从多个中枢神经系统区域解剖和分离小鼠神经胶质细胞

注意：所有动物研究均由克利夫兰诊所勒纳研究所机构动物护理和使用委员会授权和批准。 1. 准备解剖用培养基和用品 注意： 表1中提供了所有缓冲液和培养基配方。该程序在无菌条件下在指定的生物安全柜的组织培养物中进行。 制备无菌过滤混合胶质培养基（MGM）。这可以在前一天完成并储存在4°C。 用无菌H2O以1：100浓度稀释纤连蛋白。稀释纤连蛋白的体积将取决于用于实验的幼崽数量和CNS区域。将一个 T25 烧瓶用于 1 个皮质，一个 T25 烧瓶用于 2-4 个小脑，一个 T25 烧瓶用于 2-4 个脑干，一个 T25 烧瓶用于 2-4 条脊髓。注意：使用上面列出的标准合并来自同一区域的组织将允许充分的解离，而不会改变下面描述的方案。组合比步骤1.2中描述的更多的组织将需要进一步优化解离试剂浓度。 在室温下将3mL稀释的纤连蛋白移液到T25烧瓶中，静置2分钟。 吸出纤连蛋白，让烧瓶干燥过夜，烧瓶盖松开。 2.皮质、小脑、脑干和脊髓夹层 注意：此过程可以在台式上完成，并且需要解剖镜。在手术的所有步骤中使用严格的无菌技术，并尽量减少组织暴露于室内空气。在解剖过程中，将所有培养基放在冰上冷却，以确保最大程度的组织保存。或者，该程序可以在允许使用内部解剖镜的罩中完成。 用70%乙醇擦拭所有区域。 将 10 mL PBS/抗生素溶液 （PAS） 移液到 10 cm 培养皿中。为每只要解剖的幼崽准备一个培养皿。放在冰上以保持溶液冷却。 在消毒的组织培养罩中，将 9 mL DMEM（不含添加剂）移液到 4 个独立的 15 mL 锥形管中，每个 CNS 区域一个，更换管盖，然后放在冰上。将装有管子的冰桶放置在距解剖镜一定距离的地方。 将步骤2.2中制备的10cm培养皿置于消毒解剖镜台上。 根据机构协议麻醉和安乐死小鼠幼崽，并通过用锋利的剪刀快速斩首去除头部。注意：出生后日（P）使用3-5只幼崽。年龄较大的幼崽具有更发达的中枢神经系统，可能不是扩张神经胶质细胞的充分来源。年轻的幼崽（P）0-2可能会产生更多的胶质细胞，可以使用;然而，由于大小的原因，脊髓组织在这个年轻时很难解剖。 使用 70% 乙醇清洁幼犬的皮肤。 使用细剪刀，沿着动物头部的中线切割皮肤层，从尾部开始并移动嘴部，直到到达鼻子。避免深入颅骨，以避免任何组织损伤。 将头部向下倾斜，将皮肤层拉到颅骨的每一侧，然后用弹簧剪刀，沿着颅骨中线切开一个切口，从大孔开始，再次从尾部切到尾部。 用细尖镊子将头骨向左右两侧拉动，露出皮质、小脑和脑干。 暴露后，轻轻地将大脑从颅骨中取出，放入步骤2.2中制备的10厘米培养皿中。确保大脑保持完好无损，以保持解剖结构，并附着后脑。 使用细的弯曲镊子，镊子的尖端朝上，捏住小脑。取出脑膜，放入冰桶中指定的 15 mL 锥形管中。 确保脑干直接位于小脑腹侧，并且在切除小脑后可见。用细尖镊子将其取出，去除脑膜，然后放入冰桶中指定的 15 mL 锥形管中。 将中脑与皮质分离，去除皮质脑膜，并放入冰桶中的指定 15 mL 锥形管中。 要去除脊髓，将被斩首的小鼠幼崽置于仰卧位（面朝上躺着），切断的椎柱朝向研究者。 再次用70%乙醇喷洒。 沿着椎体的外侧，沿喙部到尾部方向，穿过肋骨，直到到达后肢。切割时，向后推内脏，直到椎柱可见。 沿着椎柱的每个侧侧切，直到将其隔离并放置在步骤2.2中制备的10厘米培养皿中。 腹侧朝上，使用细弹簧剪刀，交替切割每个椎骨的左右两侧，直到到达腰部区域以暴露脊髓组织。 在解剖显微镜下用细尖镊子轻轻取出脊髓和脑膜。放入冰桶中指定的 15 mL 锥形管中。 对每只幼崽重复步骤2.5.-2.19，结合来自同一区域的组织，以符合步骤1.2中概述的每个T25烧瓶的标准。注意：尽可能完全去除脑膜。如果残留大量脑膜，脑膜细胞的成纤维细胞样表型将脱落并压倒细胞培养物。可以组合具有相同表型的多个脊髓以产生特定的细胞培养物。注意确保不会发生细胞过度拥挤，这可能导致神经胶质细胞凋亡和差异表型。 3. 组织解离 注意：以下所有程序均使用无菌技术和无菌材料在无菌组织培养指定的生物安全柜中进行。 向每 15 mL 9 mL DMEM 锥形管和组织中加入 1 mL 含有 0.53 mM EDTA 的 0.05% 胰蛋白酶，开始组织裂解。注意：DMEM含有大量的氯化钙，可以作为胰蛋白酶的抑制剂。如果按照概述的步骤没有完成解离，可以使用不含钙或镁的汉克斯平衡盐溶液。胰蛋白酶消化后，可以通过添加胰蛋白酶抑制剂来中和酶，尽管钙应加回溶液中，因为它是DNase I的辅助因子，用于后续步骤。 用 10 mL 移液器研磨约 20 倍。 将细胞悬液转移到空的 50 mL 锥形管中。 将溶液在37°C，5%CO2 下孵育15分钟，8分钟后轻轻搅拌裂解物。 向每个试管中加入 5 mL MGM 和 200 μL （5 mg/mL） 脱氧核糖核酸酶 I，最终浓度为 50 μg/mL。 用 10 mL 移液管 10x 研磨每个裂解物。 让细胞悬液在室温下静置3分钟，以使未解离的组织沉淀在管的底部。 将细胞悬液转移到新的 50 mL 锥形管中，留下未解离的组织。注意：上述裂解和研磨步骤显着限制了非解离组织的量。 在没有制动的情况下在4°C下以300× g 离心管3分钟。 吸出上清液并将剩余的细胞沉淀重悬于 5 mL MGM 中。 用 5 mL 移液管 20x 研磨沉淀。 将 5 mL 细胞悬液铺在包被的 T25 烧瓶上。 将细胞在37°C，5%CO2 下孵育，并在24小时后最初更换培养基以除去细胞碎片。注意：某些协议建议在72小时后进行初始培养基更换。可能需要优化此步骤。 每48-72小时用MGM进行100%的培养基更换，直到细胞80%汇合（约5-7天）。注意：在更换介质之前，所有介质必须加热至37°C。 4. 小胶质细胞分离 一旦混合的胶质培养物达到80%汇合度，通过拧紧盖子并用石蜡膜密封来准备用于摇动的烧瓶。 为了从混合胶质培养物中去除小胶质细胞，将烧瓶水平固定在37°C培养箱内的轨道振荡器上。以15× g 摇动烧瓶1小时。 取出培养基并将移液器移入 15 mL 锥形管中。用 3 mL 温热的 MGM 冲洗烧瓶两次，向 15 mL 锥形管中加入洗涤液。这些是小胶质细胞。 向培养瓶中加入 5 mL 温热、新鲜的 MGM。 用石蜡膜重新密封烧瓶，将烧瓶水平固定在摇床上，并在37°C下以15× g 摇动15小时，以从星形胶质细胞中分离OPC。注意：此步骤可以在夜间完成，但15小时摇动时间至关重要，因为过多的时间可能导致细胞死亡。 离心步骤4.3中的上清液。在300× g 下3分钟，并根据标准方案16 培养小胶质细胞或用于生物测定。 5. 少突胶质细胞前体细胞分离 注意：在初始分离后电镀OPC时，必须将它们镀在聚-D-赖氨酸涂层表面（无菌板或盖玻片）上。在完成本节之前准备这些材料。 摇动15小时后，从烧瓶中取出上清液，并放在无菌100mm培养皿上。 将上清液在37°C，5%CO2 下孵育30分钟，15分钟后旋转以除去剩余的小胶质细胞，因为这些小胶质细胞会很快粘附在培养皿上。非组织培养处理的培养皿可用于此步骤。 去除非贴壁细胞上清液，计数，并在聚-D-赖氨酸包被的表面上进行平板。通常，7，500-10，000 OPC 镀/cm2。 在37°C，5%CO2 下孵育至少1小时（最多6小时），然后轻轻吸出95%的培养基，并缓慢加入温热的OPC培养基，将培养基移液到孔壁上以最大程度地减少OPC的破坏。每48小时更换一次培养基，直到细胞准备好使用。注意：一次只更换一个孔至关重要。OPCs很敏感，对干燥条件尤其不耐受。在OPC培养基中添加PDGF-AA可以延迟OPC成熟为少突胶质细胞。如果实验重点是成熟的少突胶质细胞，则可以从培养基中排除该因子。 6.星形胶质细胞分离 摇匀15小时后，除去上清液，用温热的1x PBS冲洗烧瓶2次。 加入4mL含有0.53mM EDTA的0.05%胰蛋白酶，并在37°C，5%CO2 下孵育5分钟或直到细胞升高。为了确保星形胶质细胞已经抬起，请使用标准的宽视场显微镜观察它们。胰蛋白酶消化后星形胶质细胞将呈现球形。 星形胶质细胞分离后，垂直放置烧瓶并加入 4 mL MGM。研磨混合。 将星形胶质细胞移液到15mL锥形管中，以300× g 离心5分钟。 如步骤1.2所述，将星形胶质细胞重悬于星形胶质细胞培养基中，并在纤连蛋白包被的表面上进行平板。或用于生物测定。注意：在第一次更换培养基期间可以添加20ng / mL鼠成纤维细胞生长因子，以帮助建立星形胶质细胞培养物。此外，标准明胶包衣可能是纤连蛋白的低成本替代品。 7. 使用免疫细胞化学鉴定和分离小胶质细胞、OPC、星形胶质细胞和成熟少突胶质细胞 一旦铺板细胞达到适当的汇合度，轻轻去除培养基并使用4%多聚甲醛（PFA）固定贴壁细胞10分钟。在生物安全柜中执行此步骤。注意：吸液或添加溶液时，请轻轻按压移液以防止细胞脱落。 缓慢吸出PFA，然后用1x PBS洗涤细胞3次5分钟。 在 1x PBS 中使用 10% 血清和 0.1% Triton X-100 制备适当的封闭溶液。注意：血清来源反映了产生二抗的宿主动物。例如，如果二抗是山羊抗兔，则适当的封闭血清是正常的山羊血清。同样，如果二抗是驴抗兔，阻断血清应该是正常的驴血清。 加入封闭溶液，直到细胞完全覆盖。在室温下块1小时。 制备抗体稀释剂溶液（9 mL 1x PBS、0.01 g 牛血清白蛋白、30 μL Triton X-100）。或者，抗体可以在步骤6.3中描述的封闭溶液中稀释。 在抗体稀释剂或封闭溶液中稀释针对以下物质的特异性一抗：小胶质细胞：离子钙结合衔接分子 1 （Iba1），稀释度为 1：250 （2.4 μg/mL）。 OPC：神经/神经胶质抗原 2 （NG2），稀释度为 1：200 （5 μg/mL）。 成熟少突胶质细胞：1：400稀释度的髓鞘碱性蛋白（MBP）（浓度取决于批次，可能需要优化）。 星形胶质细胞：1：400稀释度（0.25μg/mL）的神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）17。注意：不要混合在同一物种中产生的一抗。注意：GFAP将可靠地标记白质星形胶质细胞。对于灰质星形胶质细胞，可能需要使用替代标志物。 将一抗在4°C孵育过夜（最好轻轻搅拌）。 用1x PBS洗涤3次5分钟以去除一抗。 将细胞与适当的二抗以1：400稀释度在避光的抗体稀释剂或封闭溶液中孵育。注意：二抗与荧光团偶联，荧光团可根据可用的显微镜参数互换。一旦应用了荧光二抗，请尽可能避光。 在室温下孵育二抗1小时，限制暴露在光线下。 用1x PBS洗涤3次5分钟以去除多余的二抗。 要标记细胞核，请使用 1：1，000 DAPI/PBS 溶液并在室温下在黑暗中孵育细胞 5 分钟。 用 1x PBS 在黑暗中清洗 3 次 5 分钟。 要安装，请涂抹封片剂，并在成像前在黑暗中干燥。注意：安装的载玻片可以在室温下储存 2-3 天。对于长期储存，将载玻片移至4°C。 一周内的图像以获得最大信号。所有代表性图像均已在共聚焦显微镜上成像;但是，也建议使用倒置荧光显微镜。