Denne protokollen presenterer en metode for måling av adeninnukleotidbinding til reseptorer i sanntid i et cellulært miljø. Binding måles som Förster resonans energioverføring (FRET) mellom trinitrofenylnukleotidderivater og protein merket med en ikke-kanonisk, fluorescerende aminosyre.
Vi har utviklet en metode for å måle binding av adeninnukleotider til intakte, funksjonelle transmembranreseptorer i et cellulært eller membranmiljø. Denne metoden kombinerer ekspresjon av proteiner merket med den fluorescerende ikke-kanoniske aminosyren ANAP, og FRET mellom ANAP og fluorescerende (trinitrofenyl) nukleotidderivater. Vi presenterer eksempler på nukleotidbinding til ANAP-merkede K ATP-ionekanaler målt i utaket plasmamembraner og skåret ut, innvendig ut membranlapper under spenningsklemme. Sistnevnte tillater samtidige målinger av ligandbinding og kanalstrøm, en direkte avlesning av proteinfunksjonen. Databehandling og analyse diskuteres mye, sammen med potensielle fallgruver og gjenstander. Denne metoden gir rik mekanistisk innsikt i ligandavhengig gating av KATP-kanaler og kan lett tilpasses studiet av andre nukleotidregulerte proteiner eller en hvilken som helst reseptor som en egnet fluorescerende ligand kan identifiseres for.
Flere viktige proteinklasser reguleres direkte av ligandbinding. Disse spenner fra løselige enzymer til membraninnebygde proteiner, inkludert reseptortyrosinkinaser, G-proteinkoblede reseptorer (GPCR) og ionkanaler. GPCR og kanaler står for ~34% og ~15% av alle gjeldende narkotikamål, henholdsvis 1,2. Derfor er det en betydelig biokjemisk, så vel som medisinsk interesse for å utvikle metoder som gir mekanistisk innsikt i ligand-reseptorinteraksjoner. Tradisjonelle metoder for måling av ligandbinding, inkludert fotoaffinitetsmerking og radioligandbindingsstudier, krever store mengder delvis renset protein og utføres vanligvis under ikke-fysiologiske forhold og tidsskalaer. En ideell metode ville kreve bare små mengder protein, kunne utføres på intakte proteiner uttrykt i et cellulært eller membranmiljø, kunne overvåkes i sanntid, og ville være kompatibel med direkte avlesninger av proteinfunksjon.
Förster resonans energy transfer (FRET) er en metode som oppdager nærheten mellom to fluorescerende merkede molekyler3. FRET oppstår når en eksitert donorfluorofor overfører energi på en ikke-radiativ måte til et akseptormolekyl (vanligvis en annen fluorofor). Energioverføring resulterer i slukking av donorfluorescensutslipp og sensibilisering av akseptorutslippet (hvis akseptoren er en fluorofor). Overføringseffektiviteten er avhengig av 6. kraft av avstanden mellom giveren og akseptoren. Videre må donor og akseptor være i nærheten (vanligvis mindre enn 10 nm) for at FRET skal forekomme. Som sådan kan FRET utnyttes til å måle den direkte bindingen mellom en fluorescerende merket proteinreseptor og en fluorescerende ligand.
Flere forskjellige proteiner reguleres eller aktiveres ved å binde intracellulære eller ekstracellulære adeninnukleotider (ATP, ADP, AMP, cAMP). Mange transportørproteiner krever ATP-hydrolyse for deres reaksjonssyklus, inkludert ATP-bindende kassetttransportører og P-type ATPaser som Na + / K + pumpe 4,5. ATP-sensitive K + (KATP) kanaler, cystisk fibrose transmembran konduktansregulator (CFTR) og syklisk nukleotidregulerte kanaler er alle ionkanaler som er styrt ved binding av intracellulære adeninnukleotider, noe som gjør dem utsøkt følsomme for endringer i cellulær metabolisme og signaltransduksjon 6,7,8 . Purinerge P2X- og P2Y-reseptorer reagerer på endringer i ekstracellulær ATP, som kan frigjøres som en nevrotransmitter eller som følge av vevskader9. Vi har utviklet en FRET-basert analyse for måling av adeninnukleotidbinding til membranproteiner i sanntid. Vi har tidligere brukt denne metoden til å studere nukleotidbinding til KATP-kanaler 10,11.
For å måle nukleotidbinding via FRET, må et protein av interesse først merkes med en fluorofor. Den fluorescerende taggen må settes inn stedsspesifikt i proteinet av interesse slik at det er nær nok til ligandbindingsstedet for FRET å forekomme, med spesiell forsiktighet tatt for å sikre at taggen ikke påvirker proteinets generelle struktur og funksjon. For å oppnå dette bruker vi en teknikk utviklet av Chatterjee et al., ved bruk av rav stopp-kodonundertrykkelse for å sette inn en fluorescerende ikke-kanonisk aminosyre (l-3-(6-acetylnaftalen-2-ylamino)-2-aminopropionisk; ANAP) på ønsket sted12. Vi måler nukleotidbinding som FRET mellom ANAP-merket protein og fluorescerende, trinitrofenyl (TNP) nukleotidderivater (figur 1A). Emisjonsspekteret for ANAP overlapper med absorbansspekteret til TNP-nukleotider, en tilstand som er nødvendig for at FRET skal forekomme (figur 1B). Her skisserer vi to forskjellige typer bindingseksperiment. I det første måles nukleotidbinding til den intracellulære siden av ANAP-merkede KATP-kanaler i celler som har blitt unroofed ved sonikering, og etterlater vedheftende fragmenter av plasmamembran på et glassdeksel 10,11,13,14.
I den andre metoden måles nukleotidbinding til ANAP-merkede KATP-kanaler i et membranplaster under spenningsklemme, noe som muliggjør samtidig måling av ioniske strømmer og fluorescens. Ved å kombinere disse to eksperimentelle tilnærmingene kan endringer i binding korreleres direkte med endringer i kanalfunksjon11. Typiske resultater, potensielle fallgruver og dataanalyse diskuteres.
Vi har utviklet en metode for å måle adeninnukleotidbinding i sanntid til intakte membranproteiner. Vår metode bygger på flere andre etablerte teknikker, inkludert merking av proteiner med ANAP ved bruk av ravstoppkodonundertrykkelse12, celleavtak 14 og spenningsklemmefluorometri/PCF 19,20,21,22,23,24,25 . Syntesen av disse tilnærmingene muliggjør måling av nukleotidbinding med høy romlig og tidsmessig oppløsning. Faktisk, i vårt tidligere arbeid, var vi i stand til å skille mellom forskjellige bindingssteder på samme proteinkompleks ved hjelp av denne tilnærmingen10,11. Det er viktig at denne teknikken kan brukes direkte på små mengder protein i et cellulært miljø under forhold som opprettholder proteinfunksjonen. Ved å bruke vår bindingsmetode i forbindelse med direkte, elektrofysiologisk avlesning av ionekanalstrømmer, kan vi få rik innsikt i molekylære grunnlaget for kanalgating11.
Siden spektrometre ikke er standard laboratorieutstyr, kan ANAP-intensiteten også overvåkes i relativ isolasjon ved hjelp av båndpassfiltre. Figur 5B viser spektralegenskapene til to slike filtre. 470/10 nm båndpassfilteret skjermer effektivt fluorescenssignalet fra TNP-ATP og overlapper godt med topp ANAP-fluorescens. Topptransmisjonen til dette filteret er imidlertid bare rundt 50%, noe som kan gjøre det vanskelig å oppnå gode signaler fra svake membraner (eller i utskårne membranlapper under spenningsklemme). Et annet alternativ er et 460/60 nm båndpassfilter. Det er litt mer overlapping mellom 460/60 nm-filteret og foten av TNP-ATP-utslippstoppen sammenlignet med 470/10 nm-filteret. Imidlertid har 460/60 nm båndpass en transmittans på 90-95% over et bredt spekter av ANAP-toppen, noe som forventes å øke fluorescensutslippssignalet.
ANAP er en miljøfølsom fluorofor 12,26,27. Topputslippet og kvanteutbyttet varierer avhengig av inkorporeringsstedet på proteinet av interesse og kan endres etter hvert som proteinet endrer konformasjon. Slike endringer vil være umiddelbart tydelige fra utslippsspektra, men vil ikke være like åpenbare når ANAP-intensiteten måles ved hjelp av filtre. Under alle omstendigheter er det nødvendig med hensiktsmessige kontroller for å demonstrere at fluorescenssignalet ikke varierer på grunn av endringer i lokalmiljøet rundt ANAP etter nukleotidbindingen. Kontrolleksperimenter med umerkede nukleotider kan bidra til å verifisere at eventuelle endringer i ANAP-intensitet er et resultat av FRET mellom ANAP og TNP-nukleotider. TNP-nukleotider kan binde seg ikke-spesifikt til membranene avledet fra utransfekterte celler (enten til plasmamembranen eller til innfødte membranproteiner)10. Vi kvantifiserer binding som en reduksjon i donorfluorescens, da dette signalet er spesifikt for den merkede kanalen. Vi anbefaler imidlertid å utføre ytterligere kontrolleksperimenter for hvert agonist/reseptorpar, for eksempel mutere nukleotidbindingsstedet hvis kjent, for å verifisere at endringen i donorfluorescens virkelig er et resultat av direkte binding til den merkede reseptoren11. Til slutt anbefales det å jobbe med konstruksjoner som inneholder en fluorescerende proteinkode i tillegg til ANAP-etiketten. Dette bidrar til å skille merket reseptorfluorescens fra bakgrunn/autofluorescens. Bakgrunnsfluorescens kan skilles fra ANAP ved toppen og formen til utslippsspektra10, men slike bestemmelser kan være svært vanskelige når bare filtersett brukes. I tillegg kan celler og utakede membraner som uttrykker fluorescerende reseptorer identifiseres ved hjelp av fluorescerende proteinkode uten å måtte opphisse ANAP og risikere overdreven fotobleking.
I mange av våre PCF-registreringer observerte vi en sterk negativ topp i spektrene våre ved høye TNP-ATP-konsentrasjoner (figur 4C). Denne negative toppen er en artefakt av vår bakgrunns subtraksjonsprotokoll. Figur 4D viser lysfelt- og fluorescerende bilder av en patchpipette utsatt for 1 mM TNP-ATP. En skygge på pipettespissen er tydelig, som følge av utelukkelse av TNP-ATP fra volumet av pipetteveggene, som er mest tydelig innenfor fokusplanet. Spektralbildet i figur 4E viser et mørkt bånd som svarer til denne skyggen. Når et område over eller under dette mørke båndet brukes til bakgrunnssubtraksjon, gir det en negativ topp. Det er viktig at denne toppen skjedde over et bølgelengdeområde som tilsvarer TNP-ATP-utslipp og ikke påvirket våre målinger av ANAP-slukking.
Den største begrensningen i våre eksperimenter var å oppnå tilstrekkelig plasmamembranekspresjon av ANAP-merkede konstruksjoner for å måle fluorescens. Det var generelt lettere å skaffe spektra av høy kvalitet fra membraner uten tak enn i PCF, på grunn av deres større størrelse og vår evne til raskt å skanne en hel tallerken med membraner uten tak, i motsetning til PCF hvor flekker bare kan fås en om gangen. I våre eksperimenter var dataene fra membraner uten tak og PCF-eksperimenter like, men ikke ekvivalente (figur 6) 11. Det er imidlertid ingen a priori grunn til at dette skal være en universell observasjon, da proteiner i en patchpipette kan være i en annen funksjonell tilstand enn de i membraner uten tak.
Her er det gjort forsøk på å maksimere uttrykket av våre ANAP-merkede konstruksjoner, spesielt ved å senke cellekulturtemperaturen til 33 °C10,11,16. Etter vår erfaring resulterte forsøk på å identifisere steder i proteinet der ANAP ville være en konservativ substitusjon, ikke konsekvent i konstruksjoner som uttrykte godt. Vi hadde mer suksess med systematisk skanning av hele proteinregioner for ANAP-inkorporeringssteder og screening av kandidater for overflateuttrykk10. ANAP-merkingssystemet fungerer også i Xenopus laevis-oocytter, noe som gjør det mulig å skåret ut mye større membranplaster, og dermed øke signalet til støy26,27,28.
Mens større uttrykksnivåer forventes å resultere i lysere signaler, avhenger det minste antall kanaler som kreves for å måle fluorescens av flere faktorer, inkludert fluoroforens lysstyrke, graden av fotobleking, intensiteten av eksitasjonslyset og fokusplanet. I teorien kan estimater gjøres ved å korrelere fluorescensintensiteten og kanalstrømmen som tidligere har blitt vist28,29. Påliteligheten av slike estimater krever imidlertid noe kunnskap om enkeltkanalkonduktansen og kanalens åpne sannsynlighet. I tillegg til faktorene nevnt ovenfor, vil fluorescenssignalet også bli påvirket av kanaler assosiert med vesikler eller deler av plasmamembranen som sitter fast på pipettglasset som ikke er under spenningsklemme.
Denne metoden er lett tilpasset studiet av andre nukleotidfølsomme ionekanaler. CFTR er strukturelt lik tilbehørsulfonylureareseptorunderenheten til KATP30,31. Som KATP CFTR gating styres av nukleotidbinding, noe som gjør det til et åpenbart fremtidig mål for vår metode7. Purinerge P2X-reseptorer er ionekanaler styrt av ekstracellulær ATP9. TNP-ATP fungerer som en antagonist for P2X-reseptorer32,33. Derfor vil det ikke være nyttig for å studere P2X-aktivering, selv om det kan brukes i konkurranseanalyser med P2X-agonister. Alternativt kan andre fluorescerende ATP-derivater med tilstrekkelig spektral overlapping med ANAP-utslipp brukes til å studere aktivering. Alexa-647-ATP er en fluorescerende P2X-agonist34. Den beregnede R0 mellom Alexa-647 og ANAP er ~ 85 Å, noe som betyr at direkte binding til P2X skal resultere i betydelig slukking av ANAP innlemmet i kanalen. Imidlertid vil en så lang R0 også resultere i slukking fra Alexa-647-ATP bundet til nærliggende underenheter og øker sannsynligheten for at ikke-spesifikk nukleotidbinding vil resultere i FRET. Siden ligandbindingsstedet i P2X-reseptorer er ekstracellulært, vil bindingsmålinger utføres på intakte celler, i helcellespenningsklemme eller i utvendige membranplaster. Vår metode kan også utvides til å studere binding og aktivering av elektrogene og ikke-elektrogene transportører og pumper som er avhengige av ATP for deres reaksjonssyklus, samt G-proteinkoblede P2Y-reseptorer. Til slutt, selv om vi har utviklet denne metoden for å måle adenin nukleotidbinding (TNP-ATP, TNP-ADP, TNP-AMP), kan den samme tilnærmingen brukes til å studere binding til nesten hvilken som helst reseptor som en egnet, fluorescerende ligand er identifisert for.
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å takke Raul Terron Exposito for utmerket teknisk assistanse. Dette arbeidet ble finansiert av Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB / R002517 / 1; MCP og FMA) og Wellcome Trust (203731/Z/16/A; SGU)
T75 tissue-culture treated flask | StarLab | CC7682-4875 | |
0.1% w/v poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
30 mm borosilicate cover glass slips | VWR | 631-0174 | |
35 mm non-treated sterile dishes | CytoOne | CC7672-3340 | |
35 mm cover glass bottom dish | WPI | FD35-PDL-100 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 31966021 | |
Foetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10500-064 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
TrypLE select (tryosin) | Gibco | 12563-011 | Trypsin/EDTA reagent |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14040-091 | |
UltraPure distilled water | Invitrogen | 10977-035 | |
HEK293T cells | ATTC | CRL-3216 | Used between passages 5-30 |
ANAP-TFA | AsisChem | ASIS-0014 | Reconstituted in 30 mM NaOH to a final concentration of 1 mM |
pANAP expression plasmid | Addgene | Plasmid #48696 | Encodes tRNA/tRNA synthetase pair for expression of ANAP-tagged protein |
peRF1-E55D | Chin Lab (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK) | Jason Chin: DOI: 10.1021/ja5069728 | Encodes dominant-negative eukaryotic ribosomal release factor |
TransIT-LT1 | Mirus Bio | MIR 2300 | Lipopolyplex transfection reagent |
Thick-walled borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | GC150F-15 | |
Tetramethylrhodamine-5-maleimide | Sigma-Aldrich | 94506 | |
TNP-ATP | Jena Bioscience | NU-221L | Delivered at 10 mM in water |
Nikon Eclipse TE2000-U inverted microscope microscope | Nikon | ||
60x water immersion objective (1.4 NA) | Nikon | MRD07602 | |
4-Wavelength High-Power LED Head | ThorLabs | LED4D245 | 385/490/565/625 nm LEDs |
Four-Channel LED Driver | ThorLabs | DC4100 | |
390/18 nm band-pass excitation filter | ThorLabs | MF390-18 | For ANAP excitation |
400 nm long-pass emission filter | ThorLabs | FEL0400 | For imaging ANAP spectra |
416 nm edge dichroic | ThorLabs | MD416 | For imaging ANAP spectra |
460/60 nm band-pass emission filter | ThorLabs | MF460-60 | Suggested wide band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B) |
470/10 nm band-pass emission filter | ThorLabs | FB470-10 | Suggested narrow band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B) |
531/40 band-pass excitation filter | Brightline | FF01-531/40-25 | For orange fluorescent protein (OFP) excitation |
540/25 nm band-pass excitation filter | Chroma | D540/25X | For tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMRM) excitation |
562 nm edge dichroic | Semrock | FF562-Di03 | For imaging OFP fluorescence |
565 nm edge dichroic | Chroma | 565DC | For imaging TMRM fluorescence |
593/40 nm band-pass excitation filter | Brightline | FF01-387/11-25 | For imaging OFP fluorescence |
605/55 nm band-pass emission filter | Chroma | D605/55M | For imaging TMRM fluorescence |
IsoPlane-160 Imaging Spectrometer | Princeton Instruments | IsoPlane-160 | |
PIXIS 400BR_eXcelon Camera | Princeton Instruments | PIXIS: 400BR_eXcelon | |
Axopatch 200B amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B-2 | |
Digidata 1440A digitizer | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
Probe sonicator | Sonics & Materials | VC-50 | For unroofing |
REGLO digital peristaltic pump | Ismatec | ISM 832 | For bath perfusion |
Microvolume perfusion system | ALA Scientific Instruments | ALA μFlow-8 | For TNP-ATP perfusion |
pClamp 10.6.2 | Molecular Devices | Recording and analysing currents | |
Lightfield 5.20.1507 | Princeton Instruments | Acquisition software for images and spectra | |
Matlab | Mathworks | For data analysis | |
Python 3.8.1 | Python Software Foundation | For data analysis |