Isolement et culture des neurones ganglionnaires de Chick
Summary
Les ganglions ciliaires de poussin (CG) font partie du système nerveux parasympathique. Les cultures neuronales des neurones de CG de poussin ont été montrées pour être des modèles de cellules efficaces dans l’étude des interactions de muscle nerveux. Nous décrivons un protocole détaillé pour la dissection, la dissociation et la culture in vitro des neurones de CG des embryons de poussin.
Abstract
Les ganglions ciliaires de poussin (CG) font partie du système nerveux parasympathique et sont responsables de l’innervation des tissus musculaires présents dans l’oeil. Ce ganglion est constitué par une population homogène de neurones ciliaires et choroïdes qui innervate les fibres musculaires striées et lisses, respectivement. Chacun de ces types neuronaux régule des structures et des fonctions oculaires spécifiques. Au fil des ans, les cultures neuronales des ganglions ciliaires poussins se sont avérées être des modèles cellulaires efficaces dans l’étude des interactions muscle-nerveux du système, qui communiquent par synapses cholinergiques. Les neurones de ganglion ciliaire sont, dans sa majorité, cholinergiques. Ce modèle cellulaire s’est avéré utile comparativement aux modèles de cellules hétérogènes précédemment utilisés qui comprennent plusieurs types neuronaux, outre cholinergique. Anatomiquement, le ganglion ciliaire est localisé entre le nerf optique (ON) et la fissure choroïde (CF). Ici, nous décrivons une procédure détaillée pour la dissection, la dissociation et la culture in vitro des neurones ganglionnaires ciliaires des embryons de poussin. Nous fournissons un protocole étape par étape afin d’obtenir des cultures cellulaires très pures et stables de neurones CG, mettant en évidence les étapes clés du processus. Ces cultures peuvent être maintenues in vitro pendant 15 jours et, par la présente, nous montrons le développement normal des cultures cg. Les résultats montrent également que ces neurones peuvent interagir avec les fibres musculaires par le biais de synapses cholinergiques neuro-musculaires.
Introduction
Les neurones du ganglion ciliaire (CG) appartiennent au système nerveux parasympathique. Ces neurones sont cholinergiques, étant en mesure d’établir des synapses muscariniques ou nicotiniques1,2,3. Anatomiquement, le CG est situé dans la partie postérieure de l’œil entre le nerf optique (ON) et la fissure choroïde (CF) et se compose d’environ 6000 neurones dans les premiers stades embryonnaires1,4. Pour la première semaine en culture, les neurones ganglionnaires ciliaires présentent une morphologie multipolaire. Après une semaine, ils commencent à la transition vers un état unipolaire, avec une neurite s’étendant et formant l’axon5. En outre, environ la moitié des neurones cg meurent entre le8 e et le14ème jour du développement de l’embryon de poussin, par un processus programmé de la mort cellulaire. Cette diminution du nombre de neurones se traduit par une population totale du ganglion ciliaire d’environ 3000 neurones6,7,8. In vitro, il n’y a pas de réduction du nombre de neurones CG lorsqu’ils sont cultivés avec les cellules musculaires9 et les neurones CG peuvent être cultivés pendant plusieurs semaines1,9.
Le ganglion ciliaire se compose d’une population homogène de neurones ciliaires et de neurones choroïdes, représentant chacun la moitié de la population neuronale dans le CG, instériorisant le muscle de l’œil. Ces deux types de neurones sont structurellement, anatomiquement et fonctionnellement distincts. Les neurones ciliaires innervotent les fibres musculaires striées sur l’iris et la lentille, étant responsables de la contraction de la pupille. Les neurones choroïdes innervate le muscle lisse de la choroïde1,10,11,12.
Les cultures des neurones ganglionnaires ciliaires de poulet se sont avérées des outils utiles pour l’étude des synapses neuromusculaires et de la formation de synapse1,5,9. Considérant que les synapses neuromusculaires sont cholinergiques13, en utilisant une population neuronale qui est cholinergique – neurones CG – émergé comme une alternative potentielle aux modèles cellulaires précédents14. Ces modèles se composaient d’une population neuronale hétérogène, dans laquelle seule une petite partie est cholinergique. Alternativement, les neurones de ganglion ciliaire se développent relativement rapidement invitro, et après environ 15 heures forment déjà des synapses1. Les neurones cg ont été utilisés comme système modèle au fil des ans pour des études de recherche distinctes, en raison de sa facilité relative d’isolement et de manipulation. Ces applications comprennent les études optogénétiques, le développement de la synapse, l’apoptose et les interactions neuromusculaires14,15.
Nous décrivons une procédure détaillée pour la dissection, la dissociation et la culture in vitro des neurones ganglionnaires ciliaires des embryons de poussins du jour embryonnaire 7 (E7). Nous fournissons un protocole étape par étape afin d’obtenir des cultures cellulaires très pures et stables de neurones cholinergiques. Nous soulignons également les étapes clés du protocole qui nécessitent une attention particulière et qui amélioreront la qualité des cultures neuronales. Ces cultures peuvent être maintenues in vitro pendant au moins 15 jours.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, nous avons démontré comment préparer et culturer les neurones CG. L’identification et la dissection du ganglion ciliaire peuvent être difficiles pour les utilisateurs non exexpérienced. Par conséquent, nous présentons une procédure détaillée et étape par étape pour disséquer efficacement E7 ganglions ciliaires poussin, dissocier le tissu et préparer des cultures neuronales qui peuvent être maintenues pendant au moins 15 jours. Les neurones ganglionnaires ciliaires obtenus avec ce proto…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été financés par le Fonds européen de développement régional (FEDF), par le biais du Programme opérationnel régional Centro 2020 dans le cadre des projets CENTRO-01-0145-FEDER-00008:BrainHealth 2020, CENTRO2020 CENTRO-01-0145-FEDER-000003:pAGE, CENTRO-01-0246-FEDER-00018:MEDISIS, et par le biais de la COMPÉTITION 2020 – Programme opérationnel pour la compétitivité et l’internationalisation et les fonds nationaux portugais via FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., dans le cadre des projets UIDB/04539/2020, UIDB/04501/2020, POCI-01-0145-FEDER-022122:PPBI, PTDC/SAU-NEU/104100/2008, et les subventions individuelles SFRH/BD/141092/2008 2018 (M.D.), DL57/2016/CP1448/CT0009 (R.O.C.), SFRH/BD/77789/2011 (J.R.P.) et par Marie Curie Actions – IRG, 7e programme-cadre.
Materials
| 5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU) | Merck (Sigma Aldrich) | F0503 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody | Thermo Fisher Scientific | A11041 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11031 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A21235 | |
| B27 supplement (50x), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
| Chicken monoclonal neurofilament M | Merck (Sigma Aldrich) | AB5735 | |
| D-(+)-Glucose monohydrate | VWR | 24371.297 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil | Invitrogen (Gibco) | 10270-106 | |
| HEPES, fine white crystals, for molecular biology | Fisher Scientific | 10397023 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | Invitrogen (Gibco) | 26050-070 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
| Mouse laminin I | Cultrex (R&D systems) | 3400-010-02 | |
| Mouse monoclonal b-III tubulin | Merck (Sigma Aldrich) | T8578 | |
| Mouse monoclonal SV2 | DSHB | AB2315387 | |
| Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x) | Thermo Fisher Scientific | 11874235 | |
| Neurobasal medium without glutamine | Invitrogen (Gibco) | 21103-049 | |
| Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15070-063 | |
| Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture | Merck (Sigma Aldrich) | P3532 | |
| Poly-D-Lysine | Merck (Sigma Aldrich) | P7886 | |
| Potassium chloride | Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals) | 31248-1KG | |
| Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS | Panreac Applichem | 131509-1000 | |
| Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI | Invitrogen (Gibco) | P36935 | |
| Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk | Fisher Scientific | 10462200 | |
| Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Peprotech | 450-13 | |
| Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) | Peprotech | 450-10 | |
| Sodium chloride for analysis, ACS, ISO | Panreac Applichem | 131659-1000 | |
| Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade | Panreac Applichem | 141677-1000 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM (100x) | Thermo Fisher | 11360039 | |
| Syringe without needle, 10 mL | Thermo Fisher | 11587292 | |
| Trypsin 1:250 powder | Invitrogen (Gibco) | 27250-018 |
Referencias
- Betz, W. The Formation of Synapses between Chick Embryo Skeletal Muscle and Ciliary Ganglia Grown in vitro. Journal of Physiology. 254, 63-73 (1976).
- Fischbach, G. D. Synapse Formation between Dissociated Nerve and Muscle Cells in Low Density Cell Cultures. Biología del desarrollo. 28, 407-429 (1972).
- Bernstein, B. W. Dissection and Culturing of Chick Ciliary Ganglion Neurons: A System well Suited to Synaptic Study. Methods in Cell Biology. 71, 37-50 (2003).
- Marwitt, R., Pilar, G., Weakly, J. N. Characterization of Two Ganglion Cell Populations in Avian Ciliary Ganglia. Brain Research. 25, 317-334 (1971).
- Role, L. W., Fishbach, G. D. Changes in the Number of Chick Ciliary Ganglion. Neuron Processes with Time in Cell Culture. Journal of Cell Biology. 104, 363-370 (1987).
- Landmesser, L., Pilar, G. Synaptic Transmission and Cell Death During Normal Ganglionic Development. Journal of Physiology. , 737-749 (1974).
- Koszinowski, S., et al. Bid Expression Network Controls Neuronal Cell Fate During Avian Ciliary Ganglion Development. Frontiers in Physiology. 9, 1-10 (2018).
- Landmesser, L., Pilar, G. Synapse Formation During Embryogenesis on Ganglion Cells Lacking a Periphery. Journal of Physiology. 241, 715-736 (1974).
- Nishi, R., Berg, D. K. Dissociated Ciliary Ganglion Neurons in vitro: Survival and Synapse Formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5171-5175 (1977).
- Nishi, R., Berg, D. K. Two Components from Eye Tissue that Differentially Stimulate the Growth and Development of Ciliary Ganglion Neurons in Cell Culture. Journal of Neuroscience. 1, 505-513 (1981).
- Pilar, G., Vaughan, P. C. Electrophysiological Investigations of the Pigeon iris Neuromuscular Junctions. Comparative Biochemistry and Physiology B. 29, 51-72 (1969).
- Landmesser, L., Pilar, G. Selective Reinnervation of Two Cell Populations in the Adult Pigeon Ciliary Ganglion. Journal of Physiology. , 203-216 (1970).
- Pinto, M. J., Almeida, R. D. Puzzling Out Presynaptic Differentiation. Journal of Neurochemistry. 139, 921-942 (2016).
- Dryer, S. E. Functional Development of the Parasympathetic Neurons of the Avian Ciliary Ganglion: A Classic Model System for the Study of Neuronal Differentiation and Development. Progress in Neurobiology. 43, 281-322 (1994).
- Egawa, R., Yawo, H. Analysis of Neuro-Neuronal Synapses using Embryonic Chick Ciliary Ganglion via Single-Axon Tracing, Electrophysiology, and Optogenetic Techniques. Current Protocols in Neuroscience. 87, 1-22 (2019).
- Pinto, M. J., Pedro, J. R., Costa, R. O., Almeida, R. D. Visualizing K48 Ubiquitination during Presynaptic Formation by Ubiquitination-Induced Fluorescence Complementation (UiFC). Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 1-19 (2016).
- Martins, L. F., et al. Mesenchymal Stem Cells Secretome-Induced Axonal Outgrowth is Mediated by BDNF. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).
- Nishi, R. Autonomic and Sensory Neuron. Methods in Cell Biology. , 249-263 (1996).
- Rojo, J. M., De Ojeda, G., Portolés, P. Inhibitory Mechanisms of 5-fluorodeoxyuridine on Mitogen-induced Blastogenesis of Lymphocytes. International Journal of Immunopharmacology. 6, 61-65 (1984).
- Hui, C. W., Zhang, Y., Herrup, K. Non-Neuronal Cells are Required to Mediate the Effects of Neuroinflammation: Results from a Neuron-Enriched Culture System. PLoS One. 11, 1-17 (2016).
- Crain, S. M., Alfei, L., Peterson, E. R. Neuromuscular Transmission in Cultures of Adult Human and Rodent Skeletal Muscle After Innervation in vitro by Fetal Rodent Spinal Cord. Journal of Neurobiology. 1, 471-489 (1970).
- Kano, M., Shimada, Y. Innervation and Acetylcholine Sensitivity of Skeletal Muscle Cells Differentiated in vitro from Chick Embryo. Journal of Cellular Physiology. 78, 233-242 (1971).
- Robbins, N., Yonezawa, T. Developing Neuromuscular Juctions: First Sings of Chemical Transmission during Formation in Tissue Culture. Science. 80, 395-398 (1971).
- Squire, L. R. . Encyclopedia of Neuroscience. , (2010).
- Hooisma, J., Slaaf, D. W., Meeter, E., Stevens, W. F. The Innervation of Chick Striated Muscle Fibers by the Chick Ciliary Ganglion in Tissue Culture. Brain Research. 85, 79-85 (1975).
- Morrison, B. M. Neuromuscular Diseases. Seminars in Neurology. , 409-418 (2016).
- Davies, A. M. The Trigeminal System: An Advantageous Experimental Model for Studying Neuronal Development. Development. 103, 175-183 (1988).
