यह प्रोटोकॉल सेलुलर वातावरण में वास्तविक समय में रिसेप्टर्स के लिए एडेनिन न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग को मापने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। बाइंडिंग को ट्राइनिट्रोफेनिल न्यूक्लियोटाइड डेरिवेटिव और प्रोटीन के बीच एक गैर-कैननिकल, फ्लोरोसेंट अमीनो एसिड के साथ लेबल किए गए फॉस्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (फ्रेट) के रूप में मापा जाता है।
हमने एक सेलुलर या झिल्ली वातावरण में बरकरार, कार्यात्मक ट्रांसमेम्ब्रेन रिसेप्टर्स के लिए एडेनिन न्यूक्लियोटाइड के बंधन को मापने के लिए एक विधि विकसित की है। यह विधि फ्लोरोसेंट गैर-कैननिकल अमीनो एसिड एएनएपी के साथ टैग किए गए प्रोटीन की अभिव्यक्ति को जोड़ती है, और एएनएपी और फ्लोरोसेंट (ट्राइनिट्रोफेनिल) न्यूक्लियोटाइड डेरिवेटिव के बीच फ्रेट। हम बिना छत वाले प्लाज्मा झिल्ली में मापा जाने वाले एएनएपी-टैग किए गए केएटीपी आयन चैनलों के लिए न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग के उदाहरण प्रस्तुत करते हैं और वोल्टेज क्लैंप के तहत उत्पाद, अंदर-बाहर झिल्ली पैच करते हैं। उत्तरार्द्ध लिगैंड बाइंडिंग और चैनल करंट के एक साथ माप की अनुमति देता है, जो प्रोटीन फ़ंक्शन का एक सीधा रीडआउट है। संभावित नुकसान और कलाकृतियों के साथ डेटा उपचार और विश्लेषण पर बड़े पैमाने पर चर्चा की जाती है। यह विधि केएटीपी चैनलों के लिगैंड-निर्भर गेटिंग में समृद्ध यांत्रिक अंतर्दृष्टि प्रदान करती है और आसानी से अन्य न्यूक्लियोटाइड-विनियमित प्रोटीन या किसी भी रिसेप्टर के अध्ययन के लिए अनुकूलित की जा सकती है जिसके लिए एक उपयुक्त फ्लोरोसेंट लिगैंड की पहचान की जा सकती है।
प्रोटीन के कई महत्वपूर्ण वर्गों को सीधे लिगैंड बाइंडिंग द्वारा विनियमित किया जाता है। ये घुलनशील एंजाइमों से लेकर झिल्ली-एम्बेडेड प्रोटीन तक होते हैं जिनमें रिसेप्टर टायरोसिन किनेसेस, जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआर), और आयन चैनल शामिल हैं। जीपीसीआर और चैनल क्रमशःसभी मौजूदा दवा लक्ष्यों का ~ 34% और ~ 15% हैं। इसलिए, लिगंड-रिसेप्टर इंटरैक्शन में यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान करने वाले तरीकों को विकसित करने में काफी जैव रासायनिक, साथ ही चिकित्सा रुचि है। फोटोफिनिटी लेबलिंग और रेडियोलिगैंड बाइंडिंग अध्ययनों सहित लिगैंड बाइंडिंग को मापने के पारंपरिक तरीकों में बड़ी मात्रा में आंशिक रूप से शुद्ध प्रोटीन की आवश्यकता होती है और आमतौर पर गैर-शारीरिक स्थितियों और समय के पैमाने के तहत प्रदर्शन किया जाता है। एक आदर्श विधि के लिए केवल थोड़ी मात्रा में प्रोटीन की आवश्यकता होगी, जिसे सेलुलर या झिल्ली वातावरण में व्यक्त बरकरार प्रोटीन पर किया जा सकता है, वास्तविक समय में निगरानी की जा सकती है, और प्रोटीन फ़ंक्शन के प्रत्यक्ष रीडआउट के साथ संगत होगी।
फॉस्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (फ्रेट) एक विधि है जो दो फ्लोरोसेंटली टैग किएगए अणुओं के बीच निकटता का पता लगाती है। फ्रेट तब होता है जब एक उत्तेजित दाता फ्लोरोफोरे एक गैर-विकिरण फैशन में ऊर्जा को एक स्वीकर्ता अणु (आमतौर पर एक और फ्लोरोफोर) में स्थानांतरित करता है। ऊर्जा हस्तांतरण के परिणामस्वरूप दाता प्रतिदीप्ति उत्सर्जन का शमन होता है और स्वीकर्ता उत्सर्जन का संवेदीकरण होता है (यदि स्वीकर्ता फ्लोरोफोर है)। स्थानांतरण दक्षता दाता और स्वीकर्ता के बीच की दूरी की 6वीं शक्ति पर निर्भर है। इसके अलावा, फ्रेट होने के लिए दाता और स्वीकर्ता निकटता (आमतौर पर 10 एनएम से कम) में होना चाहिए। जैसे, फ्रेट का उपयोग फ्लोरोसेंटली लेबल प्रोटीन रिसेप्टर और फ्लोरोसेंट लिगैंड के बीच सीधे बंधन को मापने के लिए किया जा सकता है।
कई अलग-अलग प्रोटीन इंट्रासेल्युलर या बाह्य एडेनिन न्यूक्लियोटाइड (एटीपी, एडीपी, एएमपी, सीएमपी) को बांधकर विनियमित या सक्रिय होते हैं। कई ट्रांसपोर्टर प्रोटीन को अपने प्रतिक्रिया चक्र के लिए एटीपी हाइड्रोलिसिस की आवश्यकता होती है, जिसमें एटीपी-बाइंडिंग कैसेट ट्रांसपोर्टर और पी-टाइप एटीपीस जैसे एनए + / के + पंप 4,5 शामिल हैं। एटीपी-संवेदनशील के + (केएटीपी) चैनल, सिस्टिक फाइब्रोसिस ट्रांसमेम्ब्रेन चालकता नियामक (सीएफटीआर), और चक्रीय-न्यूक्लियोटाइड विनियमित चैनल सभी आयन चैनल हैं जो इंट्रासेल्युलर एडेनिन न्यूक्लियोटाइड के बंधन से गेट होते हैं, जिससे वे सेलुलर चयापचय और सिग्नल ट्रांसडक्शन 6,7,8 में परिवर्तन के प्रति अति संवेदनशील हो जाते हैं।. प्यूरीनर्जिक पी 2 एक्स और पी 2 वाई रिसेप्टर्स बाह्य एटीपी में परिवर्तन का जवाब देते हैं, जिसे न्यूरोट्रांसमीटर के रूप में याऊतक क्षति के परिणामस्वरूप जारी किया जा सकता है। हमने वास्तविक समय में झिल्ली प्रोटीन के लिए एडेनिन न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग के माप के लिए एक फ्रेट-आधारित परख विकसित की है। हमने पहले केएटीपी चैनल10,11 के न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग का अध्ययन करने के लिए इस विधि को लागू किया है।
फ्रेट के माध्यम से न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग को मापने के लिए, रुचि के प्रोटीन को पहले फ्लोरोफोरे के साथ टैग किया जाना चाहिए। फ्लोरोसेंट टैग को साइट-विशेष रूप से रुचि के प्रोटीन में डाला जाना चाहिए जैसे कि यह फ्रेट होने के लिए लिगैंड बाइंडिंग साइट के काफी करीब है, यह सुनिश्चित करने के लिए विशेष देखभाल की जाती है कि टैग प्रोटीन की समग्र संरचना और कार्य को प्रभावित नहीं करता है। इसे पूरा करने के लिए, हम चटर्जी एट अल द्वारा विकसित एक तकनीक का उपयोग करते हैं, जिसमें फ्लोरोसेंट गैर-कैननिकल अमीनो एसिड (एल -3-(6-एसिटाइलनेफ्थेलेन-2-यलामिनो) -2-एमिनोप्रोपियोनिक डालने के लिए एम्बर स्टॉप-कोडन दमन का उपयोग किया जाता है; एएनएपी) वांछित साइटपर 12. हम न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग को एएनएपी-लेबल प्रोटीन और फ्लोरोसेंट, ट्राइनिट्रोफेनिल (टीएनपी) न्यूक्लियोटाइड डेरिवेटिव (चित्रा 1 ए) के बीच फ्रेट के रूप में मापते हैं। एएनएपी के लिए उत्सर्जन स्पेक्ट्रम टीएनपी-न्यूक्लियोटाइड ्स के अवशोषण स्पेक्ट्रम के साथ ओवरलैप होता है, जो फ्रेट होने के लिए आवश्यक स्थिति है (चित्रा 1 बी)। यहां हम दो अलग-अलग प्रकार के बाध्यकारी प्रयोग ों को रेखांकित करते हैं। पहले में, एएनएपी-लेबल के एटीपीचैनलों के इंट्रासेल्युलर पक्ष के लिए न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग को उन कोशिकाओं में मापा जाता है जिन्हें सोनिकेशन द्वारा अनरूफ किया गया है, जिससे ग्लास कवर स्लिप10,11,13,14 पर प्लाज्मा झिल्ली के अनुगामी टुकड़े बच गए हैं।
दूसरी विधि में, एएनएपी-लेबल केएटीपी चैनलों के न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग को वोल्टेज क्लैंप के तहत एक झिल्ली पैच में मापा जाता है, जिससे आयनिक धाराओं और प्रतिदीप्ति के एक साथ माप की अनुमति मिलती है। इन दो प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों के संयोजन से, बाइंडिंग में परिवर्तन को सीधे चैनल फ़ंक्शन11 में परिवर्तन के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है। विशिष्ट परिणाम, संभावित नुकसान और डेटा विश्लेषण पर चर्चा की जाती है।
हमने बरकरार झिल्ली प्रोटीन के लिए वास्तविक समय में एडेनिन न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग को मापने के लिए एक विधि विकसित की है। हमारी विधि कई अन्य स्थापित तकनीकों पर आधारित है, जिसमें एम्बर स्टॉप कोडन दमन 12, सेल अनरूफिंग 14, और वोल्टेज-क्लैंप फ्लोरोमेट्री / पीसीएफ 19,20,21,22,23,24,25 का उपयोग करके एएनएपी के साथ प्रोटीन की लेबलिंग शामिल है।. इन दृष्टिकोणों का संश्लेषण उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग के माप की अनुमति देता है। दरअसल, हमारे पिछले काम में, हम इस दृष्टिकोण10,11 का उपयोग करके एक ही प्रोटीन कॉम्प्लेक्स पर विभिन्न बाध्यकारी साइटों के बीच अंतर करने में सक्षम थे। महत्वपूर्ण रूप से, इस तकनीक को प्रोटीन फ़ंक्शन को संरक्षित करने वाली स्थितियों के तहत सेलुलर वातावरण में प्रोटीन की छोटी मात्रा पर सीधे लागू किया जा सकता है। आयन चैनल धाराओं के प्रत्यक्ष, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रीडआउट के साथ संयोजन में हमारी बाध्यकारी विधि का उपयोग करने से हमें चैनल गेटिंग11 के आणविक आधार में समृद्ध अंतर्दृष्टि प्राप्त करने की अनुमति मिलती है।
चूंकि स्पेक्ट्रोमीटर प्रयोगशाला उपकरणों का एक गैर-मानक टुकड़ा है, इसलिए बैंड-पास फिल्टर का उपयोग करके सापेक्ष अलगाव में एएनएपी तीव्रता की निगरानी भी की जा सकती है। चित्रा 5 बी ऐसे दो फिल्टर के वर्णक्रमीय गुणों को दर्शाता है। 470/10 एनएम बैंड-पास फ़िल्टर प्रभावी रूप से टीएनपी-एटीपी से प्रतिदीप्ति संकेत को स्क्रीन करता है और पीक एएनएपी फ्लोरेसेंस के साथ अच्छी तरह से ओवरलैप करता है। हालांकि, इस फिल्टर का पीक ट्रांसमिशन केवल 50% के आसपास है, जिससे मंद झिल्ली (या वोल्टेज क्लैंप के तहत उत्पादित झिल्ली पैच में) से अच्छे संकेत प्राप्त करना मुश्किल हो सकता है। एक अन्य विकल्प 460/60 एनएम बैंड-पास फिल्टर है। 470/10 एनएम फिल्टर की तुलना में 460/60 एनएम फिल्टर और टीएनपी-एटीपी उत्सर्जन शिखर के पैर के बीच थोड़ा अधिक ओवरलैप है। हालांकि, 460/60 एनएम बैंड-पास में एएनएपी शिखर की एक विस्तृत श्रृंखला पर 90-95% का संप्रेषण है, जिससे प्रतिदीप्ति उत्सर्जन संकेत को बढ़ावा मिलने की उम्मीद होगी।
एएनएपी एक पर्यावरण के प्रति संवेदनशील फ्लोरोफोरे 12,26,27 है। चरम उत्सर्जन और क्वांटम उपज रुचि के प्रोटीन पर निगमन की साइट के आधार पर भिन्न होती है और प्रोटीन के अनुरूपण बदलने के साथ बदल सकती है। इस तरह के परिवर्तन उत्सर्जन स्पेक्ट्रा से तुरंत स्पष्ट होंगे, लेकिन फिल्टर का उपयोग करके एएनएपी तीव्रता को मापने पर स्पष्ट नहीं होगा। किसी भी मामले में, यह प्रदर्शित करने के लिए उचित नियंत्रण की आवश्यकता होती है कि न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग के बाद एएनएपी के आसपास के स्थानीय वातावरण में परिवर्तन के कारण प्रतिदीप्ति संकेत भिन्न नहीं होता है। अनलेबल न्यूक्लियोटाइड ्स के साथ नियंत्रण प्रयोग यह सत्यापित करने में मदद कर सकते हैं कि एएनएपी तीव्रता में कोई भी परिवर्तन एएनएपी और टीएनपी-न्यूक्लियोटाइड के बीच फ्रेट का परिणाम है। टीएनपी-न्यूक्लियोटाइड ्स गैर-विशेष रूप से असंक्रमित कोशिकाओं (या तो प्लाज्मा झिल्ली या देशी झिल्ली प्रोटीन) से प्राप्त झिल्ली से बंध सकते हैं। हम दाता प्रतिदीप्ति में कमी के रूप में बाइंडिंग की मात्रा निर्धारित करते हैं, क्योंकि यह संकेत लेबल चैनल के लिए विशिष्ट है। हालांकि, हम प्रत्येक एगोनिस्ट / रिसेप्टर जोड़ी के लिए अतिरिक्त नियंत्रण प्रयोग करने की सलाह देते हैं, उदाहरण के लिए न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग साइट को म्यूटेट करना, यदि ज्ञात हो, यह सत्यापित करने के लिए कि दाता प्रतिदीप्ति में परिवर्तन वास्तव में लेबल रिसेप्टर11 के लिए प्रत्यक्ष बंधन का परिणाम है। अंत में, एएनएपी लेबल के अलावा फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग वाले निर्माणों के साथ काम करने की सिफारिश की जाती है। यह पृष्ठभूमि / ऑटोफ्लोरेसेंस से लेबल रिसेप्टर फ्लोरेसेंस को अलग करने में मदद करता है। पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को उत्सर्जन स्पेक्ट्रा10 के शिखर और आकार से एएनएपी से अलग किया जा सकता है, लेकिन इस तरह के निर्धारण बहुत मुश्किल हो सकते हैं जब केवल फिल्टर सेट का उपयोग किया जाता है। इसके अतिरिक्त, फ्लोरोसेंट रिसेप्टर्स को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं और अनरूफ ्ड झिल्ली को एएनएपी को उत्तेजित किए बिना फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग का उपयोग करके पहचाना जा सकता है और अत्यधिक फोटोब्लीचिंग का जोखिम नहीं उठाया जा सकता है।
हमारे कई पीसीएफ रिकॉर्ड में, हमने उच्च टीएनपी-एटीपी सांद्रता (चित्रा 4 सी) पर हमारे स्पेक्ट्रा में एक मजबूत नकारात्मक शिखर देखा। यह नकारात्मक शिखर हमारे पृष्ठभूमि घटाव प्रोटोकॉल की एक कलाकृति है। चित्रा 4 डी 1 एमएम टीएनपी-एटीपी के संपर्क में आने वाले पैच पिपेट की उज्ज्वल-क्षेत्र और फ्लोरोसेंट छवियों को दिखाता है। पिपेट टिप पर एक छाया स्पष्ट है, जिसके परिणामस्वरूप पिपेट की दीवारों की मात्रा से टीएनपी-एटीपी का बहिष्करण होता है, जो फोकस के तल के भीतर सबसे अधिक स्पष्ट है। चित्रा 4 ई में वर्णक्रमीय छवि इस छाया के अनुरूप एक अंधेरे बैंड दिखाती है। जब इस डार्क बैंड के ऊपर या नीचे के क्षेत्र का उपयोग पृष्ठभूमि घटाव के लिए किया जाता है, तो यह एक नकारात्मक शिखर पैदा करता है। महत्वपूर्ण रूप से, यह शिखर टीएनपी-एटीपी उत्सर्जन के अनुरूप एक तरंग दैर्ध्य सीमा पर हुआ और एएनएपी शमन के हमारे माप को प्रभावित नहीं किया।
हमारे प्रयोगों की प्रमुख सीमा प्रतिदीप्ति को मापने के लिए एएनएपी-टैग किए गए निर्माणों की पर्याप्त प्लाज्मा झिल्ली अभिव्यक्ति प्राप्त करना था। पीसीएफ की तुलना में बिना छत वाली झिल्लियों से उच्च गुणवत्ता वाले स्पेक्ट्रा प्राप्त करना आम तौर पर आसान था, क्योंकि उनके बड़े आकार और पीसीएफ के विपरीत, बिना छत वाली झिल्ली के पूरे डिश को जल्दी से स्कैन करने की हमारी क्षमता के कारण, जहां पैच केवल एक बार में प्राप्त किए जा सकते हैं। हमारे प्रयोगों में, बिना छत वाली झिल्ली और पीसीएफ प्रयोगों के डेटा समान थे लेकिन समकक्ष नहीं थे (चित्रा 6)11)। हालांकि, कोई प्राथमिक कारण नहीं है कि यह एक सार्वभौमिक अवलोकन क्यों होना चाहिए क्योंकि पैच पिपेट में प्रोटीन बिना छत वाली झिल्ली की तुलना में एक अलग कार्यात्मक अवस्था में हो सकता है।
यहां, हमारे एएनएपी-टैग किए गए निर्माणों की अभिव्यक्ति को अधिकतम करने के प्रयास किए गए हैं, विशेष रूप से सेल संस्कृति के तापमान को 33 डिग्री सेल्सियस10,11,16 तक कम करना। हमारे अनुभव में, प्रोटीन में साइटों की पहचान करने का प्रयास जिस पर एएनएपी एक रूढ़िवादी प्रतिस्थापन होगा, लगातार उन निर्माणों में परिणाम नहीं हुआ जो अच्छी तरह से व्यक्त किए गए थे। हमें एएनएपी निगमन साइटों के लिए पूरे प्रोटीन क्षेत्रों को व्यवस्थित रूप से स्कैन करने और सतह अभिव्यक्ति10 के लिए उम्मीदवारों की स्क्रीनिंग करने में अधिक सफलता मिली। एएनएपी लेबलिंग सिस्टम जेनोपस लेविस ओसाइट्स में भी काम करता है, जो बहुत बड़े झिल्ली पैच को एक्साइज करने की अनुमति देता है, इस प्रकार शोर 26,27,28 को संकेत बढ़ाता है।
जबकि अभिव्यक्ति के बड़े स्तरों के परिणामस्वरूप उज्ज्वल संकेतों की उम्मीद की जाती है, प्रतिदीप्ति को मापने के लिए आवश्यक चैनलों की न्यूनतम संख्या कई कारकों पर निर्भर करती है, जिसमें फ्लोरोफोरे की चमक, फोटोब्लीचिंग की डिग्री, उत्तेजना प्रकाश की तीव्रता और फोकस का विमान शामिल है। सिद्धांत रूप में, प्रतिदीप्ति तीव्रता और चैनल प्रवाह को सहसंबंधित करके अनुमान लगाया जा सकता है जैसा कि पहले28,29 दिखाया गया है। हालांकि, ऐसे अनुमानों की विश्वसनीयता के लिए एकल-चैनल चालकता और चैनल की खुली संभावना के कुछ ज्ञान की आवश्यकता होती है। ऊपर सूचीबद्ध कारकों के अलावा, प्रतिदीप्ति संकेत पुटिकाओं या प्लाज्मा झिल्ली के वर्गों से जुड़े चैनलों से भी प्रभावित होगा जो पिपेट ग्लास से चिपके हुए हैं जो वोल्टेज क्लैंप के तहत नहीं हैं।
यह विधि अन्य न्यूक्लियोटाइड-संवेदनशील आयन चैनलों के अध्ययन के लिए आसानी से अनुकूलित है। सीएफटीआर संरचनात्मक रूप से केएटीपी30,31 के सहायक सल्फोनीलुरिया रिसेप्टर सबयूनिट के समान है। जैसे केएटीपी सीएफटीआरआई गेटिंग न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग द्वारा नियंत्रित की जाती है, जिससे यह हमारी विधि7 का एक स्पष्ट भविष्य का लक्ष्य बन जाता है। प्यूरीनर्जिक पी 2 एक्स रिसेप्टर्स आयन चैनल हैं जो बाह्य एटीपी9 द्वारा गेट किए जाते हैं। टीएनपी-एटीपी पी 2 एक्स रिसेप्टर्स32,33 के लिए एक विरोधी के रूप में कार्य करता है। इसलिए, यह पी 2 एक्स सक्रियण का अध्ययन करने के लिए उपयोगी नहीं होगा, हालांकि इसका उपयोग पी 2 एक्स एगोनिस्ट के साथ प्रतिस्पर्धा परख में किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, सक्रियण का अध्ययन करने के लिए एएनएपी उत्सर्जन के साथ पर्याप्त वर्णक्रमीय ओवरलैप वाले अन्य फ्लोरोसेंट एटीपी डेरिवेटिव का उपयोग किया जा सकता है। एलेक्सा -647-एटीपी एक फ्लोरोसेंट पी 2 एक्स एगोनिस्ट34 है। एलेक्सा -647 और एएनएपी के बीच गणना की गई आर0 ~ 85 ए है, जिसका अर्थ है कि पी 2 एक्स के लिए सीधे बंधन के परिणामस्वरूप चैनल में शामिल एएनएपी का पर्याप्त शमन होना चाहिए। हालांकि, इस तरह के लंबे आर0 के परिणामस्वरूप पड़ोसी सबयूनिट्स से बंधे एलेक्सा -647-एटीपी से शमन भी होगा और संभावना बढ़ जाती है कि गैर-विशिष्ट न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग के परिणामस्वरूप फ्रेट होगा। चूंकि पी 2 एक्स रिसेप्टर्स में लिगैंड बाइंडिंग साइट बाह्य है, बाध्यकारी माप बरकरार कोशिकाओं पर, पूरे सेल वोल्टेज क्लैंप में, या बाहर-बाहर झिल्ली पैच में किया जाएगा। हमारी विधि को इलेक्ट्रोजेनिक और गैर-इलेक्ट्रोजेनिक ट्रांसपोर्टरों और पंपों के बंधन और सक्रियण का अध्ययन करने के लिए भी बढ़ाया जा सकता है जो अपने प्रतिक्रिया चक्र के साथ-साथ जी प्रोटीन युग्मित पी 2 वाई रिसेप्टर्स के लिए एटीपी पर निर्भर करते हैं। अंत में, भले ही हमने एडेनिन न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग (टीएनपी-एटीपी, टीएनपी-एडीपी, टीएनपी-एएमपी) को मापने के लिए इस विधि को विकसित किया है, उसी दृष्टिकोण का उपयोग लगभग किसी भी रिसेप्टर के लिए बाइंडिंग का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जिसके लिए एक उपयुक्त, फ्लोरोसेंट लिगैंड की पहचान की गई है।
The authors have nothing to disclose.
हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए राउल टेरोन एक्सपोसिटो को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद (बीबी / R002517 / 1) द्वारा वित्त पोषित किया गया था; एमसीपी और एफएमए) और वेलकम ट्रस्ट (203731 / जेड / 16 / ए; एसजीयू)
T75 tissue-culture treated flask | StarLab | CC7682-4875 | |
0.1% w/v poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
30 mm borosilicate cover glass slips | VWR | 631-0174 | |
35 mm non-treated sterile dishes | CytoOne | CC7672-3340 | |
35 mm cover glass bottom dish | WPI | FD35-PDL-100 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 31966021 | |
Foetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10500-064 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
TrypLE select (tryosin) | Gibco | 12563-011 | Trypsin/EDTA reagent |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14040-091 | |
UltraPure distilled water | Invitrogen | 10977-035 | |
HEK293T cells | ATTC | CRL-3216 | Used between passages 5-30 |
ANAP-TFA | AsisChem | ASIS-0014 | Reconstituted in 30 mM NaOH to a final concentration of 1 mM |
pANAP expression plasmid | Addgene | Plasmid #48696 | Encodes tRNA/tRNA synthetase pair for expression of ANAP-tagged protein |
peRF1-E55D | Chin Lab (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK) | Jason Chin: DOI: 10.1021/ja5069728 | Encodes dominant-negative eukaryotic ribosomal release factor |
TransIT-LT1 | Mirus Bio | MIR 2300 | Lipopolyplex transfection reagent |
Thick-walled borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | GC150F-15 | |
Tetramethylrhodamine-5-maleimide | Sigma-Aldrich | 94506 | |
TNP-ATP | Jena Bioscience | NU-221L | Delivered at 10 mM in water |
Nikon Eclipse TE2000-U inverted microscope microscope | Nikon | ||
60x water immersion objective (1.4 NA) | Nikon | MRD07602 | |
4-Wavelength High-Power LED Head | ThorLabs | LED4D245 | 385/490/565/625 nm LEDs |
Four-Channel LED Driver | ThorLabs | DC4100 | |
390/18 nm band-pass excitation filter | ThorLabs | MF390-18 | For ANAP excitation |
400 nm long-pass emission filter | ThorLabs | FEL0400 | For imaging ANAP spectra |
416 nm edge dichroic | ThorLabs | MD416 | For imaging ANAP spectra |
460/60 nm band-pass emission filter | ThorLabs | MF460-60 | Suggested wide band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B) |
470/10 nm band-pass emission filter | ThorLabs | FB470-10 | Suggested narrow band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B) |
531/40 band-pass excitation filter | Brightline | FF01-531/40-25 | For orange fluorescent protein (OFP) excitation |
540/25 nm band-pass excitation filter | Chroma | D540/25X | For tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMRM) excitation |
562 nm edge dichroic | Semrock | FF562-Di03 | For imaging OFP fluorescence |
565 nm edge dichroic | Chroma | 565DC | For imaging TMRM fluorescence |
593/40 nm band-pass excitation filter | Brightline | FF01-387/11-25 | For imaging OFP fluorescence |
605/55 nm band-pass emission filter | Chroma | D605/55M | For imaging TMRM fluorescence |
IsoPlane-160 Imaging Spectrometer | Princeton Instruments | IsoPlane-160 | |
PIXIS 400BR_eXcelon Camera | Princeton Instruments | PIXIS: 400BR_eXcelon | |
Axopatch 200B amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B-2 | |
Digidata 1440A digitizer | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
Probe sonicator | Sonics & Materials | VC-50 | For unroofing |
REGLO digital peristaltic pump | Ismatec | ISM 832 | For bath perfusion |
Microvolume perfusion system | ALA Scientific Instruments | ALA μFlow-8 | For TNP-ATP perfusion |
pClamp 10.6.2 | Molecular Devices | Recording and analysing currents | |
Lightfield 5.20.1507 | Princeton Instruments | Acquisition software for images and spectra | |
Matlab | Mathworks | For data analysis | |
Python 3.8.1 | Python Software Foundation | For data analysis |