Het doel van deze procedure is om het dorsale longitudinale spierweefsel (DLM) te ontleden om de structurele integriteit van DLM neuromusculaire knooppunten (NMJs) in neurodegeneratieve ziektemodellen te beoordelen met behulp van Drosophila melanogaster.
Drosophila dient als een nuttig model voor het beoordelen van synaptische structuur en functie geassocieerd met neurodegeneratieve ziekten. Hoewel veel werk is gericht op neuromusculaire knooppunten (NMJs) in Drosophila larven, heeft het beoordelen van synaptische integriteit bij volwassen Drosophila veel minder aandacht gekregen. Hier bieden we een eenvoudige methode voor dissectie van de ruglangsbeenspieren (DDLM’s), die nodig zijn voor vluchtvermogen. Naast de vlucht als een gedragsuitlezing, deze dissectie zorgt voor de zowel DLM synapsen en spierweefsel te vatbaar zijn voor structurele analyse met behulp van fluorescerend gelabeld antilichamen voor synaptische markers of eiwitten van belang. Dit protocol maakt de evaluatie van de structurele integriteit van synapsen bij volwassen Drosophila mogelijk tijdens het ouder worden om de progressieve, leeftijdsafhankelijke aard van de meeste neurodegeneratieve ziekten te modelleren.
Synaptische disfunctie is een van de vroegst bekende kenmerken van de meeste belangrijke neurodegeneratieve ziekten1,2,3,4,5,6. Er is echter zeer weinig bekend over hoe deze structurele en functionele stoornissen zich verhouden tot latere stadia van ziekteprogressie. Drosophila heeft bewezen een nuttig modelsysteem te zijn voor het begrijpen van synapsgroei en -ontwikkeling met larve NMJ’s7,8,9. Echter, de derde larve instar stadium duurt slechts een paar dagen, het beperken van hun nut in het bestuderen van progressieve, leeftijd-afhankelijke neurodegeneratie. Een alternatief voor de beoordeling van larve NMJs is het onderzoeken van synaptische structuren bij volwassen Drosophila, zoals de synapsen gevormd op de Dorsale Longitudinale Spieren (DDL’s) die nodig zijn voor vlucht10,11,12,13,14,15,16. Deze tripartiete synapsen zijn structureel georganiseerd op een vergelijkbare manier als zoogdier synapsen17, het verstrekken van een uniek voordeel voor de beoordeling van modellen van neurodegeneratieve ziekten.
Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor het analyseren van de structurele integriteit van volwassen NMJ’s in een Drosophila-model van neurodegeneratie. Eerdere DLM-dissectiemethoden en studies hebben het belang benadrukt van het behoud van spierweefsel voor een verscheidenheid aan toepassingen18,19,20,21,22,23. Ons protocol biedt een uitgebreide methode om zowel neuronaal als spierweefsel te behouden om neurodegeneratieve ziekten te onderzoeken. Een andere belangrijke component van het bestuderen van deze ziekten is het vermogen om neuronale verlies te begrijpen in een leeftijd afhankelijke manier. Eerder werk geeft een kritisch en diepgaand inzicht in hoe de DLM NMJs worden gevormd tijdens de metamorfose in de vroege volwassenheid11,12,14,15,16,24. Ons protocol stelt een methode om voort te bouwen op dit werk om DLM NMJs te onderzoeken op een leeftijdsafhankelijke manier bij veroudering en neurodegeneratieve ziekten.
Met behulp van de methoden beschreven in dit protocol, bieden we een eenvoudige aanpak voor dissectie van het DLM-weefsel en laten we zien hoe dit kan worden toegepast om synaptische integriteit te beoordelen door middel van structurele kleuring en synaptische markers in volwassen Drosophila. Een cruciale stap in het protocol dat het DLM weefsel gemakkelijker te ontleden maakt is de flitser bevriezen met vloeibare stikstof. Zonder deze stap is het weefsel minder stevig en moeilijker om precies te snijden zoals waargenomen in figuur 3. Dit protocol bouwt voort op eerdere dissectiemethoden om het behoud van zowel motorneuronen als spierweefsel mogelijk te maken18,19,20,21,22,23. Een beperking van dit protocol is dat bij het maken van de cut down de middellijn voor de bisection, kan het moeilijk zijn om twee schone preps per thorax te krijgen. Een manier om te zorgen voor ten minste een hemithorax per vlieg, u met opzet afgesneden aan de ene kant van de thorax om een schone prep te krijgen. Met deze wijziging kan het ook nodig zijn om extra overtollig weefsel uit de snede te verwijderen om het monster op te ruimen met de blade breaker. Voor degenen die nieuw zijn in deze techniek, met voortdurende praktijk, zal de nauwkeurigheid van de bissectie toenemen.
De hier beschreven methode stelt onderzoekers in staat om de structurele integriteit van volwassen DLM-NMJ’s op elk moment gedurende hun levensduur eenvoudig te beoordelen. Een groot voordeel van dit protocol is de mogelijkheid om synaptische integriteit in neurodegeneratieve ziektemodellen te openen met behulp van synaptische markers. We tonen aan dat deze toepassing kan helpen bij het visualiseren van veranderingen in de bruto morfologie met structurele kleuring(figuur 1C\u2012H). Bovendien kan synaptische integriteit worden beoordeeld met kleuring van presynaptische markers, waaronder maar niet beperkt tot Synapsin28 (Figuur 2A\u2012F), Syntaxin29 (Figuur 2G\u2012L) en BRP30 (Figuur 2M\u2012R). Het postsynaptische spierweefsel kan ook worden beoordeeld met behulp van de Glutamate Receptor III subunit antilichaam31 (Figuur 2S\u2012X), waaruit het nut van dit protocol.
Onderzoekers kunnen deze dissectiemethode ook gebruiken om functionele gegevens aan te vullen om de structurele integriteit van synapsen in verband met een breed scala aan ziekten grondig te onderzoeken. Deze synapsen maken ook functionele analyse mogelijk door middel van elektrofysiologische opnamen32,33,34 en de vluchttest10. Dit protocol kan ook gemakkelijk toegang tot het weefsel voor vele toepassingen en testen. Toekomstige studies kunnen dit protocol bijvoorbeeld gebruiken om synaptische veranderingen te kwantificeren door kwantificering van de dichtheid en het aantal synapsen15,16. Terwijl het hier beschreven protocol specifiek synaptische integriteit van motorneuronen onderzoekt, kunnen aanvullende protocollen voor het beoordelen van spiercelverlies ook met deze dissectie met behulp van TUNEL-kleuring35worden uitgevoerd. Om neuronale verlies te onderzoeken, dissectie van de thoracale ganglion36 kan ook worden gebruikt met TUNEL kleuring. We verwachten dat de hier beschreven dissectie meer toepassingen zal hebben voor toekomstige studies die leeftijdsgerelateerde pathologieën en neurodegeneratieve ziekten beoordelen.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (R01 NS110727) aan D.T.B.
32% Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Tissue preservation |
Alexa Fluor 568 goat anti mouse | Fisher Scientific | A11031 | Labels primary antibodies. Used at 1:200 concentration. |
Alexa Fluor 568 goat anti rabbit | Fisher Scientific | A11036 | Labels primary antibodies. Used at 1:200 concentration. |
anti- Bruchpilot (BRP) antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | NC82 | Stains the active zones in presynaptic neurons. Used at 1:25 concentration. |
anti-GluRIII antibody | Gift from Aaron DiAntonio | N/A | Labels glutamate receptor subunits. Used at 1:1000 concentration. |
anti-Synapsin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3C11 | Labels the synaptic protein synapsin. Used at 1:50 concentration. |
anti-Syntaxin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 8C3 | labels the synaptic protein syntaxin. Used at 1:10 concentration. |
BenchRocker | Genesee Scientific | 31-302 | Rotating samples during staining |
Blade Breaker | Fine Science Tools | 10053-09 | Used for holding feather blade |
cover slips | Fisher Scientific | 12548A | For mounting tissue |
cryogenic gloves | VWR | 97008-198 | protect hands from liquid nitrogen |
cryogenic tweezers | VWR | 82027-432 | Hold 2.0 mL tube in liquid nitrogen |
dewar flask-1900 mL | Thomas Scientific | 5028M54 | Hold liquid nitrogen |
Feather Blades | Electron Microscopy Sciences | 72002-01 | Scalpel Blades |
Fine Forecps x 2 | Fine Science Tools | 11252-20 | One fine pair for Clearing midline of thorax. The other pair can be dulled using a sharpening stone. |
FITC-conjugated anti HRP | Jackson Laboratories | 123-545-021 | Stains Motor Neurons. Used at 1:100 concentration |
freezer box (Black) | Fisher Scientific | 14100F | Protects samples from light |
glass pasteur pipettes | VWR | 14637-010 | Used to transfer samples |
glass slides | Fisher Scientific | 12550143 | For mounting tissue |
mounting media (vectashield) anti-fade | VWR | 101098-042 | Mounting media retains fluorescent signaling |
nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | Seals microscope slides |
normal goat serum | Fisher Scientific | PCN5000 | Prevents non-specific binding of antibodies |
paint brush | Genesee Scientific | 59-204 | Transferring flies |
PBS | Fisher Scientific | 10-010-023 | Saline solution for dissecting and staining |
Phalloidin 647 | Abcam | AB176759 | Stains F-Actin in muscle Tissue. Used at 1:1000 concentration |
plastic petri dish (100 mm) | VWR | 25373-100 | Dissection dish |
reinforcement labels | W.B. Mason | AVE05722 | Provides support for glass coverslip over the mounted tissue |
sharpening block | Grainger | 1RDF5 | Keeping fine forceps sharp and also dulling separate pair |
slide folder | VWR | 10126-326 | Sample storage |
standard office scissors | W.B. Mason | ACM40618 | Cutting reinforcement labels |
Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Coating for dissection dish |
Triton-X-100 | Electron Microscopy Sciences | 22140 | Helps to permeabilize tissue |
Vannas Disssection Sissors | Fine Science Tools | 1500-00 | Ued for removing fly legs and making an incision on thorax |