Målet med denne procedure er at dissekere dorsal langsgående muskel (DLM) væv til at vurdere den strukturelle integritet DLM neuromuskulære kryds (NMJs) i neurodegenerative sygdom modeller ved hjælp af Drosophila melanogaster.
Drosophila fungerer som en nyttig model til vurdering af synaptisk struktur og funktion forbundet med neurodegenerative sygdomme. Mens meget arbejde har fokuseret på neuromuskulære vejkryds (NMJs) i Drosophila larver, vurdering synaptisk integritet hos voksne Drosophila har fået langt mindre opmærksomhed. Her giver vi en enkel metode til dissektion af de dorsale langsgående muskler (DLD’er), som er nødvendige for flyvning evne. Ud over flyvning som en adfærdsmæssig udlæsning, denne dissektion giver mulighed for både DLM synapser og muskelvæv at være modtagelige for strukturel analyse ved hjælp af fluorescerende mærket antistoffer til synaptiske markører eller proteiner af interesse. Denne protokol giver mulighed for evaluering af den strukturelle integritet synapser hos voksne Drosophila under aldring til model den progressive, aldersafhængige karakter af de fleste neurodegenerative sygdomme.
Synaptisk dysfunktion er blandt de tidligste kendte kendetegn ved de fleste større neurodegenerative sygdomme1,2,,3,4,5,6. Men, meget lidt er kendt med hensyn til, hvordan disse strukturelle og funktionelle funktionsnedsættelser vedrører senere stadier af sygdomsprogression. Drosophila har vist sig at være et nyttigt modelsystem til forståelse af synapsvækst og -udvikling ved hjælp af larve NMJs7,8,9. Men, den tredje larve instar fase varer kun et par dage, begrænse deres nytte i at studere progressiv, aldersafhængig neurodegeneration. Et alternativ til vurdering af larve NMJs er at undersøge synaptiske strukturer hos voksne Drosophila, såsom synapser dannet på dorsale langsgående muskler (DLD), der er nødvendige for flyvning10,11,12,13,14,15,16. Disse trepartssynapser er strukturelt organiseret på samme måde som pattedyr synapser17, hvilket giver en unik fordel for vurderingen af modeller af neurodegenerative sygdomme.
Her beskriver vi en enkel metode til at analysere den strukturelle integritet af voksne NMJs i en Drosophila model af neurodegeneration. Tidligere DLM dissektion metoder og undersøgelser har understreget betydningen af at bevare muskelvæv for en række forskellige anvendelser18,19,20,21,22,23. Vores protokol giver en omfattende metode til at bevare både neuronal og muskelvæv til at undersøge neurodegenerative sygdomme. En anden vigtig komponent i at studere disse sygdomme er evnen til at forstå neuronal tab i en aldersafhængig måde. Tidligere arbejde giver en kritisk og dybtgående forståelseaf,hvordan DLM NMJs dannes under metamorfose i den tidligevoksenalder 11,12,14,15,16,24. Vores protokol etablerer en metode til at bygge videre på dette arbejde for at undersøge DLM NMJs på en aldersafhængig måde i aldrende og neurodegenerative sygdomme.
Ved hjælp af de metoder, der er beskrevet i denne protokol, giver vi en enkel tilgang til dissektion af DLM-vævet og demonstrerer, hvordan dette kan anvendes til at vurdere synaptisk integritet gennem strukturel farvning og synaptiske markører hos voksne Drosophila. Et kritisk skridt i protokollen, der gør DLM væv lettere at dissekere er flash frysning med flydende nitrogen. Uden dette trin er vævet mindre fast og vanskeligere at skære præcist som observeret i figur 3. Denne protokol bygger på tidligere dissektionsmetoder for at gøre det muligt at bevare både motoriske neuroner og muskelvæv18,19,20,21,22,23. En begrænsning af denne protokol er, at når du foretager skære ned midterlinjen for bsektion, kan det være svært at få to rene preps per brystkasse. En måde at sikre mindst én hemithorax per flue, kan du med vilje afskære til den ene side af brystkassen for at få en ren prep. Med denne modifikation kan det også være nødvendigt at fjerne yderligere overskydende væv fra snittet for at rydde op i prøven med klingebruddet. For dem nye til denne teknik, med fortsat praksis, nøjagtigheden af bisection vil stige.
Den metode, der er beskrevet her giver forskerne mulighed for nemt at vurdere den strukturelle integritet af voksne DLM NMJs til enhver tid i hele deres levetid. En stor fordel ved denne protokol er evnen til at få adgang til synaptisk integritet i neurodegenerative sygdomsmodeller ved hjælp af synaptiske markører. Vi viser, at denne ansøgning kan hjælpe med at visualisere ændringer i grov morfologi med strukturel farvning(Figur 1C\u2012H). Derudover kan synaptisk integritet vurderes med farvning af præsynaptiske markører, herunder, men ikke begrænset til, Synapsin28 (Figur 2A\u2012F), Syntaxin29 (Figur 2G\u2012L) og BRP30 (Figur 2M\u2012R). Det postsynaptiske muskelvæv kan også vurderes ved hjælp af glutamatreceptor III-underenhedens antistof31 (Figur 2S\u2012X), der demonstrerer nytten af denne protokol.
Forskere kan også bruge denne dissektion metode til at supplere funktionelle data til omfattende undersøge den strukturelle integritet synapser forbundet med en bred vifte af sygdomme. Disse synapser giver også mulighed for funktionel analyse gennem elektrofysiologiskeoptagelser 32,33,34 og flyanalyse10. Denne protokol kan også give nem adgang til vævet for mange applikationer og analyser. Fremtidige undersøgelser, for eksempel, kunne bruge denne protokol til at kvantificere synaptiske ændringer gennem kvantificering af tætheden og antallet af synapser15,16. Mens den protokol, der er beskrevet her specifikt undersøger synaptisk integritet af motoriske neuroner, supplerende protokoller til vurdering af muskel celletab kan også udføres med denne dissektion ved hjælp af TUNEL farvning35. At undersøge neuronal tab, dissektion af thorax ganglion36 kunne også anvendes med TUNEL farvning. Vi forventer, at den her beskrevne dissektion vil have flere ansøgninger til fremtidige undersøgelser, der vurderer aldersrelaterede patologier samt neurodegenerative sygdomme.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (R01 NS110727) til D.T.B.
32% Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Tissue preservation |
Alexa Fluor 568 goat anti mouse | Fisher Scientific | A11031 | Labels primary antibodies. Used at 1:200 concentration. |
Alexa Fluor 568 goat anti rabbit | Fisher Scientific | A11036 | Labels primary antibodies. Used at 1:200 concentration. |
anti- Bruchpilot (BRP) antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | NC82 | Stains the active zones in presynaptic neurons. Used at 1:25 concentration. |
anti-GluRIII antibody | Gift from Aaron DiAntonio | N/A | Labels glutamate receptor subunits. Used at 1:1000 concentration. |
anti-Synapsin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3C11 | Labels the synaptic protein synapsin. Used at 1:50 concentration. |
anti-Syntaxin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 8C3 | labels the synaptic protein syntaxin. Used at 1:10 concentration. |
BenchRocker | Genesee Scientific | 31-302 | Rotating samples during staining |
Blade Breaker | Fine Science Tools | 10053-09 | Used for holding feather blade |
cover slips | Fisher Scientific | 12548A | For mounting tissue |
cryogenic gloves | VWR | 97008-198 | protect hands from liquid nitrogen |
cryogenic tweezers | VWR | 82027-432 | Hold 2.0 mL tube in liquid nitrogen |
dewar flask-1900 mL | Thomas Scientific | 5028M54 | Hold liquid nitrogen |
Feather Blades | Electron Microscopy Sciences | 72002-01 | Scalpel Blades |
Fine Forecps x 2 | Fine Science Tools | 11252-20 | One fine pair for Clearing midline of thorax. The other pair can be dulled using a sharpening stone. |
FITC-conjugated anti HRP | Jackson Laboratories | 123-545-021 | Stains Motor Neurons. Used at 1:100 concentration |
freezer box (Black) | Fisher Scientific | 14100F | Protects samples from light |
glass pasteur pipettes | VWR | 14637-010 | Used to transfer samples |
glass slides | Fisher Scientific | 12550143 | For mounting tissue |
mounting media (vectashield) anti-fade | VWR | 101098-042 | Mounting media retains fluorescent signaling |
nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | Seals microscope slides |
normal goat serum | Fisher Scientific | PCN5000 | Prevents non-specific binding of antibodies |
paint brush | Genesee Scientific | 59-204 | Transferring flies |
PBS | Fisher Scientific | 10-010-023 | Saline solution for dissecting and staining |
Phalloidin 647 | Abcam | AB176759 | Stains F-Actin in muscle Tissue. Used at 1:1000 concentration |
plastic petri dish (100 mm) | VWR | 25373-100 | Dissection dish |
reinforcement labels | W.B. Mason | AVE05722 | Provides support for glass coverslip over the mounted tissue |
sharpening block | Grainger | 1RDF5 | Keeping fine forceps sharp and also dulling separate pair |
slide folder | VWR | 10126-326 | Sample storage |
standard office scissors | W.B. Mason | ACM40618 | Cutting reinforcement labels |
Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Coating for dissection dish |
Triton-X-100 | Electron Microscopy Sciences | 22140 | Helps to permeabilize tissue |
Vannas Disssection Sissors | Fine Science Tools | 1500-00 | Ued for removing fly legs and making an incision on thorax |