire pour traiter l’ensemble des échantillons en tenant compte du fait que 200 μL seront ajoutés à chacun d’eux. Pour préparer 100 mL de tampon, ajouter à un bécher : 6,055 g de Tris et 90 mL d’eau ultrapure (volumes d’échelle et quantités en conséquence). Sceller la bouche du bécher avec du film plastique. Une fois dissous à l’aide d’un agitateur magnétique, réglez la solution au pH 9.0 en ajoutant 2 M HCl et utilisez un flacon volumétrique pour mesurer avec précision 100 mL, en ajoutant l’eau ultrapure nécessaire. Pour préparer 100 mL de la solution réducteur, ajouter à un bécher : 0,629 g de TNT (pureté : 98 %) et 90 mL du tampon (0,5 M Tris pH 9,0) précédemment préparé (2,2,1 à 2,2,2). Échellez les volumes et les quantités en conséquence. Sceller la bouche du bécher avec du film plastique. Une fois dissous à l’aide d’un agitateur magnétique, utilisez un flacon volumétrique pour mesurer avec précision 100 mL, en ajoutant le volume nécessaire de tampon 0,5 M Tris pH 9.0.REMARQUE : La solution de réduction est très instable. C’est pourquoi une solution fraîchement faite est fortement recommandée. Acide sulfurique (0,4 M H2SO4) Calculer le volume total d’acide sulfurique de 0,4 M nécessaire pour traiter l’ensemble des échantillons en tenant compte du fait que 200 μL seront ajoutés à chacun. Pour préparer 100 mL de la solution, ajouter à un bécher: 80 mL d’eau ultrapure, puis 2,22 mL de H2SO4 (pureté: 96%, densité: 1,84 g mL-1). Utilisez un flacon volumétrique pour mesurer avec précision 100 mL, en ajoutant l’eau ultrapure nécessaire.ATTENTION : L’acide sulfurique est très corrosif, il doit donc être manipulé à l’aide d’un équipement de protection et sous le capot. En outre, l’acide doit être ajouté à l’eau ultrapure, et non l’eau à l’acide, pour réduire les fumées et éviter les accidents. Acide chlorhydrique (2 M HCl). Pour préparer 100 mL d’acide chlorhydrique de 2 M, ajouter à un bécher : 80 mL d’eau ultrapure, puis 6,13 mL de HCl (pureté : 37%, densité : 1,19 g mL-1). Sceller la bouche du bécher avec du film plastique. Utilisez un flacon volumétrique pour mesurer avec précision 100 mL, en ajoutant l’eau ultrapure nécessaire. Échelle des volumes en conséquence.ATTENTION: L’acide chlorhydrique est très corrosif, il doit donc être manipulé à l’aide d’équipement de protection et sous le capot. En outre, l’acide doit être ajouté à l’eau ultrapure, et non l’eau à l’acide, pour réduire les fumées et éviter les accidents. Norme AA (stock et dilutions) Peser exactement 10 mg de norme AA (pureté: 99%) en utilisant un équilibre de précision et ajouter 90 mL de phase mobile (pH d’eau ultrapure 2.0 avec acide formique). Une fois dissous à l’aide d’un agitateur magnétique, utiliser une fiole volumétrique pour mesurer avec précision 100 mL, en ajoutant le volume nécessaire de pH d’eau ultrapure 2.0 avec de l’acide formique.REMARQUE : Protégez cette solution de stock de l’exposition à la lumière. Préparez cinq dilutions à partir du stock de la norme AA pour obtenir une courbe d’étalonnage suivant les instructions du tableau 1 et procéder à l’étape 5.2. Standard [AA] (μg mL-1) Solution AA (100 μg mL-1)(μL) Phase mobile (μL)a 1 0.5 5 995 2 2.5 25 975 3 5 50 950 4 10 100 900 5 25 250 750 a PH d’eau ultrapure 2.0 acidifié par acide formique. Tableau 1 : Protocole pour préparer cinq normes d’AA (acide ascorbique). Des volumes de soluté et de solvant pour préparer chacune des différentes concentrations des normes sont indiqués. 3. Extraction des AA et du DHAA REMARQUE : Il est recommandé de travailler dans des conditions de faible intensité lumineuse pendant les étapes d’extraction. Dans un tube de centrifugeuse en polypropylène de 15 mL, ajouter 50 mg d’échantillon de sol lyophilisé et 5 mL de solvant d’extraction (étape 2.1). Agiter le mélange à l’aide d’un vortex pendant 5 s, puis d’un shaker orbital pendant 10 min à 2000 rpm. Introduire le tube dans un bain ultrasonique pendant 10 min à température ambiante avec ultrason activé. Centrifugeuse à 4 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Prenez le supernatant, passez-le à travers un filtre à cellulose régénéré de 0,22 μm et rangez-le dans un flacon d’ambre de 5 mL. Il s’agit de l’extrait 1, qui contient AA et DHAA.REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici en gelant les extraits à -80 °C et en les protégeant de l’exposition à la lumière car les AA et les DHAA sont très instables et se dégradent facilement en présence de lumière, à des températures élevées ou dans des atmosphères oxydantes (Dossier supplémentaire 1). 4. Réduction de DHAA à AA pour extraire TAA Transférer 200 μL d’extrait 1 sur un flacon ambré de 2 mL pour la chromatographie liquide et ajouter 200 μL de la solution réducteur (étape 2.2). Fermez le flacon à l’aide d’une prise en silicone PTFE avec pré-ouverture et secouez-le avec un vortex de 5 s. Laissez la solution reposer pendant 30 min à température ambiante et protégez-la de la lumière. Ajouter 200 μL de 0,4 M H2SO4 pour arrêter la réaction et stabiliser l’AA dans le pH acide. La solution qui en résulte est Extrait 2, qui contient seulement AA et est en fait TAA. 5. Détermination Préparation UPLC-UV Préparez les solutions de travail décrites dans le tableau 2,filtrées convenablement à travers des filtres de 0,22 μm, sonnées pendant au moins 10 minutes et les placer dans le système UPLC. Allumez les trois modules UPLC et attendez la fin du processus d’étalonnage interne. Ouvrez le logiciel (p. ex., Empower 3) et chargez le programme instrumental décrit dans le tableau 2: Empower 3 | Exécuter des échantillons | Méthode de vitamine C | UPLC_PDA | Utilisez QuickStart. Une fois que le logiciel est chargé avec le bon programme, accédez à la console de gestion UPLC : Quaternary Solvent Manager | Cliquez sur le bouton de la souris droite | Console de lancement. Procéder à la préparation et à la stabilisation de l’instrument UPLC : Système | Contrôle | Démarrage. Purgez toutes les lignes UPLC pendant au moins 5 min : Solvants Prime | QSM – France | Vérifiez A, B, C, D et Seal Wash | Durée de prime > 5 min. Purger et nettoyer l’injecteur : Solvants prime | SM – France | Vérifiez le solvant Wash (> 45 s) et vérifiez purge solvant (> 35 cycles). Equilibrer UPLC aux conditions de méthode : Equilibrate à la méthode | QSM – France | Débit (0,3 mL min-1) | Solvant A (2%) | Solvant B (0%) | Solvant C (98%) | Solvant D (0%); Equilibrer à la méthode | SM – France | Échantillon (5 °C) | Colonne (30 °C) et Equilibrate à méthode | Autres | Vérifiez la lampe allumée | Appuyez sur Démarrer. Attendez au moins 1 h (encore plus de temps est recommandé) pour que l’équipement se stabilise. La stabilité peut être vérifiée en vérifiant la pression dans la colonne de la console de lancement: Système | Gestionnaire de solvants quaternaires | Pression du système QSM. Assurez-vous qu’il n’y a pas de tendances identifiables dans les changements de pression (augmentations ou diminutions) et que la valeur du delta est inférieure à 10 psi. Dans l’écran QuickStart, remplissez la matrice avec les noms des normes et des échantillons à analyser. Détermination AA dans les normes Transférer 1 mL de chacune des cinq normes AA précédemment préparées (étape 2.5.3) à 2 mL de flacons ambrés pour la chromatographie liquide. Fermez le flacon à l’aide d’une prise en silicone PTFE avec pré-ouverture et injectez 5 μL dans l’instrument UPLC. Effectuer la chromatographie suivant la procédure décrite dans le tableau 2 à partir de la plus diluée à la plus concentrée. Détermination AA dans les échantillons Pipette 200 μL d’extrait 1 dans un flacon ambré de 2 mL pour la chromatographie liquide et ajouter 800 μL d’eau ultrapure. Fermez le flacon à l’aide d’une prise en silicone PTFE avec pré-ouverture et injectez 5 μL dans l’instrument UPLC. Effectuer la chromatographie suivant la procédure décrite dans le tableau 2. Détermination taa dans les échantillons Ajouter 400 μL d’eau ultrapure à l’extrait 2. Fermez le flacon à l’aide d’une prise en silicone PTFE avec pré-ouverture et injectez 5 μL dans l’instrument UPLC. Effectuer la chromatographie suivant la procédure décrite dans le tableau 2. Composants et paramètres Description Instrument Acquity UPLC Classe H Détecteur PDA eν Detector νabs for AA=245 nm Logiciel Autonomisation 3 Colonne Acquity UPLC HSS T3 (150 mm x 2,1 mm x 1,8 μm) Canal A CH3OH Canal B/Lavage H2O:CH3OH (50:50 v:v) Canal C PH d’eau ultrapure 2.0 acidifié par acide formiquea Canal D/Lavage des phoques Eau ultrapure: acetonitrile (90:10 v:v) Phase mobile 0,3 mL min-1 de 2%A + 98%C (mode isocratique) Température de la colonne 30 °C Température de l’autosampler 5 °C Volume d’injection 5 μL Temps de rétention AA 1.874 min Durée de fonctionnement 3 min a Volume indéterminé d’acide formique utilisé jusqu’à l’ajustement du pH Tableau 2 : Procédure chromagraphique optimisée pour déterminer l’AA (acide ascorbique) dans les extraits de laitue et de parents sauvages. Description des composants, conditions et solutions utilisés. 6. Quantification des AA et du DHAA Analyse statistique Déterminer les paramètres analytiques de la méthode chromagraphique tel que décrit par Bertolín et coll.18 (Tableau 3).REMARQUE : Les valeurs des paramètres présentés dans le tableau 3 devront être définies dans des conditions expérimentales spécifiques. Paramètres analytiques de la méthode Valeurs Plage linéaire (μg mL-1) 0.5-25 Équation linéaire y=53 143,03 x R2 0.99998 Limite de détection (mg AA g-1 de matière sèche) 0.013 Limite de quantification (mg AA g-1 de matière sèche) 0.045 Répétabilité (CV, %)a 1.75 Précision intermédiaire (CV, %)a 4.22 Récupération (Rec, %)b 95,6 ±2,4 a CV : coefficient de variation b L’analyse de récupération a été effectuée avec 10 aliquots contenant 50 mg du même échantillon, 5 piqués avec 2 mg d’AA g-1 de matière sèche, et 5 non piqués. %Rec=([AA]échantillon à pointes-[AA]sample)/([AA]spiked)x100. Tableau 3 : Paramètres analytiques optimisés pour la détection et la quantification des AA (acide ascorbique) et du TAA (acide ascorbique total). La plage linéaire, l’équation et le coefficient de détermination de la courbe d’étalonnage (R2),ainsi que les limites de détection et de quantification de l’AA (le même pour taa), et la répétabilité, la précision intermédiaire et la récupération ont été obtenus avec un volume d’injection d’échantillon de 5 μL. Calculer la concentration d’AA et de TAA. Ouvrez les chromatogrammes standard et échantillon : QuickStart | Parcourir le projet | Canaux | « nom de la norme ou de l’échantillon » | PDA Ch1 245 nm@1,2 nm. Intégrer le pic correspondant (AA ou TAA) dans les normes et les échantillons en cliquant sur son point de départ (environ 1.790 min) et en le faisant glisser avec la souris jusqu’à son point final (environ 1.910 min). Construire une courbe d’étalonnage représentant les valeurs d’absorption déterminées chromatographiquement (étape 5.2.) par rapport à la concentration des cinq normes AA préparées ci-dessus (tableau 1). Interpoler les valeurs d’absorption des échantillons déterminés aux étapes 5.3 et 5.4 et obtenir la concentration d’AA et de TAA, respectivement, avec la formule suivante :où y est la zone de pointe intégrée, x est la concentration AA ou TAA en ppm et m et n sont la pente et le y-interceptde la ligne de régression obtenue, respectivement. Pour calculer la concentration de DHAA, appliquez la formule suivante :REMARQUE : Pour obtenir les concentrations totales du DHAA, de l’AA et du TAA en mg g-1 de poids sec, les valeurs obtenues en interpolant directement dans la courbe d’étalonnage devront être multipliées par le volume total de l’extrait et le facteur de dilution appliqué, puis divisées par le poids de l’échantillon utilisé pour effectuer l’extraction.

Representative Results

La quantification de la vitamine C dans les matrices de Lactuca nécessite le développement d’une approche chromagraphique qui peut assurer des résultats fiables. La figure 1A montre un chromatogramme résultant d’un protocole non optimisé (Fichier supplémentaire 2), qui présente un pic AA avec une « épaule » mineure non identifiée. Néanmoins, après avoir amélioré les conditions d’extraction et de chromatographie, un pic AA résolu sans interférences de composés inconnus a été atteint (Figure 1B). En outre, l’utilisation d’équipements UPLC-UV au lieu de HPLC-UV nous a permis de réduire le temps de rétention (RT) pour AA : 1.874 min dans les chromatogrammes optimisés contre 2.980 min dans les protocoles non optimisés(figure 1),ainsi que les temps de fonctionnement, 3 et 7 minutes pour les protocoles optimisés et non optimisés, respectivement. Figure 1 : Chromatogrammes d’AA dans le même échantillon de laitue (cultivar commercial ‘Begoña’). (A) chromatogramme HPLC-UV résultant d’un protocole non optimisé (conditions décrites dans le fichier supplémentaire 2). (B) chromatogramme UPLC-UV obtenu avec le protocole optimisé (conditions décrites dans le tableau 2). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Les interférences dans les pics d’AA, comme celles observées à la figure 1A,ont constamment entraîné une sous-estimation de la teneur en vitamine C (AA, DHAA et TAA) (figure 2) en raison d’une séparation insuffisante pendant le processus chromatographic que les zones de pointe qui se chevauchent ont été intégrés par une chute verticale au point le plus profond entre eux. Ce biais est particulièrement perceptible dans le cas des parents sauvages de cultures, en particulier dans la teneur en DHAA et TAA (Figure 2). Figure 2 : Distribution du contenu de la vitamine C. Parcelles de violon fendue de contenu DHAA, AA et TAA (mg g-1 de poids sec) dans les variétés de laitue commerciales et traditionnelles et certains parents sauvages en utilisant des protocoles non optimisés et optimisés. Les lignes noires affichent les valeurs moyennes. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. En outre, l’utilisation d’un protocole non optimisé nous a empêchés d’extraire toute conclusion utile des résultats car ils ont montré tous les échantillons, les deux types de laitues et les parents sauvages, ayant une teneur similaire en vitamine C. En revanche, le protocole optimisé nous a permis de détecter des différences statistiquement significatives entre eux pour le contenu du DHAA et du TAA (tableau 4), les plus riches étant les espèces sauvages (figure 2). Non optimisé Optimisé Rapport F p-valeur Rapport F p-valeur DHAA (DHAA) 0.460 0.637ns 5.613 0.009** Aa 0.070 0,932ns 1.020 0.374ns Taa 0.015 0,985ns 4.438 0.022* ns, * et ** indiquent non significatif et significatif à p<0.05 et 0.01, respectivement. Tableau 4 : Variation de la teneur en vitamine C. Les ratios F (quotients de deux écarts, la variance entre les groupes et la variance au sein du groupe) et les valeurs d’importance de l’ANOVA unilatère compte tenu du type de Lactuca (variétés de laitue commerciale, variétés de laitue traditionnelles et parents sauvages des cultures) pour la teneur en DHAA, AA et TAA dans des protocoles non optimisés et optimisés. Dossier supplémentaire 1 : Stabilité AA et TAA à 5 °C sur 24 h. ( A )AAet TAA zones de pointe tout au long de 24 h. (B) AA et TAA contenu (mg g-1 de poids sec) tout au long de 24 h. Les barres représentent les écarts types de deux répliques techniques (n=2) conservées dans l’autosampler à 5 °C et protégées contre l’exposition à la lumière. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier. Dossier supplémentaire 2 : Principales différences entre le protocole optimisé et le protocole non optimisé pour l’extraction et la quantification de TAA, AA et DHAA. Les échantillons utilisés étaient les mêmes dans les deux cas. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

La vitamine C est un nutriment très important, mais c’est un composé très labile aussi, de sorte que sa quantification UPLC-UV dépend de facteurs multiples, tels que le stockage et la préparation d’échantillons, la méthode d’extraction et les conditions chromatographiques. Par conséquent, une procédure rapide et simple pour empêcher l’oxydation d’AA (avec le pouvoir antioxydant) au DHAA (sans propriétés antioxydantes) était nécessaire. Il était également crucial d’éviter les conditions élevées de pH et de température, ainsi que la lumière intense et une atmosphère oxydante pendant le traitement de l’échantillon pour promouvoir la stabilité du composé.

Afin de minimiser l’oxydation des AA, les mesures suivantes ont été prises. Tout d’abord, les échantillons ont été lyophilisés comme matériau de départ pour les deux protocoles afin d’assurer une quantification précise de la teneur en vitamine C et de manipuler facilement les échantillons. Cette option a été préférée au broyage fin, communément trouvé dans toute la^{littérature 19,}car la poussière dégèle très rapidement de sorte que l’eau redevient disponible. Au cours de la procédure d’extraction, un volume plus élevé d’une solution plus acide (8% d’acide acétique et 1% de MPA) a été utilisé comme extracteur dans le protocole optimisé (Fichier supplémentaire 2), qui a également agi comme un stabilisateur en empêchant la dégradation de l’AA. Cette solution contenait également EDTA comme un agent de chélating pour augmenter la^{stabilisation 16}, contrairement à l’extracteur dans le protocole non optimisé (Fichier supplémentaire 2). En outre, nous avons testé si la procédure d’extraction pouvait être améliorée en utilisant deux extractions consécutives avec 2,5 mL d’extracteur au lieu d’un seul avec 5 mL et sous une atmosphère N₂ au lieu des conditions atmosphériques standard. Les meilleurs résultats ont été obtenus en utilisant une seule extraction dans une atmosphère non modifiée, ce qui a simplifié le protocole en effectuant des étapes supplémentaires inutiles (données non affichées). D’autres modifications mineures ont également été introduites dans le protocole afin d’améliorer l’extraction (c.-à-d. la sonication), d’obtenir un extrait plus clair (filtration plus fine) et de réduire la durée du protocole (Dossier supplémentaire 2). En ce qui concerne les conditions chromatographiques, la validation de la méthode a été effectuée comme indiqué^{avant 18,}garantissant de bons paramètres analytiques (tableau 3). En outre, l’utilisation de l’eau ultrapure avec de l’acide formique (pH 2.0) et du méthanol (98:2 v:v) avec un débit de 0,3 mL min^-1, au lieu du phosphate monopotassium 30 mM (pH 3.0) à 1 mL min^-1 comme phase mobile ( Fichier supplémentaire2), a abouti à une méthode améliorée. L’avancement le plus important a probablement été l’utilisation d’un système UPLC au lieu d’un HPLC, ce qui nous a permis un plus grand contrôle des conditions d’impact (comme la température) et résultant en des pics résolus AA sans interférences par des composés inconnus, dans un temps plus court et consommant moins de volume d’extrait (Fichier supplémentaire 2).

Néanmoins, il existe deux principales limites à cette méthode. La première est que le DHAA ne peut pas être mesuré directement à l’aide d’un détecteur UV en raison de sa faible absorptivité dans la gamme UV du spectre. Il est important de quantifier la teneur en DHAA parce qu’elle présente une certaine activité biologique et qu’elle est facilement convertible en AA dans le corps humain⁵. Pour cela, une réaction supplémentaire pour réduire le DHAA à AA est nécessaire, ainsi qu’une deuxième course chromatographic afin de mesurer TAA et ensuite déterminer DHAA indirectement en soustrayant le contenu AA de TAA (Figure 3). En ce sens, l’étape de réduction a été optimisée en utilisant une concentration plus élevée de l’agent réducteur (TNT), en augmentant le temps de réaction de 5 à 30 min, et en arrêtant la réaction avec de l’acide sulfurique (Fichier supplémentaire 2). La faible stabilité des AA constitue la deuxième limitation de la méthode. Comme AA commence à se dégrader 4 h après extraction (Fichier supplémentaire 1), il est nécessaire de le quantifier dans cet intervalle de temps. Ainsi, le nombre d’échantillons à extraire est conditionné par la procédure chromatographique. C’est pourquoi nous proposons de les geler à cette étape de ce protocole, mais dans ce cas, ils ne pourraient pas tous être placés dans l’autosampler UPLC pour être mesurés automatiquement. Heureusement, la RT réduite pour AA nous a permis d’obtenir des chromatogrammes de 3 min, beaucoup plus courts que les chromatogrammes de 7 min obtenus à l’aide de HPLC(Supplemental File 2). Par conséquent, la teneur en vitamine C pourrait être déterminée dans un nombre élevé d’échantillons dans une fenêtre de 4 h.

Figure 3 : Flux de travail de la quantification de la vitamine C dans la laitue et chez certains parents sauvages.
Diagramme schématique du protocole optimisé montrant deux branches pour la détermination de seulement AA ou AA + DHAA (TAA). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Comme la vitamine C est un nutriment essentiel pour l’homme et en raison de ses avantages importants pour la santé, elle est devenue l’objet de nombreuses études. Par conséquent, il a été quantifié dans une grande variété de cultures, y compris la laitue, l’un des légumes les plus consommés dans le monde entier. Les méthodes classiques simples ont été progressivement remplacées par des techniques de chromatographie liquide parce qu’elles sont plus spécifiques et^{précises 10}. Cependant, en raison de la nécessité d’une réaction supplémentaire pour quantifier à la fois, AA et DHAA via HPLC, dans certaines études sur la laitue, seulement AA¹⁴ ou seulement TAA¹¹ (sans quantifier AA avant la réduction de DHAA en AA) ont été mesurés. En outre, seulement quelques auteurs ont quantifié AA et DHAA, en dépit de la contribution des deux molécules à l’activité antioxydante de vitamine C^2. Néanmoins, la technique UPLC est devenue plus importante ces derniers temps en raison de ses performances plus élevées lors de la mesure de la vitamine C dans plusieurs cultures¹⁶. En comparant les résultats obtenus dans cette étude avec les deux méthodologies, UPLC et HPLC, ces avantages ont été confirmés : des pics AA bien définis grâce à une sensibilité plus élevée, et en très peu de temps, ont été atteints, ce qui implique également moins de ressources consommées. En dépit de l’efficacité d’UPLC, seulement Chen et autres²⁰ ont appliqué cette technique pour mesurer la teneur en vitamine C dans la laitue, qui a toujours mené à une sous-estimation car seule la forme d’AA a été quantifiée.

En résumé, ce travail représente la première tentative réussie de déterminer la teneur totale en vitamine C non seulement dans différentes variétés de laitue, mais aussi chez certains de leurs parents sauvages. La quantification de la vitamine C est également essentielle pour sélectionner les laitues ayant une activité antioxydante plus élevée dans les programmes de reproduction. En ce sens, l’augmentation de la teneur totale en vitamine C chez les parents sauvages de laitue trouvés ici et l’augmentation de la teneur en AA rapportée dans les études^{précédentes 14}, ainsi que d’autres composés^{antioxydants 21}, élargit les candidats appropriés pour améliorer la valeur nutritive des laitues.

En conclusion, même avec certaines limitations inhérentes à la nature de la vitamine C, comme sa dégradation progressive quelques heures après avoir été extrait ou la nécessité d’une réaction de réduction due à la faible absorptivité UV DHAA, il offre une méthode moins laborieuse et moins longue pour mesurer la teneur en vitamine C. En outre, il est également très robuste et montre une sensibilité élevée et la puissance de résolution. En outre, il est facilement transférable non seulement à d’autres matériaux végétaux avec des changements légers ou nuls, mais aussi aux produits transformés qui fournissent l’apport alimentaire en vitamine C à l’homme, ce qui donne lieu à un large éventail d’applications futures dans le domaine émergent des tests pour une qualité alimentaire fiable.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions la Vegetable Germplasm Bank de Saragosse (BGHZ-CITA, Espagne) et le Centre for Genetic Resources (CNG, Wageningen, Pays-Bas) d’avoir fourni les semences nécessaires à ces travaux. Nous remercions J. A. Aranjuelo, A. Castellanos et « laboratorio de valoración nutritiva » du CITA pour leur soutien technique et D. L. Goodchild d’avoir examiné la langue anglaise. Ces travaux ont été financés par les projets RTA2017-00093-00-00 de l’Institut national de recherche et de technologie agricoles et alimentaires (INIA) et LMP164_18 du gouvernement d’Aragón; et par le programme opérationnel FEDER Aragón 2014-2020 et le Fonds social européen de l’Union européenne [Grupos Consolidados A12-17R: « Grupo de investigación en fruticultura: caracterización, adaptación y mejora genéica » et A14-17R: « Sistemas agroganaderos alimentarios sostenibles » (SAGAS)]. I.M.L. a été soutenu par un contrat prédoctoral pour la formation des médecins du ministère espagnol de la Science, de l’Innovation et des Universités (MCIU) et de l’Agence nationale espagnole de recherche (AEI).

Materials

1,4-Dithiothreitol (DTT) ≥98% (Ellman′s reagent)	Roche	10197777001
10 mm f stainless steel ball	Euro Aznar Supplies S.L.	20112100
15 mL polypropylene tube for centrifuge	DeltaLab	429946
2 mL HPLC amber vial	Agilent	5190-9063
2 mL syringe with needle	DeltaLab	JS2
20 mL polypropylene tubes	Dealtalab	202840
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIS) ≥99.9% (titration)	Roche	10708976001
50 mL polypropylene tube	DeltaLab	429951
Acetic acid (CH3COOH) ≥99% purity glacial, ReagentPlus	Sigma-Aldrich	A6283
Acetonitrilo, HPLC super gradient grade (99.9+% CH3CN-0.2 µm filtrated)	Chem-lab	CL00.0189
Acquity UPLC HSS T3 column (150 mm x 2.1 mm x 1.8 µm)	Waters	186003540
Beaker 1 L, 200 mL	DeltaLab	191725, 191722
Dipotassium phosphate (KH₂PO₄)	Panreac	766384	Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium salt (EDTA x 2H2O) 99-101% assay, ACS reagent	Panreac	131669
Fisherbrand Analog MultiTube Vortexer	Thermo Fisher Scientific	15549004
Formic acid 98-100% for HPLC LiChropur	Supelco	5438040100
Freeze dryer VirTis genesis 25EL	VirTis	na
Heidolph Multi Reax mixer	Heidolph	na
Heidolph Reax top mixer	Heidolph	na
Hewlett Packard HPLC 1050 equipped with an eλ Detector	Hewlett Packard	na	Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
Hydrochloric acid (HCl) 37% purity, ACS reagent	Sigma-Aldrich	320331
L-Ascorbic acid ≥99%, ACS reagent	Sigma-Aldrich	255564
Meta-phosphoric acid (MPA) ACS reagent, chips, 33.5-36.5%	Sigma-Aldrich	239275
Methanol ≥99.9% (HPLC supergradient grade)	ChemLab	CL00.0189.2500
Micropipettes 10-1000 μL	Socorex	na
Nucleosil 120 C18 Tracer column (250 mm x 4 mm x 5 µm)	Merck (Sigma-Aldrich)	54919	Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
PTFE-silicone cap with preaperture	Agilent	5190-9067
Refrigerated centrifuge Gyrozen 1248R	Gyrozen	na
Regenerated cellulose filters 0.22 µm (13 mm)	Agilent	1015190-5108
Regenerated cellulose filters 0.45-µm (13 mm)	Labbox	SFCA-145-100	Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
Spectrophotometer Heλios β	Thermo Scientific Corporation	na
Sulfuric acid (H₂SO₄) 95.0-98.0% purity, ACS reagent	Sigma-Aldrich	258105
Ultrapure water	WasserLab	na
Ultrasons H-D	Selecta	na
Volumetric flasks 1 L, 100 mL	DeltaLab	191489, 191486
Waters Acquity UPLC H-Class equipped with a PDA eλ Detector	Waters	na

Referencias

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Citar este artículo

Medina-Lozano, I., Bertolín, J. R., Zufiaurre, R., Díaz, A. Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties (Lactuca sativa L.) and Crop Wild Relatives (Lactuca spp.). J. Vis. Exp. (160), e61440, doi:10.3791/61440 (2020).