이 절차의 목표는 Drosophila melanogaster를사용하여 신경 퇴행성 질환 모델에서 DLM 신경 근육 접합 (NMJs)의 구조적 무결성을 평가하기 위해 등쪽 세로 근육 (DLM) 조직을 해부하는 것입니다.
Drosophila는 신경 퇴행성 질환과 관련된 시냅스 구조 및 기능을 평가하기위한 유용한 모델역할을합니다. 많은 작업이 드로소필라 애벌레의 신경 근육 접합 (NMJs)에 초점을 맞추고 있지만 성인 Drosophila의 시냅스 무결성을 평가하는 것은 훨씬 덜 주의를 기울였습니다. 여기서 우리는 비행 능력에 필요한 등쪽 세로 근육 (DlM)의 해부에 대한 간단한 방법을 제공합니다. 행동 판독으로 비행 뿐만 아니라, 이 해부는 DM 시냅스와 근육 조직 모두 시냅스 마커 또는 관심있는 단백질에 대한 형광 표지 항체를 사용하여 구조적 분석에 순종할 수 있게 한다. 이 프로토콜은 대부분의 신경 퇴행성 질환의 진보적이고 연령 의존적 특성을 모델링하기 위해 노화 중 성인 Drosophila에서 시냅스의 구조적 무결성을 평가할 수 있게 합니다.
시냅스 기능 장애는 대부분의 주요 신경 퇴행성 질환1,2,3,,4,,,,5,,6의초기 알려진 특징 중 하나입니다. 그러나 이러한 구조적 및 기능적 손상이 질병 진행의 후반 단계에 어떻게 관련되는지에 대해서는 거의 알려져 하지 않습니다. 드로소필라는 애벌레 NMJs,7,8,89를사용하여 시냅스의 성장과 발전을 이해하는 데 유용한 모델 시스템으로 입증되었습니다. 그러나, 세 번째 애벌레 인스타 단계는 진보적 인, 연령 의존 신경 변성을 공부에 자신의 유틸리티를 제한, 며칠 지속. 애벌레 NMJs를 평가하기,위한 대안은10,,,11,,12,,13,14,15,,16에필요한 도르살 경도 근육(DlM)에 형성된 시냅스와 같은 성인 드로소필라의시냅스 구조를 검사하는 것이다. 이러한 삼자 시냅스는 포유류 시냅스17과유사한 방식으로 구조적으로 조직되어 신경 퇴행성 질환의 모델을 평가하기 위한 독특한 이점을 제공한다.
여기에서 우리는 신경 변성의 Drosophila 모형에 있는 성인 NMJs의 구조적인 무결성을 분석하기 위한 간단한 방법을 기술합니다. 이전 DLM 해부 방법 및 연구는 다양한 응용 프로그램에 대한 근육 조직을 보존하는 중요성을 강조했다18,,19,,20,,21,,22, 23.,23 우리의 프로토콜은 신경 퇴행성 질환을 조사하기 위해 신경 조직과 근육 조직을 모두 보존하는 포괄적 인 방법을 제공합니다. 이 질병을 공부의 또 다른 주요 구성 요소는 나이 종속 방식으로 신경 손실을 이해하는 기능. 이전 작품은 DLM NMJ가 초기 성인11,12,,14,,15,,16,24로변신하는 동안 어떻게 형성되는지에 대한비판적이고심층적인 이해를 제공한다., 우리의 프로토콜은 노화와 신경 퇴행성 질환의 연령 의존적 방식으로 DLM NMJs를 조사하기 위해이 작업을 기반으로하는 방법을 수립합니다.
이 프로토콜에 설명된 방법을 사용하여, 우리는 DLM 조직의 해부에 대한 간단한 접근을 제공하고 성인 Drosophila의 구조적 염색 및 시냅스 마커를 통해 시냅스 무결성을 평가하기 위해 이것이 어떻게 적용될 수 있는지 보여줍니다. DLM 조직을 해부할 수 있도록 하는 프로토콜의 한 가지 중요한 단계는 액체 질소로 플래시 동결입니다. 이 단계없이, 조직은 덜 단단하고 도 3에서관찰된 대로 정확하게 절단하기 가 더 어렵다. 이 프로토콜은 이전 해부 방법을 기반으로 운동 뉴런과 근육조직(18,,19,20,,,21,,22,23)의23보존을 허용한다. 이 프로토콜의 한 가지 제한은 양단의 중간선을 줄일 때 흉부당 두 개의 깨끗한 준비를 얻기어려울 수 있다는 것입니다. 플라이당 하나 이상의 헴피토락을 보장하는 한 가지 방법은 흉부 의 한 쪽으로 의도적으로 잘라 내어 하나의 깨끗한 준비를 할 수 있습니다. 이 수정을 통해 블레이드 브레이커로 샘플을 정리하기 위해 절단에서 추가 과잉 조직을 제거해야 할 수도 있습니다. 이 기술에 새로운 사람들을 위해, 지속적인 연습으로, 양분의 정확도가 증가 할 것이다.
여기에 설명된 방법은 연구원이 수명 내내 언제든지 성인 DLM NMJ의 구조적 무결성을 쉽게 평가할 수 있게 합니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 시냅스 마커를 사용하여 신경 퇴행성 질환 모델의 시냅스 무결성에 액세스 하는 기능. 이 응용 프로그램은 구조적 염색(그림 1C\u2012H)을통해 총 형태학의 변화를 시각화하는 데 도움이 될 수 있음을 보여줍니다. 또한 시냅틱 무결성은시냅신(28)을 포함하되 이에 국한되지 않는 사전 시냅스 마커의 염색으로 평가할 수있다(그림 2A\u2012F),Syntaxin29 (그림 2G\u2012L)및 BRP30(그림 2M\u2012R). 포스트냅스 근육 조직은 또한 조미료 수용체 III 하위 단위항체(31)를 사용하여 평가될 수있다(도 2S\u2012X),이 프로토콜의 유용성을 입증한다.
연구원은 또한 포괄적인 질병의 다양한와 관련 되 었던 시 냅 스의 구조적 무결성을 검사 하는 기능 데이터를 보완 하기 위해이 해부 방법을 활용할 수 있습니다. 이들 시냅스는 또한 전기생리학적 기록32,,33,,34 및 비행분석(10)을통한 기능적 분석을 허용한다. 이 프로토콜은 또한 많은 응용 프로그램 및 분석에 대한 조직에 대한 액세스의 용이성을 제공 할 수 있습니다. 향후 연구는 예를 들어 이 프로토콜을 사용하여시냅스 15,,16의밀도 및 수의 정량화를 통해 시냅스 변화를 정량화할 수 있다. 여기에 설명된 프로토콜은 특히 운동 뉴런의 시냅스 무결성을 검사하지만, 근육 세포 손실을 평가하기 위한 보완 프로토콜은 TUNEL 염색35를사용하여 이 해부로 수행될 수 있다. 신경 손실을 검사하기 위해 흉부 신경절36의 해부는 TUNEL 염색과 함께 사용될 수 있습니다. 우리는 여기에서 기술된 해부는 신경 퇴행성 질병뿐만 아니라 나이 관련 병리를 평가하는 미래 연구 결과에 더 많은 응용프로그램이 있을 것이라는 점을 기대합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 D.T.B에 건강의 국가 학회 (R01 NS110727)에 의해 지원되었다.
32% Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Tissue preservation |
Alexa Fluor 568 goat anti mouse | Fisher Scientific | A11031 | Labels primary antibodies. Used at 1:200 concentration. |
Alexa Fluor 568 goat anti rabbit | Fisher Scientific | A11036 | Labels primary antibodies. Used at 1:200 concentration. |
anti- Bruchpilot (BRP) antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | NC82 | Stains the active zones in presynaptic neurons. Used at 1:25 concentration. |
anti-GluRIII antibody | Gift from Aaron DiAntonio | N/A | Labels glutamate receptor subunits. Used at 1:1000 concentration. |
anti-Synapsin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3C11 | Labels the synaptic protein synapsin. Used at 1:50 concentration. |
anti-Syntaxin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 8C3 | labels the synaptic protein syntaxin. Used at 1:10 concentration. |
BenchRocker | Genesee Scientific | 31-302 | Rotating samples during staining |
Blade Breaker | Fine Science Tools | 10053-09 | Used for holding feather blade |
cover slips | Fisher Scientific | 12548A | For mounting tissue |
cryogenic gloves | VWR | 97008-198 | protect hands from liquid nitrogen |
cryogenic tweezers | VWR | 82027-432 | Hold 2.0 mL tube in liquid nitrogen |
dewar flask-1900 mL | Thomas Scientific | 5028M54 | Hold liquid nitrogen |
Feather Blades | Electron Microscopy Sciences | 72002-01 | Scalpel Blades |
Fine Forecps x 2 | Fine Science Tools | 11252-20 | One fine pair for Clearing midline of thorax. The other pair can be dulled using a sharpening stone. |
FITC-conjugated anti HRP | Jackson Laboratories | 123-545-021 | Stains Motor Neurons. Used at 1:100 concentration |
freezer box (Black) | Fisher Scientific | 14100F | Protects samples from light |
glass pasteur pipettes | VWR | 14637-010 | Used to transfer samples |
glass slides | Fisher Scientific | 12550143 | For mounting tissue |
mounting media (vectashield) anti-fade | VWR | 101098-042 | Mounting media retains fluorescent signaling |
nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | Seals microscope slides |
normal goat serum | Fisher Scientific | PCN5000 | Prevents non-specific binding of antibodies |
paint brush | Genesee Scientific | 59-204 | Transferring flies |
PBS | Fisher Scientific | 10-010-023 | Saline solution for dissecting and staining |
Phalloidin 647 | Abcam | AB176759 | Stains F-Actin in muscle Tissue. Used at 1:1000 concentration |
plastic petri dish (100 mm) | VWR | 25373-100 | Dissection dish |
reinforcement labels | W.B. Mason | AVE05722 | Provides support for glass coverslip over the mounted tissue |
sharpening block | Grainger | 1RDF5 | Keeping fine forceps sharp and also dulling separate pair |
slide folder | VWR | 10126-326 | Sample storage |
standard office scissors | W.B. Mason | ACM40618 | Cutting reinforcement labels |
Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Coating for dissection dish |
Triton-X-100 | Electron Microscopy Sciences | 22140 | Helps to permeabilize tissue |
Vannas Disssection Sissors | Fine Science Tools | 1500-00 | Ued for removing fly legs and making an incision on thorax |