Isolatie en cultuur van Chick Ciliary Ganglion Neurons
Summary
Chick ciliary ganglia (CG) maken deel uit van het parasympathische zenuwstelsel. Neuronale culturen van kuiken CG neuronen bleken effectieve celmodellen in de studie van zenuwspier interacties. We beschrijven een gedetailleerd protocol voor de dissectie, dissociatie en in vitro cultuur van CG neuronen uit kuikenembryo’s.
Abstract
Chick ciliary ganglia (CG) maken deel uit van het parasympathische zenuwstelsel en zijn verantwoordelijk voor de innervatie van de spierweefsels aanwezig in het oog. Dit ganglion wordt gevormd door een homogene populatie van ciliary en choroïdale neuronen die innervate gestreept en gladde spiervezels, respectievelijk. Elk van deze neuronale types regelen specifieke oogstructuren en -functies. In de loop der jaren, neuronale culturen van de chick ciliary ganglia bleken te zijn effectieve celmodellen in de studie van spier-zenuwstelsel interacties, die communiceren via cholinerge synapsen. Ciliary ganglion neuronen zijn, in zijn meerderheid, cholinerge. Dit celmodel is aangetoond dat nuttig is relatief voor eerder gebruikte heterogene celmodellen die verschillende neuronale types omvatten, naast cholinerge. Anatomisch, de ciliary ganglion is gelokaliseerd tussen de oogzenuw (ON) en de choroïde spleet (CF). Hier beschrijven we een gedetailleerde procedure voor de dissectie, dissociatie en in vitro cultuur van ciliary ganglia neuronen van kuikenembryo’s. We bieden een stap-voor-stap protocol om zeer zuivere en stabiele cellulaire culturen van CG neuronen te verkrijgen, met de nadruk op de belangrijkste stappen van het proces. Deze culturen kunnen gedurende 15 dagen in vitro worden gehandhaafd en hierbij tonen we de normale ontwikkeling van CG-culturen. De resultaten tonen ook aan dat deze neuronen kunnen interageren met spiervezels door middel van neuro-gespierde cholinerge synapsen.
Introduction
Ciliary ganglion (CG) neuronen behoren tot het parasympathische zenuwstelsel. Deze neuronen zijn cholinerge, in staat om muscarinische of nicotinische synapsen vast te stellen1,,2,3. Anatomisch, de CG bevindt zich in het achterste deel van het oog tussen de oogzenuw (ON) en de choroïde spleet (CF) en bestaat uit ongeveer 6000 neuronen in de vroege embryonalestadia 1,4. Voor de eerste week in de cultuur, ciliary ganglion neuronen presenteren een multipolaire morfologie. Na een week, beginnen ze over te stappen naar een unipolaire staat, met een neuriet uit te breiden en de vorming van de axon5. Bovendien sterft ongeveer de helft van de CG-neuronen tussen de8e en 14e dag van de ontwikkeling van kuikenembryo’s, door een geprogrammeerd proces van celdood.th Deze afname van het aantal neuronen resulteert in een totale populatie van het ciliary ganglion van ongeveer 3000 neuronen6,7,8. In vitro, er is geen vermindering van het aantal CG neuronen wanneer gegroeid met spiercellen9 en CG neuronen kunnen worden gekweekt voor enkele weken1,9.
De ciliary ganglion bestaat uit een homogene populatie van ciliary neuronen en choroïdale neuronen, elk die de helft van de neuronale bevolking in de CG, innervating de spier van het oog. Deze twee soorten neuronen zijn structureel, anatomisch en functioneel verschillend. Ciliary neuronen innervate de gestreepte spiervezels op de iris en lens, die verantwoordelijk zijn voor de leerling contractie. Choroidale neuronen innervate de gladde spier van de choroid1,,10,11,12.
Culturen van kip ciliary ganglion neuronen is aangetoond dat nuttige instrumenten voor de studie van neuromusculaire synapsen en synaps vorming1,5,9. Gezien het feit dat neuromusculaire synapsen cholinerge13zijn , met behulp van een neuronale populatie die cholinerge is – CG-neuronen – naar voren gekomen als een potentieel alternatief voor eerdere celmodellen14. Deze modellen bestonden uit een heterogene neuronale populatie, waarbij slechts een klein deel cholinerge is. Als alternatief ontwikkelen ciliary ganglion neuronen relatief snel in vitro, en vormen na ongeveer 15 uur al synapsen1. CG neuronen zijn gebruikt als een model systeem door de jaren heen voor verschillende onderzoeken, als gevolg van het relatief gemak van isolatie en manipulatie. Deze toepassingen omvatten optogenetische studies, synapsontwikkeling, apoptose en neuromusculaire interacties14,15.
We beschrijven een gedetailleerde procedure voor de dissectie, dissociatie en in vitro cultuur van ciliary ganglia neuronen van embryonale dag 7 (E7) kuikenembryo’s. Wij bieden een stap-voor-stap protocol om zeer zuivere en stabiele cellulaire culturen van cholinerge neuronen te verkrijgen. We belichten ook de belangrijkste stappen van het protocol die speciale aandacht vereisen en die de kwaliteit van de neuronale culturen zullen verbeteren. Deze culturen kunnen ten minste 15 dagen in vitro worden gehandhaafd.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol hebben we laten zien hoe we CG-neuronen kunnen voorbereiden en cultuur. De identificatie en dissectie van de ciliary ganglion kan moeilijk zijn voor onervaren gebruikers. Daarom presenteren we een gedetailleerde en stapsgewijze procedure om E7 chick ciliary ganglia efficiënt te ontleden, het weefsel te scheiden en neuronale culturen voor te bereiden die ten minste 15 dagen kunnen worden onderhouden. De ciliary ganglion neuronen verkregen met dit protocol zijn ook geschikt voor co-cultuur met spiercellen….
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door het Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling (EFRO), via het Regionaal Operationeel Programma Centro 2020 in het kader van projecten CENTRO-01-0145-FEDER-000008:BrainHealth 2020, CENTRO2020 CENTRO-01-0145-FEDER-000003:pAGE, CENTRO-01-0246-FEDER-00018:MEDISIS, en via de COMPETE 2020 – Operationeel programma voor concurrentievermogen en internationalisering en Portugese nationale fondsen via FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., onder projecten UIDB/04539/2020, UIDB/04501/2020, POCI-01-0145-FEDER-022122:PPBI, PTDC/SAU-NEU/104100/2008, en de individuele subsidies SFRH/BD/141092/20082018 (M.D.), DL57/2016/CP1448/CT0009 (R.O.C.), SFRH/BD/77789/2011 (J.R.P.) en door Marie Curie Actions – IRG, 7e kaderprogramma.
Materials
| 5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU) | Merck (Sigma Aldrich) | F0503 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody | Thermo Fisher Scientific | A11041 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11031 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A21235 | |
| B27 supplement (50x), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
| Chicken monoclonal neurofilament M | Merck (Sigma Aldrich) | AB5735 | |
| D-(+)-Glucose monohydrate | VWR | 24371.297 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil | Invitrogen (Gibco) | 10270-106 | |
| HEPES, fine white crystals, for molecular biology | Fisher Scientific | 10397023 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | Invitrogen (Gibco) | 26050-070 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
| Mouse laminin I | Cultrex (R&D systems) | 3400-010-02 | |
| Mouse monoclonal b-III tubulin | Merck (Sigma Aldrich) | T8578 | |
| Mouse monoclonal SV2 | DSHB | AB2315387 | |
| Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x) | Thermo Fisher Scientific | 11874235 | |
| Neurobasal medium without glutamine | Invitrogen (Gibco) | 21103-049 | |
| Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15070-063 | |
| Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture | Merck (Sigma Aldrich) | P3532 | |
| Poly-D-Lysine | Merck (Sigma Aldrich) | P7886 | |
| Potassium chloride | Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals) | 31248-1KG | |
| Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS | Panreac Applichem | 131509-1000 | |
| Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI | Invitrogen (Gibco) | P36935 | |
| Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk | Fisher Scientific | 10462200 | |
| Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Peprotech | 450-13 | |
| Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) | Peprotech | 450-10 | |
| Sodium chloride for analysis, ACS, ISO | Panreac Applichem | 131659-1000 | |
| Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade | Panreac Applichem | 141677-1000 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM (100x) | Thermo Fisher | 11360039 | |
| Syringe without needle, 10 mL | Thermo Fisher | 11587292 | |
| Trypsin 1:250 powder | Invitrogen (Gibco) | 27250-018 |
Referencias
- Betz, W. The Formation of Synapses between Chick Embryo Skeletal Muscle and Ciliary Ganglia Grown in vitro. Journal of Physiology. 254, 63-73 (1976).
- Fischbach, G. D. Synapse Formation between Dissociated Nerve and Muscle Cells in Low Density Cell Cultures. Biología del desarrollo. 28, 407-429 (1972).
- Bernstein, B. W. Dissection and Culturing of Chick Ciliary Ganglion Neurons: A System well Suited to Synaptic Study. Methods in Cell Biology. 71, 37-50 (2003).
- Marwitt, R., Pilar, G., Weakly, J. N. Characterization of Two Ganglion Cell Populations in Avian Ciliary Ganglia. Brain Research. 25, 317-334 (1971).
- Role, L. W., Fishbach, G. D. Changes in the Number of Chick Ciliary Ganglion. Neuron Processes with Time in Cell Culture. Journal of Cell Biology. 104, 363-370 (1987).
- Landmesser, L., Pilar, G. Synaptic Transmission and Cell Death During Normal Ganglionic Development. Journal of Physiology. , 737-749 (1974).
- Koszinowski, S., et al. Bid Expression Network Controls Neuronal Cell Fate During Avian Ciliary Ganglion Development. Frontiers in Physiology. 9, 1-10 (2018).
- Landmesser, L., Pilar, G. Synapse Formation During Embryogenesis on Ganglion Cells Lacking a Periphery. Journal of Physiology. 241, 715-736 (1974).
- Nishi, R., Berg, D. K. Dissociated Ciliary Ganglion Neurons in vitro: Survival and Synapse Formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5171-5175 (1977).
- Nishi, R., Berg, D. K. Two Components from Eye Tissue that Differentially Stimulate the Growth and Development of Ciliary Ganglion Neurons in Cell Culture. Journal of Neuroscience. 1, 505-513 (1981).
- Pilar, G., Vaughan, P. C. Electrophysiological Investigations of the Pigeon iris Neuromuscular Junctions. Comparative Biochemistry and Physiology B. 29, 51-72 (1969).
- Landmesser, L., Pilar, G. Selective Reinnervation of Two Cell Populations in the Adult Pigeon Ciliary Ganglion. Journal of Physiology. , 203-216 (1970).
- Pinto, M. J., Almeida, R. D. Puzzling Out Presynaptic Differentiation. Journal of Neurochemistry. 139, 921-942 (2016).
- Dryer, S. E. Functional Development of the Parasympathetic Neurons of the Avian Ciliary Ganglion: A Classic Model System for the Study of Neuronal Differentiation and Development. Progress in Neurobiology. 43, 281-322 (1994).
- Egawa, R., Yawo, H. Analysis of Neuro-Neuronal Synapses using Embryonic Chick Ciliary Ganglion via Single-Axon Tracing, Electrophysiology, and Optogenetic Techniques. Current Protocols in Neuroscience. 87, 1-22 (2019).
- Pinto, M. J., Pedro, J. R., Costa, R. O., Almeida, R. D. Visualizing K48 Ubiquitination during Presynaptic Formation by Ubiquitination-Induced Fluorescence Complementation (UiFC). Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 1-19 (2016).
- Martins, L. F., et al. Mesenchymal Stem Cells Secretome-Induced Axonal Outgrowth is Mediated by BDNF. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).
- Nishi, R. Autonomic and Sensory Neuron. Methods in Cell Biology. , 249-263 (1996).
- Rojo, J. M., De Ojeda, G., Portolés, P. Inhibitory Mechanisms of 5-fluorodeoxyuridine on Mitogen-induced Blastogenesis of Lymphocytes. International Journal of Immunopharmacology. 6, 61-65 (1984).
- Hui, C. W., Zhang, Y., Herrup, K. Non-Neuronal Cells are Required to Mediate the Effects of Neuroinflammation: Results from a Neuron-Enriched Culture System. PLoS One. 11, 1-17 (2016).
- Crain, S. M., Alfei, L., Peterson, E. R. Neuromuscular Transmission in Cultures of Adult Human and Rodent Skeletal Muscle After Innervation in vitro by Fetal Rodent Spinal Cord. Journal of Neurobiology. 1, 471-489 (1970).
- Kano, M., Shimada, Y. Innervation and Acetylcholine Sensitivity of Skeletal Muscle Cells Differentiated in vitro from Chick Embryo. Journal of Cellular Physiology. 78, 233-242 (1971).
- Robbins, N., Yonezawa, T. Developing Neuromuscular Juctions: First Sings of Chemical Transmission during Formation in Tissue Culture. Science. 80, 395-398 (1971).
- Squire, L. R. . Encyclopedia of Neuroscience. , (2010).
- Hooisma, J., Slaaf, D. W., Meeter, E., Stevens, W. F. The Innervation of Chick Striated Muscle Fibers by the Chick Ciliary Ganglion in Tissue Culture. Brain Research. 85, 79-85 (1975).
- Morrison, B. M. Neuromuscular Diseases. Seminars in Neurology. , 409-418 (2016).
- Davies, A. M. The Trigeminal System: An Advantageous Experimental Model for Studying Neuronal Development. Development. 103, 175-183 (1988).
