Das Ziel dieses Verfahrens ist es, das dorsale Längsmuskelgewebe (DLM) zu sezieren, um die strukturelle Integrität von NEUROmuskulären DLM-Knoten (NMJs) in neurodegenerativen Krankheitsmodellen mit Drosophila melanogasterzu bewerten.
Drosophila dient als nützliches Modell für die Beurteilung der synaptischen Struktur und Funktion im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen. Während viel Arbeit auf neuromuskuläre Kreuzungen (NMJs) in Drosophila Larven konzentriert hat, Bewertung der synaptischen Integrität bei erwachsenen Drosophila hat viel weniger Aufmerksamkeit erhalten. Hier bieten wir eine einfache Methode zur Zerlegung der dorsalen Längsmuskeln (DLMs), die für die Flugfähigkeit erforderlich sind. Neben dem Flug als Verhaltensauslesung ermöglicht diese Sezierung, dass sowohl die DLM-Synapsen als auch das Muskelgewebe mit fluoreszierend markierten Antikörpern für synaptische Marker oder Proteine von Interesse strukturell analysiert werden können. Dieses Protokoll ermöglicht die Bewertung der strukturellen Integrität von Synapsen bei erwachsenen Drosophila während des Alterns, um die progressive, altersabhängige Natur der meisten neurodegenerativen Erkrankungen zu modellieren.
Synaptische Dysfunktion gehört zu den frühesten bekannten Kennzeichen der meisten wichtigsten neurodegenerativen Erkrankungen1,2,3,4,5,6. Allerdings ist sehr wenig darüber bekannt, wie diese strukturellen und funktionellen Beeinträchtigungen mit späteren Stadien der Krankheitsprogression zusammenhängen. Drosophila hat sich als ein nützliches Modellsystem für das Verständnis von Synapsenwachstum und Entwicklung mit Larven NMJs7,8,9. Die dritte Larven-Insternphase dauert jedoch nur wenige Tage und begrenzt ihren Nutzen beim Studium progressiver, altersabhängiger Neurodegeneration. Eine Alternative zur Beurteilung von Larven-NMJs ist die Untersuchung synaptischer Strukturen in erwachsenen Drosophila, wie die Synapsen, die auf den Dorsal Longitudinal Muscles (DLMs) gebildet werden, die für Flug10,,11,12,,13,14,15,,16benötigt werden. Diese dreigliedrigen Synapsen sind strukturell ähnlich wie Säugetiersynapsen17organisiert, was einen einzigartigen Vorteil für die Bewertung von Modellen neurodegenerativer Erkrankungen bietet.
Hier beschreiben wir eine einfache Methode zur Analyse der strukturellen Integrität von erwachsenen NMJs in einem Drosophila-Modell der Neurodegeneration. Frühere DLM-Sektionsmethoden und Studien haben die Bedeutung der Erhaltung von Muskelgewebe für eine Vielzahl von Anwendungenbetont 18,19,20,21,22,23. Unser Protokoll bietet eine umfassende Methode, um sowohl neuronales als auch Muskelgewebe zu erhalten, um neurodegenerative Erkrankungen zu untersuchen. Ein weiterer wichtiger Bestandteil des Studiums dieser Krankheiten ist die Fähigkeit, neuronalen Verlust in einer altersabhängigen Weise zu verstehen. Frühere Arbeiten liefern ein kritisches und tiefes Verständnis dafür, wie die DLM NMJs während der Metamorphose ins frühe Erwachsenenalter gebildet werden11,12,14,15,16,24. Unser Protokoll legt eine Methode fest, um auf dieser Arbeit aufzubauen, um DLM NMJs altersabhängig bei alternden und neurodegenerativen Erkrankungen zu untersuchen.
Mit den in diesem Protokoll beschriebenen Methoden bieten wir einen einfachen Ansatz für die Zerlegung des DLM-Gewebes und zeigen, wie dies angewendet werden kann, um die synaptische Integrität durch strukturelle Färbung und synaptische Marker bei erwachsenen Drosophila zu bewerten. Ein wichtiger Schritt im Protokoll, der das DLM-Gewebe leichter zu sezieren macht, ist das Einfrieren des Blitzes mit flüssigem Stickstoff. Ohne diesen Schritt ist das Gewebe weniger fest und schwieriger genau zu schneiden, wie in Abbildung 3beobachtet. Dieses Protokoll baut auf früheren Seziermethoden auf, um die Erhaltung von Motorneuronen und Muskelgewebe18,19,20,21,22,23zu ermöglichen. Eine Einschränkung dieses Protokolls ist, dass es schwierig sein kann, zwei saubere Preps pro Thorax zu erhalten, wenn man die Mittellinie für den Biabschnitt reduziert. Eine Möglichkeit, mindestens eine Hemithorax pro Fliege zu gewährleisten, können Sie absichtlich auf eine Seite des Thorax abgeschnitten werden, um eine saubere Vorbereitung zu erhalten. Mit dieser Modifikation muss man möglicherweise auch zusätzliches überschüssiges Gewebe aus dem Schnitt entfernen, um die Probe mit dem Klingenbrecher zu reinigen. Für diejenigen, die neu in dieser Technik, mit fortgesetzter Praxis, Genauigkeit der Bisektion erhöht.
Die hier beschriebene Methode ermöglicht es Forschern, die strukturelle Integrität von erwachsenen DLM-NMJs jederzeit während ihrer gesamten Lebensdauer einfach zu beurteilen. Ein großer Vorteil dieses Protokolls ist die Fähigkeit, auf synaptische Integrität in neurodegenerativen Krankheitsmodellen zuzugreifen, indem synaptische Marker verwendet werden. Wir zeigen, dass diese Anwendung helfen kann, Veränderungen in der groben Morphologie mit struktureller Färbung zu visualisieren (Abbildung 1C-u2012H). Darüber hinaus kann die synaptische Integrität mit der Färbung von präsynaptischen Markern bewertet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Synapsin28 (Abbildung 2A-u2012F), Syntaxin29 (Abbildung 2G-u2012L) und BRP30 (Abbildung 2M-u2012R). Das postsynaptische Muskelgewebe kann auch mit dem Glutamat-Rezeptor III-Subunit-Antikörper31 (Abbildung 2S-u2012X) bewertet werden, der den Nutzen dieses Protokolls demonstriert.
Forscher können diese Seziermethode auch nutzen, um funktionelle Daten zu ergänzen, um die strukturelle Integrität von Synapsen, die mit einer Vielzahl von Krankheiten verbunden sind, umfassend zu untersuchen. Diese Synapsen ermöglichen auch eine funktionelle Analyse durch elektrophysiologische Aufnahmen32,33,34 und den Flugtest10. Dieses Protokoll kann auch einen einfachen Zugang zum Gewebe für viele Anwendungen und Assays bieten. Zukünftige Studien könnten z. B. dieses Protokoll nutzen, um synaptische Veränderungen durch Quantifizierung der Dichte und Anzahl der Synapsen15,16zu quantifizieren. Während das hier beschriebene Protokoll speziell die synaptische Integrität von motorischen Neuronen untersucht, können komplementäre Protokolle zur Beurteilung des Muskelzellverlusts auch mit dieser Zerlegung mit TUNEL-Färbung35durchgeführt werden. Zur Untersuchung des neuronalen Verlustes könnte die Zerlegung des Brustganglials36 auch mit TUNEL-Färbung verwendet werden. Wir gehen davon aus, dass die hier beschriebene Sezierung mehr Anwendungen für zukünftige Studien zur Bewertung altersbedingter Pathologien sowie neurodegenerativer Erkrankungen haben wird.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (R01 NS110727) bis D.T.B unterstützt.
32% Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Tissue preservation |
Alexa Fluor 568 goat anti mouse | Fisher Scientific | A11031 | Labels primary antibodies. Used at 1:200 concentration. |
Alexa Fluor 568 goat anti rabbit | Fisher Scientific | A11036 | Labels primary antibodies. Used at 1:200 concentration. |
anti- Bruchpilot (BRP) antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | NC82 | Stains the active zones in presynaptic neurons. Used at 1:25 concentration. |
anti-GluRIII antibody | Gift from Aaron DiAntonio | N/A | Labels glutamate receptor subunits. Used at 1:1000 concentration. |
anti-Synapsin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3C11 | Labels the synaptic protein synapsin. Used at 1:50 concentration. |
anti-Syntaxin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 8C3 | labels the synaptic protein syntaxin. Used at 1:10 concentration. |
BenchRocker | Genesee Scientific | 31-302 | Rotating samples during staining |
Blade Breaker | Fine Science Tools | 10053-09 | Used for holding feather blade |
cover slips | Fisher Scientific | 12548A | For mounting tissue |
cryogenic gloves | VWR | 97008-198 | protect hands from liquid nitrogen |
cryogenic tweezers | VWR | 82027-432 | Hold 2.0 mL tube in liquid nitrogen |
dewar flask-1900 mL | Thomas Scientific | 5028M54 | Hold liquid nitrogen |
Feather Blades | Electron Microscopy Sciences | 72002-01 | Scalpel Blades |
Fine Forecps x 2 | Fine Science Tools | 11252-20 | One fine pair for Clearing midline of thorax. The other pair can be dulled using a sharpening stone. |
FITC-conjugated anti HRP | Jackson Laboratories | 123-545-021 | Stains Motor Neurons. Used at 1:100 concentration |
freezer box (Black) | Fisher Scientific | 14100F | Protects samples from light |
glass pasteur pipettes | VWR | 14637-010 | Used to transfer samples |
glass slides | Fisher Scientific | 12550143 | For mounting tissue |
mounting media (vectashield) anti-fade | VWR | 101098-042 | Mounting media retains fluorescent signaling |
nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | Seals microscope slides |
normal goat serum | Fisher Scientific | PCN5000 | Prevents non-specific binding of antibodies |
paint brush | Genesee Scientific | 59-204 | Transferring flies |
PBS | Fisher Scientific | 10-010-023 | Saline solution for dissecting and staining |
Phalloidin 647 | Abcam | AB176759 | Stains F-Actin in muscle Tissue. Used at 1:1000 concentration |
plastic petri dish (100 mm) | VWR | 25373-100 | Dissection dish |
reinforcement labels | W.B. Mason | AVE05722 | Provides support for glass coverslip over the mounted tissue |
sharpening block | Grainger | 1RDF5 | Keeping fine forceps sharp and also dulling separate pair |
slide folder | VWR | 10126-326 | Sample storage |
standard office scissors | W.B. Mason | ACM40618 | Cutting reinforcement labels |
Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Coating for dissection dish |
Triton-X-100 | Electron Microscopy Sciences | 22140 | Helps to permeabilize tissue |
Vannas Disssection Sissors | Fine Science Tools | 1500-00 | Ued for removing fly legs and making an incision on thorax |