단일 핵 세포세포의 다중 파라미터 흐름 세포측정 분석을 위한 마우스 눈 전체의 소화
Summary
본 프로토콜은 단핵세포, 마이크로글리아, 대식세포 및 수지상 세포를 포함하는 특정 안구 단핵 교핵 세포집단을 식별하기 위해 다중 파라미터 유동 세포측정 분석을 목적으로 전체 눈을 단일 세포 현탁액으로 소화하는 방법을 제공한다.
Abstract
타고난 면역 계통은 방류염, 당뇨병 망막병증 및 나이 관련 황반 변성을 포함하여 안구 병리학에서 중요한 역할을 합니다. 선천성 면역 세포, 특히 단핵 phagocytes는, 이 인구를 확인하는 도전을 만드는 중첩된 세포 표면 마커를 표현합니다. 다중 파라미터 흐름 세포측정은 마우스 눈에서 단핵구, 대식세포, 마이크로글리아 및 수지상 세포를 분화하기 위해 다중 세포 표면 마커의 동시적 정량적 분석을 가능하게 한다. 이 프로토콜은 전체 마우스 눈의 enucleation, 안구 해부, 단일 세포 현탁액으로의 소화 및 골수성 세포 마커에 대한 단일 세포 현탁액의 염색을 설명합니다. 또한 단일 색상 컨트롤을 사용하여 전압을 결정하고 형광을 사용하여 양성 게이트를 구분하는 데 적합한 방법을 설명합니다. 다중 파라미터 흐름 세포측정의 주요 한계는 조직 아키텍처의 부재이다. 이러한 제한은 개별 안구 구획의 다중 파라미터 흐름 세포측정또는 무료 면역형광 염색에 의해 극복될 수 있다. 그러나 면역 형광은 대부분의 현미경에 정량적 분석의 부족과 형광수 감소에 의해 제한됩니다. 우리는 레이저 유도 된 천체 신생 혈관화에서 단핵 phagocytes의 고도로 정량적 분석을 제공하기 위해 다중 파라메트릭 흐름 세포측정제의 사용을 설명합니다. 또한, 다중 파라미터 흐름 세포측정은 전사 또는 프로테오믹 연구를 위한 대식세포 서브세트, 운명 매핑 및 세포 분류의 식별에 사용될 수 있다.
Introduction
타고난 면역 계통은 보충 활성화 및 염증을 자극하는 다중 세포 모형을 포함합니다. 타고난 면역 세포는 자연 살인자 (NK) 세포, 비만 세포, basophils, 호산구, 호중구 및 단핵 phagocytes를 포함합니다. 단핵 세포, 대식세포 및 수지상 세포로 구성된 단핵 phagocytes는, 포도막염, 당뇨병 망막증 및 나이 관련 황반 변성을 포함하여 다중 안과 조건의 병리생리학에 연루되었습니다 (AMD)1. 이 프로토콜에서는, 우리는 neovascular AMD2의마우스 모형에 있는 다중 파라미터 유량 세포측정 분석을 사용하여 단핵 phagocytes의 식별에 집중할 것입니다. 이 프로토콜은 당뇨병 망막증 및/또는 방류염의 마우스 모델에 적응할 수 있지만 이러한 질병의 전신 특성 때문에 더 광범위한 안구 해부를 권장합니다.
단일 핵 세포는 중첩 세포 표면 마커를 표현합니다. 오래 지속되는 조직 상주 대식세포 및 마이크로글리아는 노른자 낭 유래 에리스로마일로이드 전구체3로부터유래하며, 대식세포및 수지상세포를 재활용하면서 골수 유래 대식세포 수지상 세포 전구4와분화한다. 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포에 공통적인 마우스 세포 표면 마커는 CD45, CD11b5,F4/806,Cx3cr17및 세포내 마커 Iba18을포함한다. 이러한 과제를 극복하기 위해 다중 조직에서 대식세포, 단핵구 및 수지상 세포의 전사 분석은 CD64를 대식세포 별 세포 표면 마커6으로정의한다. 대식세포는 아이리스, 코로이드, 주모체 및 시신경에서 건강한 눈3에서기술되었다. 대안적으로, 수지상 세포 식별은 더 어렵습니다; 수지상 세포 식별의 가장 구체적인 방법은 Zbtb46-GFP 리포터 마우스9를사용하여 운명 매핑이 필요합니다. 이러한 리포터 라인과 무관한 CD64의 부재와 함께 CD11c 및 MHCII의 발현은 잠재적 수지상 세포6,10을식별할 수 있다. 수지상 세포는 정상눈(11)에서각막, 결막, 홍채 및 코로이드에서 확인되었습니다. Microglia는 망막에 위치한 전문 대식세포이며, 혈액 망막 장벽에 의해 보호되고, 노른자 낭 전구세포(12)로부터유래된다. 그 결과, 망막 마이크로글리아는 CD45발현(13)과 높은 수준의 Tmem119의 희미한 수준에 의해 단세포 유래 대식세포로부터 분화될 수 있으며, 이는 유동 세포측정항체(14)로이용된다. microglia 활성화시, 그러나, CD45는15및 Tmem119가 마이크로글리아 생물학의 복잡성을 보여주는 다운 규제3일수 있고 이것은 AMD와 그것의 마우스 모형 둘 다에서 관련될 가능성이 높습니다. 마지막으로, 단핵구는 고전과 비고전을 포함하여 적어도 두 개의 특수형으로 나눌 수 있습니다. 클래식 단핵구디스플레이 CCR2+Ly6C높은CX3CR1낮은 발현, 비클래식 단핵구는 CCR2-Ly6C로우CX3CR1하이 마커5를보여줍니다.
마커 발현의 정량적 분석의 필요성으로 인해, 즉, 낮은/딤 수준대 높은, 다중 파라미터 흐름 세포분석은 눈 및 기타 조직에서 단핵구, 대식세포, 마이크로글리아 및 수지상 세포 간의 차별을 위한 이상적인 방법입니다. 추가적인 이점은 하위 집단의 식별, 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 전사 또는 프로테오믹 분석을 위한 세포 집단을 분류하는 기능, 운명 매핑을 포함한다. 다중 파라미터 흐름 세포측정의 주요 단점은 조직 아키텍처의 부족이다. 각막, 결막, 홍채, 렌즈, 망막 및 choroid-sclera 복합체 : 이것은 다양한 안구 하위 구획으로 안과 해부에 의해 극복 될 수있다. 추가적으로, 확인 면역 형광 화상 진찰은 수행될 수 있습니다, 그러나 마커의 수 및 강력한 수량의 부족에 의해 제한됩니다.
게놈 넓은 협회 연구는 AMD16과다중 보완 유전자를 연결했다. 보완 활성화는 아나필라톡신 생산, 백혈구 모집 및 결과 염증으로 이어집니다. 보완 수용체 결핍 마우스에서 레이저 부상은 단핵 phagocyte 모집 및 레이저 유도 된 천골 신혈관화 (CNV)영역(17)을감소시킨다. 유사하게, C-C 모티프 케모키네 수용체 2(CCR2) 녹아웃 마우스는 조직에 대한 단세포 모집에 결핍되어, 단일핵 세포모집및 레이저 유도 CNV영역(18)을모두 감소시키는 것을 보여준다. 이러한 데이터 링크는 실험적인 CNV 및 아마도 신생 혈관 AMD와 상호 핵 phagocytes를 보완합니다. 이 협회의 지원에서, 보충 수용체는 신생아 AMD19,20을가진 환자에 있는 말초 혈액 단핵구에 소화된다. 이 데이터는 AMD와 단핵 phagocytes 사이 강한 협회를 보여줍니다.
본 원고에서는, 다중 파라미터 유동 세포측정을 이용하여 마우스 눈내의 단일핵 식세포 집단을 특성화하기 위해 실험레이저 유도 CNV 모델을 사용할 것이다. 레이저 유도 CNV는 현재 제1회 선 neovascular AMD치료(21)의효능을 입증한 중혈관 AMD의 표준 마우스 모델이다. 이 프로토콜은 마우스 눈의 enucleation, 안구 해부, 단일 세포 현탁액으로의 소화, 항체 염색, 단일 색상 제어를 사용하여 레이저 전압의 결정 및 형광을 뺀 하나(FMO) 컨트롤을 사용하여 게이팅 전략을 설명합니다. 레이저 유도 CNV 모델에 대한 자세한 설명은 이전간행물(22)을참조하십시오. 이 프로토콜을 사용하여 마이크로글리아, 단핵구, 수지상 세포 및 대식세포 집단을 정의합니다. 또한, 우리는 MHCII와 CD11c를 사용하여 레이저 유도 된 CNV 모델 내에서 대식세포 하위 집합을 더욱 정의할 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
다중 파라미터 유동 세포측정은 복잡한 조직에서 다중 세포 유형의 정량적 분석을 가능하게 한다. 이 보고서에서는 마우스 눈의 레이저 부상 후 단핵 세포, 수지상 세포 및 대식세포 서브셋을 포함한 단일 핵 세포 개체 개체 집단의 유동 세포 측정 검출을 설명합니다. Liyanage 등은 최근 호중구, 호산구, 림프구, DC, 대식세포, 침투 대식세포 및단핵구(27)를검출하기 위한 유사한 게?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JAL은 NIH 보조금 K08EY030923에 의해 지원되었다; CMC는 NIH 국립 관절염 및 근골격계 질병 연구소의 K01 교부금(5K01AR060169)과 루푸스 연구 연합의 참신연구보조금(637405)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 0.6 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tubes | Costar | 3620 | |
| 10 ml pipettes | Fisher Scientific | 431031 | |
| 15 ml conicals | ThermoFisher | 339650 | |
| 1x HBSS, 500 ml | Gibco | 14025-092 | |
| 2.5 ml syringe | Henke Sass Wolf | 7886-1 | |
| 20% paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | |
| 25 ml pipettes | Fisher Scientific | 431032 | |
| 30 G needle | Exel | 26437 | |
| 3ml luer lock syringe | Fisher Scientific | 14955457 | |
| 41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dish | Fisher Scientific | 08-732-112 | |
| 50 ml conicals | Falcon | 352070 | |
| 96-well, U-bottom assay plate without lid | Falcon | 353910 | |
| Amine reactive beads | ThermoFisher | A10628 | |
| Analysis software | FlowJo | v 10 | |
| Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead set | BD Biosciences | 552845 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| Cell counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell counter slides | Invitrogen | C10283 | |
| Compensation beads | ThermoFisher | 01-1111-42 | |
| Count beads | ThermoFisher | 01-1234-42 | |
| Curved forceps | Fisher Scientific | 16-100-123 | |
| Digestion enzyme | Sigma Aldrich | 5401020001 | |
| Dissecting microscope | National Optical and Scientific Instruments, Inc. | DC3-420T | |
| Dissociation tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Electronic dissociator | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | |
| Fine forceps | Integra Miltex | 17035X | |
| Flow buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Flow tubes | Falcon | 352008 | |
| Hamster anti-mouse CD11c BV421 | BD Biosciences | 562782 | |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 07-210-123 | |
| Live/Dead dye | ThermoFisher | 65-0866-14 | |
| Lysing solution, 10x solution | BD Biosciences | 555899 | |
| Micro titer tube and rack | Fisher Scientific | 02-681-380 | |
| Mouse anti-mouse CD64 PE | BioLegend | 139304 | |
| Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594 | BD Biosciences | 562864 | |
| P1000 pipet tips | Denville Scientific | P2404 | |
| P1000 pipettor | Gilson | FA10006M | |
| P2 pipet tips | eppendorf | 22491806 | |
| P2 pipettor | Gilson | FA10001M | |
| P20 pipettor | Gilson | FA10003M | |
| P200 pipet tips | Denville Scientific | P2401 | |
| P200 pipettor | Gilson | FA10005M | |
| Pipet man | Fisher Scientific | FB14955202 | |
| Rat anti-mouse B220 PECF594 | BD Biosciences | 562313 | |
| Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7 | BD Biosciences | 557657 | |
| Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700 | BD Biosciences | 557958 | |
| Rat anti-mouse CD19 PE | BD Biosciences | 553786 | |
| Rat anti-mouse CD4 PECF594 | BD Biosciences | 562314 | |
| Rat anti-mouse CD45 FITC | ThermoFisher | 11-0451-82 | |
| Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7 | BD Biosciences | 552848 | |
| Rat anti-mouse CD8 PECF594 | BD Biosciences | 562315 | |
| Rat anti-mouse Ly6C | BD Biosciences | 561085 | |
| Rat anti-mouse Ly6G PECF594 | BD Biosciences | 562700 | |
| Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700 | BioLegend | 107622 | |
| Rat anti-mouse Siglec F PECF594 | BD Biosciences | 562757 | |
| Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647 | BD Biosciences | 564178 | |
| Shaking incubator | Labnet | 311DS | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Sterile cell strainer, 40 mm nylon mesh | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Sterile water, 500 ml | Gibco | A12873-01 | |
| Swinging bucket centrifuge | eppendorf | 5910 R | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Gibco | 15250061 |
Referencias
- Chinnery, H. R., McMenamin, P. G., Dando, S. J. Macrophage physiology in the eye. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (3-4), 501-515 (2017).
- Droho, S., Cuda, C. M., Perlman, H., Lavine, J. A. Monocyte-Derived Macrophages Are Necessary for Beta-Adrenergic Receptor-Driven Choroidal Neovascularization Inhibition. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (15), 5059-5069 (2019).
- O’Koren, E. G., et al. Microglial Function Is Distinct in Different Anatomical Locations during Retinal Homeostasis and Degeneration. Immunity. 50 (7), 723-727 (2019).
- Kratofil, R. M., Kubes, P., Deniset, J. F. Monocyte Conversion During Inflammation and Injury. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 35-42 (2017).
- Zimmermann, H. W., Trautwein, C., Tacke, F. Functional role of monocytes and macrophages for the inflammatory response in acute liver injury. Frontiers in Physiology. 3, 56 (2012).
- Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
- Sutti, S., et al. CX3CR1 Mediates the Development of Monocyte-Derived Dendritic Cells during Hepatic Inflammation. Cells. 8 (9), 1099 (2019).
- Liu, J., et al. Myeloid Cells Expressing VEGF and Arginase-1 Following Uptake of Damaged Retinal Pigment Epithelium Suggests Potential Mechanism That Drives the Onset of Choroidal Angiogenesis in Mice. PLoS One. 8 (8), 72935 (2013).
- Satpathy, A. T., et al. Zbtb46 expression distinguishes classical dendritic cells and their committed progenitors from other immune lineages. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1135-1152 (2012).
- Krause, T. A., Alex, A. F., Engel, D. R., Kurts, C., Eter, N. VEGF-Production by CCR2-Dependent Macrophages Contributes to Laser-Induced Choroidal Neovascularization. PLoS One. 9 (4), 94313 (2014).
- Lin, W., Liu, T., Wang, B., Bi, H. The role of ocular dendritic cells in uveitis. Immunology Letters. 209, 4-10 (2019).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
- O’Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Science Reports. 6, 20636 (2016).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Müller, A., Brandenburg, S., Turkowski, K., Müller, S., Vajkoczy, P. Resident microglia, and not peripheral macrophages, are the main source of brain tumor mononuclear cells. International Journal of Cancer. 137 (2), 278-288 (2014).
- McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. Age-related macular degeneration and the role of the complement system. Molecular Immunology. 67 (1), 43-50 (2015).
- Nozaki, M., et al. Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (7), 2328-2333 (2006).
- Tsutsumi, C. The critical role of ocular-infiltrating macrophages in the development of choroidal neovascularization. Journal of Leukocyte Biology. 74 (1), 25-32 (2003).
- Subhi, Y., et al. Association of CD11b +Monocytes and Anti–Vascular Endothelial Growth Factor Injections in Treatment of Neovascular Age-Related Macular Degeneration and Polypoidal Choroidal Vasculopathy. JAMA Ophthalmology. 137 (5), 515-518 (2019).
- Singh, A., et al. Altered Expression of CD46 and CD59 on Leukocytes in Neovascular Age-Related Macular Degeneration. AJOPHT. 154 (1), 193-199 (2012).
- Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. VEGF is major stimulator in model of choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (10), 3158-3164 (2000).
- Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization. Journal of Visualized Experiments. (106), e53502 (2015).
- Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (57), e3814 (2011).
- Makinde, H. M., et al. A Novel Microglia-Specific Transcriptional Signature Correlates with Behavioral Deficits in Neuropsychiatric Lupus. Frontiers in Immunology. 11, 338-419 (2020).
- Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
- Liyanage, S. E., et al. Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models. Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry. Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).
