العزلة والثقافة من الفرخ Ciliary الخلايا العصبية جانجليون
Summary
الـ(غانغليا) الفرخ (CG) هي جزء من الجهاز العصبي اللالامبالي. وقد تبين الثقافات العصبية من الخلايا العصبية CG فرخ لتكون نماذج الخلايا الفعالة في دراسة التفاعلات العضلية العصبية. نحن نصف بروتوكول مفصل لتشريح, تفكك والثقافة في المختبر من الخلايا العصبية CG من الأجنة فرخ.
Abstract
الرموش ganglia (CG) هي جزء من الجهاز العصبي الملامي وهي مسؤولة عن ازمن الأنسجة العضلية الموجودة في العين. وينتَكَّس هذا العقدة من قِبل سكان متجانسين من الخلايا العصبية الهدّانية والتُمرية التي تُعمّق ألياف العضلات الملساء والملسِمة، على التوالي. كل من هذه الأنواع العصبية تنظيم هياكل العين المحددة والوظائف. على مر السنين، أظهرت الثقافات العصبية من ganglia ciliary الفرخ لتكون نماذج الخلايا الفعالة في دراسة التفاعلات العضلات العصبية، والتي التواصل من خلال نقاط الاشتباك العصبي cholinergic. الخلايا العصبية العقدية الإستيلية هي, في غالبيتها, cholinergic. وقد تبين أن هذا النموذج الخلية تكون مفيدة نسبيا لنماذج الخلايا غير المتجانسة المستخدمة سابقا التي تضم عدة أنواع الخلايا العصبية, إلى جانب cholinergic. تشريحيا، يتم ترجمة العقدة الهديلي بين العصب البصري (ON) والصدع المشيمية (CF). هنا، ونحن وصف إجراء مفصل لتشريح، والتفكك والثقافة في المختبر من الخلايا العصبية ganglia cillia ciliary من الأجنة الفرخ. نحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة من أجل الحصول على ثقافات خلوية نقية ومستقرة للغاية من الخلايا العصبية CG ، مع تسليط الضوء على الخطوات الرئيسية للعملية. ويمكن الحفاظ على هذه الثقافات في المختبر لمدة 15 يوما، و، هنا، ونحن نظهر التطور الطبيعي لثقافات CG. وتظهر النتائج أيضا أن هذه الخلايا العصبية يمكن أن تتفاعل مع ألياف العضلات من خلال العصبية العضلية cholinergic نقاط الاشتباك العصبي.
Introduction
تنتمي الخلايا العصبية العقدية الإستيلية (CG) إلى الجهاز العصبي اللالاماثي. هذه الخلايا العصبية هي cholinergic, أن تكون قادرة على إنشاء مسكارينية أو نيكوتينية المشبك1,,2,,3. تشريحيا, وتقع في CG الجزء الخلفي من العين بين العصب البصري (ON) والصدع المشيمية (CF) ويتكون من حوالي 6000 الخلايا العصبية في المراحل الجنينية المبكرة1,4. للأسبوع الأول في الثقافة، الخلايا العصبية العقدية cillion تقديم مورفولوجيا متعددة الأقطاب. بعد أسبوع واحد، فإنها تبدأ في الانتقال إلى دولة أحادية القطب، مع نيوريت واحد تمديد وتشكيل محور عصبي5. بالإضافة إلى ذلك، يموت ما يقرب من نصف الخلايا العصبية CG بيناليوم الثامنو 14 من نمو الجنين الفرخ، من خلال عملية مبرمجة لوفيات الخلايا. هذا الانخفاض في عدد الخلايا العصبية يؤدي إلى مجموع السكان من العقدة الهدبي من حوالي 3000 الخلايا العصبية6,7,8. في المختبر, لا يوجد انخفاض في عدد الخلايا العصبية CG عندما نمت مع خلايا العضلات9 وCG الخلايا العصبية يمكن أن تكون مثقف لعدة أسابيع1,9.
ganglion ciliary يتكون من سكان متجانس من الخلايا العصبية ciliary والخلايا العصبية المشيمية, كل تمثل نصف السكان العصبية في CG, اغراء عضلة العين. هذان النوعان من الخلايا العصبية هي هيكليا, تشريحيا ووظيفيا متميزة. الخلايا العصبية الإستيالية تُؤزّر ألياف العضلات المُقَرَّبة على القزحية والعدسة، وهي مسؤولة عن انكماش التلاميذ. الخلايا العصبية المشيمية إينرفاتي العضلات الملساء من المشيمية1,10,11,12.
وقد ثبت ثقافات الخلايا العصبية العقدية الدجاج ciliary لتكون أدوات مفيدة لدراسة نقاط الاشتباك العصبي العصبية العضلية وتشكيل المشبك1,5,9. بالنظر إلى أن العصبية العصبية العضلية هي cholinergic13, باستخدام السكان العصبية التي هي cholinergic – الخلايا العصبية CG – ظهرت كبديل محتمل لنماذج الخلايا السابقة14. هذه النماذج تتكون في السكان العصبية heterogenous, التي جزء صغير فقط هو cholinergic. بدلا من ذلك، الخلايا العصبية العقدية cillion تطوير سريع نسبيا في المختبر، وبعد ما يقرب من 15 ساعة تشكل بالفعل نقاط الاشتباك العصبي1. وقد استخدمت الخلايا العصبية CG كنظام نموذجي على مر السنين لدراسات بحثية متميزة، نظرا لسهولة نسبيا من العزلة والتلاعب. وتشمل هذه التطبيقات الدراسات optogenetic, تطور المشبك, المبرمج والتفاعلات العصبية العضلية14,15.
نحن وصف إجراء مفصل لتشريح, تفكك والثقافة في المختبر من الخلايا العصبية ganglia cillia cil cil cil مع الجنينية يوم 7 (E7) أجنة الفرخ. نحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة من أجل الحصول على الثقافات الخلوية نقية ومستقرة للغاية من الخلايا العصبية الكولينية. ونحن أيضا تسليط الضوء على الخطوات الرئيسية للبروتوكول التي تتطلب اهتماما خاصا، وسوف تحسن نوعية الثقافات العصبية. ويمكن الحفاظ على هذه الثقافات في المختبر لمدة 15 يوما على الأقل.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول، أظهرنا كيفية إعداد الخلايا العصبية CG وثقافتها. يمكن أن يكون تحديد وتشريح العقدة الهدجية صعبًا على المستخدمين غير المُجَرَّبين. لذلك، نقدم إجراء مفصل وخطوة بخطوة لتشريح بكفاءة cillia الفرخ E7، وفك الأنسجة وإعداد الثقافات العصبية التي يمكن الحفاظ عليها لمدة 15 يوما على الأقل…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل صندوق التنمية الإقليمية الأوروبي (ERDF) ، من خلال برنامج التشغيل الإقليمي Centro 2020 في إطار مشاريع CENTRO-01-0145-FEDER-000008:BrainHealth 2020, CENTRO2020 CENTRO-01-0145-FEDER-00003:pAGE, CENTRO-01-0246-FEDER-00018:MEDISIS، ومن خلال مسابقة المنافسة 2020 – البرنامج التشغيلي للقدرة التنافسية والتدويل والصناديق الوطنية البرتغالية عبر FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., بموجب مشاريع UIDB/04539/2020, UIDB/04501/2020، POCI-01-0145-FEDER-022122:PPBI، PTDC/SAU-NEU/104100/2008، والمنح الفردية SFRH/BD/141092 /2018 (M.D.), DL57/2016/CP1448/CT0009 (R.O.C.), SFRH/BD/77789/2011 (J.R.P.) ومن قبل ماري كوري الإجراءات – IRG, 7 برنامج إطار العمل.
Materials
| 5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU) | Merck (Sigma Aldrich) | F0503 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody | Thermo Fisher Scientific | A11041 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11031 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A21235 | |
| B27 supplement (50x), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
| Chicken monoclonal neurofilament M | Merck (Sigma Aldrich) | AB5735 | |
| D-(+)-Glucose monohydrate | VWR | 24371.297 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil | Invitrogen (Gibco) | 10270-106 | |
| HEPES, fine white crystals, for molecular biology | Fisher Scientific | 10397023 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | Invitrogen (Gibco) | 26050-070 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
| Mouse laminin I | Cultrex (R&D systems) | 3400-010-02 | |
| Mouse monoclonal b-III tubulin | Merck (Sigma Aldrich) | T8578 | |
| Mouse monoclonal SV2 | DSHB | AB2315387 | |
| Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x) | Thermo Fisher Scientific | 11874235 | |
| Neurobasal medium without glutamine | Invitrogen (Gibco) | 21103-049 | |
| Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15070-063 | |
| Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture | Merck (Sigma Aldrich) | P3532 | |
| Poly-D-Lysine | Merck (Sigma Aldrich) | P7886 | |
| Potassium chloride | Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals) | 31248-1KG | |
| Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS | Panreac Applichem | 131509-1000 | |
| Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI | Invitrogen (Gibco) | P36935 | |
| Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk | Fisher Scientific | 10462200 | |
| Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Peprotech | 450-13 | |
| Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) | Peprotech | 450-10 | |
| Sodium chloride for analysis, ACS, ISO | Panreac Applichem | 131659-1000 | |
| Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade | Panreac Applichem | 141677-1000 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM (100x) | Thermo Fisher | 11360039 | |
| Syringe without needle, 10 mL | Thermo Fisher | 11587292 | |
| Trypsin 1:250 powder | Invitrogen (Gibco) | 27250-018 |
Referencias
- Betz, W. The Formation of Synapses between Chick Embryo Skeletal Muscle and Ciliary Ganglia Grown in vitro. Journal of Physiology. 254, 63-73 (1976).
- Fischbach, G. D. Synapse Formation between Dissociated Nerve and Muscle Cells in Low Density Cell Cultures. Biología del desarrollo. 28, 407-429 (1972).
- Bernstein, B. W. Dissection and Culturing of Chick Ciliary Ganglion Neurons: A System well Suited to Synaptic Study. Methods in Cell Biology. 71, 37-50 (2003).
- Marwitt, R., Pilar, G., Weakly, J. N. Characterization of Two Ganglion Cell Populations in Avian Ciliary Ganglia. Brain Research. 25, 317-334 (1971).
- Role, L. W., Fishbach, G. D. Changes in the Number of Chick Ciliary Ganglion. Neuron Processes with Time in Cell Culture. Journal of Cell Biology. 104, 363-370 (1987).
- Landmesser, L., Pilar, G. Synaptic Transmission and Cell Death During Normal Ganglionic Development. Journal of Physiology. , 737-749 (1974).
- Koszinowski, S., et al. Bid Expression Network Controls Neuronal Cell Fate During Avian Ciliary Ganglion Development. Frontiers in Physiology. 9, 1-10 (2018).
- Landmesser, L., Pilar, G. Synapse Formation During Embryogenesis on Ganglion Cells Lacking a Periphery. Journal of Physiology. 241, 715-736 (1974).
- Nishi, R., Berg, D. K. Dissociated Ciliary Ganglion Neurons in vitro: Survival and Synapse Formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5171-5175 (1977).
- Nishi, R., Berg, D. K. Two Components from Eye Tissue that Differentially Stimulate the Growth and Development of Ciliary Ganglion Neurons in Cell Culture. Journal of Neuroscience. 1, 505-513 (1981).
- Pilar, G., Vaughan, P. C. Electrophysiological Investigations of the Pigeon iris Neuromuscular Junctions. Comparative Biochemistry and Physiology B. 29, 51-72 (1969).
- Landmesser, L., Pilar, G. Selective Reinnervation of Two Cell Populations in the Adult Pigeon Ciliary Ganglion. Journal of Physiology. , 203-216 (1970).
- Pinto, M. J., Almeida, R. D. Puzzling Out Presynaptic Differentiation. Journal of Neurochemistry. 139, 921-942 (2016).
- Dryer, S. E. Functional Development of the Parasympathetic Neurons of the Avian Ciliary Ganglion: A Classic Model System for the Study of Neuronal Differentiation and Development. Progress in Neurobiology. 43, 281-322 (1994).
- Egawa, R., Yawo, H. Analysis of Neuro-Neuronal Synapses using Embryonic Chick Ciliary Ganglion via Single-Axon Tracing, Electrophysiology, and Optogenetic Techniques. Current Protocols in Neuroscience. 87, 1-22 (2019).
- Pinto, M. J., Pedro, J. R., Costa, R. O., Almeida, R. D. Visualizing K48 Ubiquitination during Presynaptic Formation by Ubiquitination-Induced Fluorescence Complementation (UiFC). Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 1-19 (2016).
- Martins, L. F., et al. Mesenchymal Stem Cells Secretome-Induced Axonal Outgrowth is Mediated by BDNF. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).
- Nishi, R. Autonomic and Sensory Neuron. Methods in Cell Biology. , 249-263 (1996).
- Rojo, J. M., De Ojeda, G., Portolés, P. Inhibitory Mechanisms of 5-fluorodeoxyuridine on Mitogen-induced Blastogenesis of Lymphocytes. International Journal of Immunopharmacology. 6, 61-65 (1984).
- Hui, C. W., Zhang, Y., Herrup, K. Non-Neuronal Cells are Required to Mediate the Effects of Neuroinflammation: Results from a Neuron-Enriched Culture System. PLoS One. 11, 1-17 (2016).
- Crain, S. M., Alfei, L., Peterson, E. R. Neuromuscular Transmission in Cultures of Adult Human and Rodent Skeletal Muscle After Innervation in vitro by Fetal Rodent Spinal Cord. Journal of Neurobiology. 1, 471-489 (1970).
- Kano, M., Shimada, Y. Innervation and Acetylcholine Sensitivity of Skeletal Muscle Cells Differentiated in vitro from Chick Embryo. Journal of Cellular Physiology. 78, 233-242 (1971).
- Robbins, N., Yonezawa, T. Developing Neuromuscular Juctions: First Sings of Chemical Transmission during Formation in Tissue Culture. Science. 80, 395-398 (1971).
- Squire, L. R. . Encyclopedia of Neuroscience. , (2010).
- Hooisma, J., Slaaf, D. W., Meeter, E., Stevens, W. F. The Innervation of Chick Striated Muscle Fibers by the Chick Ciliary Ganglion in Tissue Culture. Brain Research. 85, 79-85 (1975).
- Morrison, B. M. Neuromuscular Diseases. Seminars in Neurology. , 409-418 (2016).
- Davies, A. M. The Trigeminal System: An Advantageous Experimental Model for Studying Neuronal Development. Development. 103, 175-183 (1988).
