Obtención de Microglia Humana del Tejido Cerebral Humano Adulto
Summary
Este protocolo es un método eficiente, rentable y robusto para aislar la microglia primaria del tejido cerebral humano vivo, adulto. La microglia humana primaria aislada puede servir como una herramienta para estudiar los procesos celulares en la homeostasis y la enfermedad.
Abstract
Las microglia son células inmunitarias innatas residentes del sistema nervioso central (SNC). La microglia desempeña un papel fundamental durante el desarrollo, en el mantenimiento de la homeostasis y durante la infección o lesión. Varios grupos de investigación independientes han puesto de relieve el papel central que desempeñan las microglia en las enfermedades autoinmunes, los síndromes autoinflamatorios y los cánceres. La activación de la microglia en algunas enfermedades neurológicas puede participar directamente en procesos patógenos. La microglia primaria es una herramienta poderosa para entender las respuestas inmunitarias en el cerebro, las interacciones celulares y celulares y los fenotipos de microglia desregulados en la enfermedad. La microglia primaria imita las propiedades microgliaales in vivo mejor que las líneas celulares microgliaales inmortalizadas. La microglia adulta humana exhibe propiedades distintas en comparación con la microglia fetal y de roedores humanos. Este protocolo proporciona un método eficiente para el aislamiento de la microglia primaria del cerebro humano adulto. El estudio de estas microglias puede proporcionar información crítica sobre las interacciones entre células celulares entre la microglia y otras poblaciones celulares residentes en el SNC, incluidos los oligodendrocitos, las neuronas y los astrocitos. Además, la microglia de diferentes cerebros humanos puede ser cultivada para la caracterización de respuestas inmunitarias únicas para la medicina personalizada y una miríada de aplicaciones terapéuticas.
Introduction
El sistema nervioso central (SNC) está construido de una compleja red de neuronas y células gliales1. Entre las células gliales, la microglia funciona como las células inmunitarias innatas del SNC2,3. Microglia es responsable de mantener la homeostasis en el SNC sano4. Microglia también juega un papel importante en el neurodesarrollo, mediante la poda de sinapsis2. Las microglia son fundamentales para la fisiopatología de varias enfermedades neurológicas, incluyendo pero no limitado a; Enfermedad de Alzheimer5, Enfermedad de Parkinson6, accidente cerebrovascular7, esclerosis múltiple8, lesión cerebral traumática9, dolor neuropático10, lesión de la médula espinal11 y tumores cerebrales como gliomas12.
Los estudios relacionados con la homeostasis y las enfermedades del SNC utilizan microglia de roedores debido a una escasez de protocolos de aislamiento de microglia primaria humana rentables y eficientes en el tiempo13. La microglia de roedores se asemeja a la microglia humana primaria en la expresión de genes como iba-1, PU.1, DAP12 y receptor M-CSF y han sido eficaces en la comprensión de cerebros normales y enfermos13. Curiosamente, la expresión de varios genes inmunes relacionados como TLR4, MHC II, Siglec-11 y Siglec-3 varía entre la microglia humana y la microglia de roedores13. La expresión de varios genes también varía en la expresión temporal y en las enfermedades neurodegenerativas en ambas especies14,,15. Estas diferencias significativas hacen de la microglia humana un modelo esencial para estudiar la función de la microglia en la homeostasis y la enfermedad. La microglia humana primaria también puede ser una herramienta eficaz para el cribado preclínico de posibles candidatos a medicamentos16. Las razones antes mencionadas subrayan la creciente necesidad de protocolos rentables para el aislamiento de la microglia humana primaria.
Hemos desarrollado un protocolo para el aislamiento de la microglia humana primaria a partir del tejido cerebral humano adulto recogido como resultado de la ventana quirúrgica creada para resección de tumores u otras resecciones quirúrgicas. El método aquí es considerablemente diferente de los métodos existentes. Pudimos aislar y cultivar microglia después de un tiempo de tránsito de unos 75 minutos desde el sitio de recolección de tejidos hasta iniciar el protocolo de aislamiento en el laboratorio. Hemos utilizado el sobrenadante de células de fibroblastos L929 para promover el crecimiento de microglia aislada. Este método se centra específicamente en la cultura y el desarrollo de sólo la microglia primaria. El cultivo resultante preparado es de aproximadamente 80% microglia. Mientras que otros protocolos proporcionan un cultivo enriquecido de microglia por centrifugación de gradiente de densidad, citometría de flujo y cuentas magnéticas, el protocolo es una forma rápida, simple, robusta y rentable de cultivar microglia humana primaria17,18,19,20. La capacidad de utilizar el tejido cerebral adulto vivo extirpado quirúrgicamente en lugar de los tejidos cerebrales fijos de los cadáveres demuestra una ventaja adicional de este método en contraste con los procedimientos existentes18,,21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microglia asegurar la homeostasis en el cerebro normal y desempeñar un papel central en la fisiopatología de diversas enfermedades neurológicas4. Las microglia son fundamentales para el neurodesarrollo y la formación de sinapsis2. Los estudios microgliales han demostrado ser fundamentales para comprender el desarrollo y la progresión de diversas enfermedades neurológicas4. La microglia de roedores es el modelo predominante de elección para los…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El laboratorio de SJ se estableció con subvenciones institucionales del IITJ y está financiado por subvenciones del Departamento de Biotecnología (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) y del Ministerio de Electrónica y Tecnología de la Información del Gobierno de la India (No 4(16)/2019-ITEA). Las secciones de tejido cerebral humano se obtuvieron del Instituto de Ciencias Médicas de All India (AIIMS) Jodhpur después de la autorización del comité de ética institucional. Agradecemos a Mayank Rathor, estudiante de B.Tech Student miembro de la Sociedad de Diseño y Artes IIT Jodhpur, por el apoyo a la videografía.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic solution | Himedia | A002 | |
| Calcium chloride | Sigma | 223506 | |
| Centrifuge (4 °C) | Sigma | 146532 | |
| Centrifuge tubes | Abdos | P10203 | |
| CO2 incubator | New Brunswik | Galaxy 170 S | |
| D-Glucose | Himedia | GRM077 | |
| DMEM medium with glutamine | Himedia | AL007S | |
| Fetal bovine serum | Himedia | RM9955 | |
| Flacon tube (50 ml) | Thermo Fsiher Scientific | 50CD1058 | |
| Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1 | Vector | FL-1081 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM2000LED | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| GFAP antibody | GA5 | 3670S | |
| Incubator shaker | New Brunswik Scientific | Innova 42 | |
| L929 cell line | ATCC | NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC CCL-1) | |
| Laminar air flow | Thermo Fsiher Scientific | 1386 | |
| Magnesium chloride | Himedia | MB040 | |
| Monosodium phosphate | Merck | 567545 | |
| Nutrient Mixture F-12 Ham Medium | Himedia | Al106S | |
| Petri dish | Duran Group | 237554805 | |
| Phosphate buffered saline | Himedia | ML023 | |
| Potassium chloride | Himedia | MB043 | |
| Serological pipette | Labware | LW-SP1010 | |
| Sodium bicarbonate | Himedia | MB045 | |
| Sucrose | Himedia | MB025 | |
| Syringe filter (0.2μ, 25 mm diameter) | Axiva | SFPV25R | |
| T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture. | Himedia | TCG4-20X10NO | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
Referencias
- Allen, N. J., Barres, B. A. Glia – more than just brain glue. Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).
- Lenz, K. M., Nelson, L. H. Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function. Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).
- Gordon, S., Plüddemann, A., Martinez Estrada, F. Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions. Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. Microglia in Alzheimer’s disease: A microglial conundrum. Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).
- Tremblay, M. -. E., Cookson, M. R., Civiero, L. Glial phagocytic clearance in Parkinson’s disease. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16 (2019).
- Qin, C., et al. Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke. Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).
- Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology. Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).
- Loane, D. J., Kumar, A. Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated. Experimental Neurology. 275 (03), 316-327 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).
- Bellver-Landete, V., et al. Microglia are an essential component of the neuroprotective scar that forms after spinal cord injury. Nature Communications. 10 (1), 518 (2019).
- Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
- Smith, A. M., Dragunow, M. The human side of microglia. Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Friedman, B. A., et al. Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer’s Disease Not Evident in Mouse Models. Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).
- Rustenhoven, J., et al. PU.1 regulates Alzheimer’s disease-associated genes in primary human microglia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44 (2018).
- Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile. Glia. 55 (4), 412-424 (2007).
- Mizee, M. R., et al. Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16 (2017).
- Rustenhoven, J., et al. Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies. Scientific Reports. 6 (1), 19371 (2016).
- Spaethling, J. M., et al. Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics. Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).
- Olah, M., et al. An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples. Glia. 60 (1), 96-111 (2012).
- Jha, S., et al. The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18. The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811 (2010).
- Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
- Plant, S. R., et al. Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein. The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).
- Arnett, H. A., et al. The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model. The Journal of Immunology. 168 (1), 427 (2002).
- Arnett, H. A., et al. TNFα promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination. Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).
- Trouplin, V., et al. Bone marrow-derived macrophage production. Journal of Visualized Experiments. (81), e50966 (2013).
- Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant. Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).
- Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).
