Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Albert  B. Arul; Ren&#227; A.S. Robinson

doi:10.3791/61342

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Quimica

Multiplexación automática de muestras mediante el etiquetado isotópico de precursor combinado y el etiquetado isobárico (cPILOT)

Published: December 18, 2020

doi:

10.3791/61342

Albert B. Arul¹, Renã A.S. Robinson^1,2,3,4

¹Department of Chemistry,Vanderbilt University, ²Vanderbilt Memory & Alzheimer’s Center,Vanderbilt University Medical Center, ³Vanderbilt Brain Institute,Vanderbilt University Medical Center, ⁴Vanderbilt Institute of Chemical Biology,Vanderbilt University Medical Center

Summary

El etiquetado isotópico de precursor combinado y el etiquetado isobárico (cPILOT) es una estrategia mejorada de multiplexación de muestras que es capaz de aumentar el número de muestras que se pueden analizar simultáneamente con las etiquetas isobáricas disponibles. La incorporación de una plataforma robótica ha aumentado considerablemente el rendimiento experimental, la reproducibilidad y la precisión cuantitativa.

Abstract

Hemos introducido un flujo de trabajo proteómico cuantitativo de alto rendimiento, etiquetado isotópico precursor combinado y etiquetado isobárico (cPILOT) capaz de multiplexar hasta 22 o 24 muestras con etiquetas de masa en tándem o etiquetas isobáricas isobáricas de leucina N,N-dimetil, respectivamente, en un solo experimento. Esta multiplexación de muestras mejorada reduce considerablemente los tiempos de adquisición de espectrometría de masas y aumenta la utilidad de los costosos reactivos isobáricos comerciales. Sin embargo, el proceso manual de los pasos de manipulación y pipeteo de muestras en la estrategia puede ser intensivo en mano de obra, consumir mucho tiempo e introducir la pérdida de muestra y el error cuantitativo. Estas limitaciones se pueden superar mediante la incorporación de la automatización. Aquí transferimos el protocolo cPILOT manual a un dispositivo automatizado de manipulación de líquidos que puede preparar grandes números de muestra (es decir, 96 muestras) en paralelo. En general, la automatización aumenta la viabilidad y reproducibilidad de cPILOT y permite un uso amplio por parte de otros investigadores con dispositivos de automatización comparables.

Introduction

La proteómica basada en espectrometría de masas (MS) es una herramienta de investigación indispensable para identificar biomarcadores específicos de la enfermedad, comprender la progresión de la enfermedad y crear líderes para el desarrollo terapéutico. Esto se puede lograr a partir de una gama de muestras clínicas relacionadas con la enfermedad, como suero sanguíneo/plasma, fluidos proximales y tejidos^1,². El descubrimiento y validación de biomarcadores proteómicos recientemente han ganado una consideración significativa debido al poder de las estrategias de multiplexación de muestras^3,⁴. La multiplexación de muestras es una técnica que permite la comparación y cuantificación simultáneas de dos o más condiciones de muestra dentro de una sola inyección de MS^5,⁶. La multiplexación de muestras se logra mediante la codificación de códigos de barras o proteínas a partir de múltiples muestras con etiquetas químicas, enzimáticas o metabólicas y la obtención de información sobre la E.M. de todas las muestras en un solo experimento de MS o MS/MS. Entre las etiquetas isobáricas disponibles se encuentran reactivos de etiquetado isobárico (iTRAQ), etiquetas de masa en tándem comercial (TMT) y reactivos isobáricos N,N-dimetil leucina (DiLeu) sintetizados con capacidades de hasta 16-plex⁷ y 21-plex^8,respectivamente.

El etiquetado isotópico de precursor combinado y el etiquetado isobárico (cPILOT) es una tecnología de multiplexación de muestra mejorada. cPILOT combina el etiquetado isotópico del péptido N-termini con la luz [-(CH₃)₂] y los hiótopos pesados [-(¹³C²H₃)₂] a pH bajo (∼2.5), lo que mantiene el residuo de lisina disponible para el posterior etiquetado isobárico de pH alto (8.5) utilizando TMT, Etiquetado DiLeu, o iTRAQ³^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴. El esquema de etiquetado dual de la estrategia cPILOT se describe en la Figura Suplementaria 1 con dos muestras utilizando un péptido de ejemplo. La precisión y la precisión de la cuantificación basada en TMT a nivel MS² pueden verse comprometidas debido a la presencia de iones coaislados y co-fragmentados contaminantes llamados efecto de interferencia¹⁵. Esta limitación en las relaciones iónicas de reporteros inexactas se puede superar con la ayuda de espectrómetros de masas Orbitrap tribridos. Por ejemplo, el efecto de interferencia se puede superar aislando un pico en un par dimetilado en el nivel de MS¹ en el espectrómetro de masas, sometiendo la luz o el pico pesado a la fragmentación de MS² en la trampa de iones lineales y luego sometiendo el fragmento de MS² más intenso para HCD-MS³ para obtener información cuantitativa. Con el fin de aumentar las posibilidades de seleccionar los péptidos sin aminas de lisina disponibles para la generación de iones de reportero, también se puede utilizar una adquisición selectiva de MS³ basada en el fragmento y-1 y es un enfoque que puede dar lugar a un mayor porcentaje de péptidos cuantificables con cPILOT⁹. La combinación de etiquetado ligero y pesado aumenta las capacidades de multiplexación de muestras en un factor de 2x a la lograda con etiquetas isobáricas individuales. Recientemente hemos utilizado cPILOT para combinar hasta 24 muestras en un solo experimento con reactivos DiLeu¹⁶. Además cPILOT se ha utilizado para estudiar las modificaciones oxidativas post-traduccionales¹⁴ incluyendo la nitración de proteínas¹⁷, otros proteomas globales⁹, y ha demostrado aplicaciones a través de múltiples muestras de tejido en un ratón de la enfermedad de Alzheimer modelo¹¹.

La preparación robusta de muestras es un paso crítico en un experimento cPILOT y puede ser lenta, laboriosa y extensa. La multiplexación de muestras mejorada requiere pipeteo extenso y personal de laboratorio altamente calificado, y hay varios factores que pueden influir en gran medida en la reproducibilidad del experimento. Por ejemplo, es necesario un manejo cuidadoso de las muestras para garantizar tiempos de reacción similares para todas las muestras y para mantener el pH tampón adecuado para muestras de dimetilado ligeros y pesados. Además, la preparación manual de decenas a cientos de muestras puede introducir un alto error experimental. Por lo tanto, para reducir la variabilidad de la preparación de muestras, mejorar la precisión cuantitativa y aumentar el rendimiento experimental, desarrollamos un flujo de trabajo automatizado de cPILOT. La automatización se logra mediante un dispositivo robótico de manipulación de líquidos que puede completar muchos aspectos del flujo de trabajo (Figura 1). La preparación de muestras desde la cuantificación de proteínas hasta el etiquetado de péptidos se realizó en un manipulador de líquidos automatizado. El manipulador de líquido automatizado está integrado con un aparato de presión positiva (PPA) para intercambios de búferes entre las placas de extracción de fase sólida (SPE), el agitador orbital y un dispositivo de calefacción/refrigeración. La plataforma robótica contiene 28 ubicaciones de cubierta para acomodar placas y tampones. Hay dos vainas con una pinza para transferir las placas dentro de las ubicaciones de la cubierta: un cabezal de pipeteo de volumen fijo de 96 canales (5-1100 l) y sondas de volumen variable de 8 canales (1-1000 l). La plataforma robótica se controla mediante un software. El usuario debe ser entrenado profesionalmente antes de usar el manipulador de líquidos robótico. El presente estudio se centra en la automatización del flujo de trabajo manual de cPILOT, que puede ser intensivo en mano de obra para procesar más de 12 muestras en un solo lote. Con el fin de aumentar el rendimiento del enfoque¹¹de cPILOT, transferimos el protocolo cPILOT a un manipulador de líquidos robótico para procesar más de 10 muestras en paralelo. La automatización también permite reacciones similares para cada muestra en paralelo durante varios pasos del proceso de preparación de la muestra, lo que requería que los usuarios altamente capacitados lo lograran durante el cPILOT manual. Este protocolo se centra en la implementación del dispositivo automatizado de manipulación de líquidos para llevar a cabo cPILOT. El presente estudio describe el protocolo para el uso de este sistema automatizado y demuestra su rendimiento utilizando un análisis de 22 plex “prueba de concepto” de homogeneizatos hepáticos de ratón.

Protocol

Todos los protocolos de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pittsburgh. Un ratón de control masculino (C57/BLJ) fue comprado comercialmente y alojado en la División de Recursos Animales de Laboratorio de la Universidad de Pittsburgh. Los ratones fueron alimentados con chow ad libitum de laboratorio de roedores estándar y se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. El tejido hepático se extrascó y almacenó a 80 oC. 1. Extracción de proteínas NOTA: Estos pasos se realizan manualmente. Lavar el hígado de ratón (100 mg) con solución salina y homogeneizar con 500 l de 8 M de urea utilizando un homogeneizador mecánico utilizando perlas de matriz de lesing A para 4 m/s durante 20 s.NOTA: En este estudio, no se añadieron inhibidores de la proteasa o fosfatasa, pero se pueden añadir al tampón si es necesario, en función del experimento. Además, los pasos de extracción de proteínas se pueden ajustar en consecuencia para varios tipos de muestras. Transfiera el homogeneizado del tejido a un nuevo tubo de microcentrífuga, enjuague y combine los tubos de lancha con 100-500 l de PBS con 8 M de urea. Centrifugar los tejidos homogeneizados (12.800 x g,4 oC y 15 min) y recoger el sobrenadante.NOTA: El resto de los pasos se llevan a cabo en el manipulador de líquidos robótico disponible en el laboratorio del usuario. El manipulador de líquidos debe ser capaz de aspirar y dispensar tampones desde y hacia los tipos de placas especificadas por ANCI, con una participación mínima del operador. Determinar la concentración de proteínas utilizando un ensayo de ácido bicinchoninic (BCA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Encienda el PPA, el dispositivo de calefacción/refrigeración, y las bombas de vacío y conecte todos los accesorios con el manipulador de líquidos. El manipulador de líquidos muestra una luz azul una vez que está conectado al ordenador y listo para funcionar. Para reagente la placa 1 (placa de 96 pocillos), añada 30 l de 25 mM 1,4-ditiothreitol (TDT), 25 mM 30 ml de cisteína y 25 mM 30 ml de iodoacetamida (IAA) a las filas 1, 2 y 3, respectivamente. Añadir 8 M de urea y 20 mM Tris con 10 mM CaCl2 (pH 8.2) a una placa de depósito. Añadir 500 l de ácido fórmico del 5% a una placa de pozo de 2 ml de profundidad, 20 ml de trippsina a la fila 1 de la placa de trippsina y colocar en la ubicación de la cubierta según lo especificado por el método.NOTA: IAA y trypsin se añadieron a la placa de 96 pozos antes de añadir a la muestra. Aliquot 300 l del hígado homogeneiza en un tubo de 500 l y colóquelo en una placa de pozo de 2 ml de profundidad y colóquelo a 4 oC hasta el inicio del protocolo. Para este experimento, se generaron 22 alícuotas a partir del homogeneato de hígado único.NOTA: Añadir un estándar de control de calidad interno (p. ej., caseína alfa bovina u otra proteína exógena) con la relación estándar de 1 g: muestra de proteína de 100 g. Defina el volumen de búferes que se agregarán a las muestras por nombres de variables y valor según la Tabla 1. Basándose en el BCA, introduzca el volumen de la muestra y el búfer de normalización (8 M urea) en una hoja de cálculo y adjunte al software (Tabla 2).NOTA: Puede ser necesaria una mayor dilución con tampón si la concentración de proteínas es demasiado alta. Las concentraciones resultantes para la muestra del tejido hepático fueron de 10 g/l. El volumen de tampones se ha optimizado para una proteína de 100 g. Retire los tubos de muestra de 4 oC, colóquelos en la ubicación de la cubierta especificada del manipulador de líquido automatizado y deje que se calienten durante 10 minutos. Abra el método y siga las instrucciones para colocar las puntas requeridas (1070, 90 y 230 l) y el material de laboratorio en las posiciones deseadas. Una vez que todos los utensilios de laboratorio y las puntas están en su lugar, coteja con el diseño final de la cubierta y haga clic en Siguiente para continuar con el protocolo.NOTA: La configuración guiada informa al usuario para que añada un volumen necesario de búfer al material de laboratorio específico en función del protocolo y la ubicación de la cubierta que se va a conservar. 2. Reducción de la muestra, alquilación y digestión Cargue 230 puntas y aspire 90 l de urea de 8 M desde el depósito y dispense hasta la fila 1 de la placa negra de pozo de 2 ml de profundidad. Descarga las propinas. Repita este paso hasta que se añadan 8 M de urea a todos los pozos correspondientes a las 22 muestras.NOTA: El tampón de desnaturalización desenrolla la estructura tridimensional de la proteína para producir la estructura primaria para que la trippsina pueda actuar y romper la proteína con eficacia. La pipeta de 8 canales puede aspirar diferentes volúmenes para los 8 canales y puede dispensar a diferentes ubicaciones en el material de laboratorio. En este paso todos los canales aspiraron el mismo volumen que se define en el software. Después de añadir el tampón de desnaturalización, cargue las puntas de 90 l y aspire 10 ml (corresponde a 100 g) de homogeneización del hígado de ratón utilizando la pipeta de 8 canales a la placa negra de 2 ml de profundidad. Descarga las propinas. Repita este paso hasta que se transfieran todas las 22 muestras. Después de cada transferencia, realice un paso de mezcla para aspirar y dispensar 50 l del contenido del pozo tres veces para asegurar la mezcla de la proteína con el tampón para exhibir una proporción de 1:1.NOTA: Retire la muestra de homogeneizar el material y colóquela en -80 oC. Para reducir las proteínas desnaturalizadas, cargue una fila de puntas de 90 l y aspire 3 l de TDT de la placa de reactivo 1. Dispensar la TDT a las filas 1 y 2 de la placa negra de 2 ml de profundidad del pozo y descargar las puntas.NOTA: La proteína: La relación molar de TDT se mantiene en 1:40 para la reducción de los enlaces de disulfuro. El cálculo de la relación molar se basa en la masa proteica de la albúmina sérica bovina (BSA), que es de 66,5 x 103 g/mol. Sellar la placa de muestra con papel de aluminio e incubar a 37oC durante 600 s a 300 rpm. Añada 30 l de IAM de 0,25 M a la fila 3 de la placa de reactivo 1 justo antes de su uso y colóquela en la cubierta. Desapreomecer la placa de muestra y vuelva a la cubierta.NOTA: IAM es sensible a la luz. Cargue una fila de puntas de 90 l, aspire 6 l de IAM de la placa de reactivo 1 en la fila 3 y dispense hasta la fila 1 de la placa de muestra. Descarga las propinas.NOTA: La relación molar de proteína: IAM se mantiene en 1:80 para cada muestra. Esta reacción debe hacerse en la oscuridad. Selle la placa de muestra e incubar a 4oC durante 30 min a 300 rpm en el dispositivo de calefacción/refrigeración.NOTA: El sellado de la placa se realiza para evitar que la muestra se encienda, se evapore y se derrame del pozo. Desaprestece la placa de muestra y cargue una hilera de puntas de 90 l y aspire 5 ml de cisteína de la placa de reactivo 1 en la fila 2. Dispensar en las filas 1 y 2 de la placa de muestra y descargar las puntas. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min.NOTA: La proteína: La relación molar de L-cisteína se mantiene en 1:40. Coloque la placa de muestra en el agitador orbital para realizar un movimiento cronometrado de 1800 rpm durante 30 min. Añadir 800 l de tampón Tris de 20 mM con 10 mM de CaCl2 (pH 8.2) a cada pocómo de la placa de muestra para diluir la concentración de urea a 2 m. Descargue las puntas.NOTA: La actividad de la trippsina se ve obstaculizada a concentraciones más altas de urea y, por lo tanto, debe reducirse a menos de 2 M. Este estudio se realizó con una relación proteína a trypsin molar de 50: 1 para 14 h. Agregue 20 l de tripsina a la fila 1, columna 1-12 de una placa de 96 pozos y colóquela en una ubicación especificada en la cubierta. Cargue una fila de puntas de 90 l, aspire 2 l de tripsina de la fila 1 de la placa de trippsina y dispense en las filas 1 y 2 de la placa de muestra. Descarga las propinas. Selle la placa e incubar durante 14 h a 37 oC a 600 rpm en el dispositivo de calefacción/refrigeración. Después de la incubación, despreocir la placa de muestra y añadir 5% de ácido fórmico a la fila 3, columna 1- 12 de una placa de recogida de pozos profundos y colocarlo en la cubierta especificada. Detenga la digestión añadiendo 150 l de ácido fórmico del 5% de la fila 3 de la placa de ácido fórmico y dispensar a la placa de muestra en las filas 1 y 2. Descarga las propinas. 3. Paso de desaldación 1 Desalgar los péptidos con placa SPE que contienen 20 mg de material Targa C-18. Fije el volumen para cada intercambio de búferes como 600 l y fije la presión a 100 mbar. Cargue 1070 puntas de L y aspire 600 l de acetonitrilo y dispense en las filas 1 y 2 de la placa SPE. Coloque la placa SPE sobre PPA y aplique presión. Usando las mismas puntas, aspirar 600 l de acetonitrilo y dispensar a las filas 1 y 2 de la placa SPE. Coloque la placa SPE sobre PPA y aplique presión.NOTA: El flujo a través se puede drenar para desperdiciar utilizando una bomba de aspiración. Cargue 1070 puntas y aspire 600 l de Tampón A (100 % agua en 0,1 % ácido fórmico) y dispense en las filas 1 y 2 de la placa SPE. Coloque la placa SPE sobre PPA y aplique presión.NOTA: Si el volumen del búfer no se reduce significativamente, intente aumentar la presión o el tiempo. Cargue 2 hileras de puntas de 1070 l, aspire 534 l de muestras digeridas y dispense en las filas 1 y 2 de la placa SPE. Coloque la placa SPE sobre PPA y aplique presión. Repita este paso hasta que se carguen todas las muestras.NOTA: Dado que el volumen total después de añadir ácido fórmico será de 1068 l y las muestras se agregaron en dos pasadas. Cargue 2 filas de puntas usadas de 1070 l, aspire 600 l de Tampón A y dispense en las filas 1 y 2 de la placa SPE. Coloque la placa SPE sobre PPA y aplique presión. Repita el paso anterior una vez para limpiar la muestra. Cargue 1 hilera de puntas de 1070 l, aspire 600 l de ACN: Agua (60:40) y dispensar a las filas 1 y 2 de la placa SPE. Coloque la placa SPE encima de una placa de recogida para eluir los péptidos usando PPA y aplique presión. Repita el paso anterior para eluir los péptidos de la placa de recogida. Secar la placa de recogida hasta la sequedad y conservar a -80oC hasta su posterior procesamiento. 4. Etiquetado de dimetilación (péptido N-termini) Coloque las puntas requeridas (1070, 90 y 230 l) y el material de laboratorio en las posiciones deseadas en el software. Una vez que todos los utensilios de laboratorio y las puntas están en su lugar, coteja con el diseño final de la cubierta y haga clic en Siguiente para continuar con el protocolo. Para el reactivo 2, añadir 450 l de ácido acético al 1%, 50 l de formaldehído ligero (CH2O), 50 ml de formaldehído pesado(13CD2O) y 150 ml de ácido fórmico a las filas 1, 2, 3 y 4 respectivamente. Para el reactivo 3 añadir 50 l de CB ligero, 50 l de CB pesado, a las filas 1 y 2 y 50 l de amoníaco a la fila 3 y 4. Cargue 2 hileras de puntas de 230 l y aspire 100 l de ácido acético al 1% de la fila 1 de la placa de reactivo 2 y dispensar a los péptidos secos en la placa de muestra 2 (placa de recogida del paso de desalado) filas 1 y 2 y realizar un temblor cronométrico durante 5 minutos a 1800 rpm. Cargue 90 puntas y aspire 16 l de 60 mM (4%) CH2O (37% wt/v) de la fila 2 de la placa de reactivo 2 y dispensar hasta la fila 1 de la placa de muestra. Descarga las propinas. Cargue 1 hilera de puntas de 90 l y aspire 16 l de 60 mM (4%) 13 CD2O (20% wt/v) de la fila 3 de la placa de reactivo 2 y dispensar hasta la fila 2 de la placa de muestra. Descarga las propinas.NOTA: En este estudio, la fila 1 corresponde a la luz y la fila 2 corresponde a muestras dimetiladas pesadas (véase la figura 1). Cargue 2 hileras de puntas de 90 l y aspire 16 l de 24 mM NaBH3CN y 24 mM NaBD3CN de la fila 1 y 2 de la placa de reactivo 3 y dispense en las filas 1 y 2, respectivamente, de la muestra de la placa. Descargue las puntas y realice un batido cronometreado durante 15 minutos a 1800 rpm utilizando el agitador orbital.NOTA: La adición de cianoborohidruro de sodio inicia la reacción para reducir la variabilidad entre los experimentos, este paso se realiza una vez por lote. Cargue 2 hileras de puntas de 90 l y aspire 32 l de amoníaco al 1% (28-30% v/v) de las filas 3 y 4 de la placa de reactivo 3 y dispense a las filas 1 y 2 respectivamente de la placa de muestra 2. Descarga las propinas.NOTA: La adición de amoníaco detiene la reacción para reducir la variabilidad entre los experimentos, este paso se realiza una vez por lote. Combine volúmenes iguales de péptidos dimetilados ligeros y pesados (1:1) a una nueva placa de pozo de 2 ml de profundidad para desalar.NOTA: En este estudio se combinaron 90 l del contenido del pozo de la fila 1 con 90 s de la fila 2 de la placa de muestra 2 a una nueva placa de recogida de 2 ml (placa de muestra 3). La relación de luz: mezcla pesada depende del protocolo experimental, en este estudio se utilizó una relación 1:1. Cargue 2 hileras de puntas de 230 l y aspire 32 l de ácido fórmico del 5% a las muestras combinadas y realice un temblor cronolacionado durante 30 s a 1800 rpm.NOTA: La eficiencia de la dimetilación depende del pH de la mezcla de reacción y cualquier cambio en el pH tampón dará lugar a un etiquetado incompleto del péptido N-termini. La eficiencia de la dimetilización debe ser superior al 97% cuando se busca como modificación dinámica en el péptido N-termini. En este estudio, la eficiencia de etiquetado de los péptidos ligeros y pesados fue del 99,7% y del 99,5%, respectivamente. 5. Paso de desalar 2 Realice la desa salción de muestras similares al paso 1 de desalto para las muestras combinadas. Seque las muestras en la placa de muestra utilizando una aspiradora de velocidad y guárdelas a -80 oC hasta su posterior procesamiento. 6. Etiquetado isobárico (residuos de Lys) Siga la configuración guiada del material de laboratorio y coloque los consejos necesarios (1070, 90 y 230 l), con los búferes adecuados. Una vez que todos los utensilios de laboratorio y las puntas están en su lugar, coteja con el diseño final de la cubierta y haga clic en Siguiente para continuar con el protocolo. Añadir 250 l de bicarbonato de amonio trietilo de 100 mM (TEAB), 30 l de hidroxilomina (10% p/v) a las filas 1 y 2 de la placa de reactivo 4. Coloque los tubos TMT en la placa de 2 ml de pozo profundo según la hoja de cálculo en la Tabla 3. Mantenga un tubo vacío de 1,5 ml en un soporte de estante de tubo para agrupar los péptidos etiquetados. Coloque la placa de muestra seca en la placa de procesamiento P9 y TMT en P14. Para reconstituir los péptidos, cargue 230 l de puntas y aspire 100 l de tampón de bicarbonato de amonio trietilo (TEAB) de 100 mM (pH)8,5) desde la fila 1 en la placa TEAB y dispense hasta los péptidos secos en la fila 3 de la muestra 3. Coloque la placa en el agitador orbital durante 30 s a 1800 rpm.NOTA: Reconstituir 100 g de péptidos dimetilados a una concentración de 1 g/L. Cargue 90 puntas de L y aspire 10 ml de acetonitrilo anhidro a partir de H12 de la placa TMT y prescinda en cada uno de los tubos TMT secos. Retire los tubos TMT, el vórtice y gire rápidamente los tubos y vuelva a la cubierta en una placa de pozo profundo. Cargue 1 hilera de puntas de 90 l y aspire 12,5 ml de los péptidos dimetilados combinados y dispense a la fila 1 de la placa de procesamiento TMT. Descarga las propinas.NOTA: La relación TMT: péptido se mantuvo en 1:8 para este experimento. Cargue 1 hilera de puntas de 90 l y aspire 10 l de TMT y dispense en la fila 1 de la placa de procesamiento TMT. Descargue las puntas, realice un batido cronometrete durante 1 hora a 1800 rpm. Cargue 1 hilera de puntas de 90 l y aspire 8 ml de hidroxilamina (10% p/v) de la fila 2 en la placa TEAB y prescinda hasta la fila 1 de la placa de procesamiento TMT. Descargue las puntas, realice un temblor cronosetilado durante 15 minutos a 1800 rpm. Combine 30,5 l de los péptidos etiquetados con TMT de la placa de procesamiento TMT al tubo de 1,5 ml. Descargue las propinas después de cada transferencia. Retire el tubo con las muestras agrupadas y seque para evaporar la acetonitrilo. Reconstituir péptidos en 0,2 ml de agua en ácido fórmico al 0,1 % y volver a la cubierta.NOTA: La eficiencia de etiquetado del etiquetado isobárico también es específica del pH y la eficiencia del etiquetado debe ser superior al 98% según las instrucciones del fabricante. En este estudio, la eficiencia de etiquetado TMT de los péptidos ligeros y pesados terminados por lisina fue del 99,4% y del 99,5%, respectivamente. 7. Paso de desaldación Realice la desa venta de muestras de forma similar a la desalt 1 para una muestra. Secar las muestras y conservarlas a -80oC hasta su análisis. 8. Cromatografía líquida– Espectrometría de masas tándem (LC-MS/MS) y MS3 Reconstituir los péptidos en agua de grado MS con 0,1% de FA para obtener una concentración de 1 g/l. Filtrar muestras con tubos de microcentrífuga que contienen un filtro de 0,65 m. Centrifugar péptidos a 12.000 x g durante 3 min y coloque el flujo a través de un vial de automuestrador.NOTA: La concentración de péptidos se puede confirmar en esta etapa si se desea. Los péptidos tendrían que ser reconstituidos en agua de grado LC-MS y sujetos a un ensayo de péptido BCA. En este estudio, no se realizó el ensayo de BCA de péptido y todas las cantidades de péptidos se basaron en el ensayo inicial de proteína BCA. Prepare los buffers de fase móvil de la siguiente manera: 100% (v/v) agua con 0.1% FA (A) y 100% ACN con 0.1% FA (B). Inyectar 1 ml de muestra en una columna trampa embalada con 2 cm de material C18 (3 m, tamaño de poro de 100o).NOTA: La limpieza de la muestra en la trampa es la siguiente: 10 min, 100% A; 2 l/min utilizando un sistema de cromatografía líquida 2D. Ejecute el método de separación analítica. Utilice una columna capilar capilar de sílice fundida con puntas extraídas con puntas extraídas de 100 m i.d. x 26 cm embalada con material C18 (2,5 m, 100o). El gradiente es: 0-10 min, 10% B; 10-30 min, 10-15% B; 30-75 min, 15-30% B; 75-88 min, 30-60% B; 88-92 min, 60-90% B; 92-99 min, 90% B; 99-100 min, 90-10% B, 100-120 min, 10% B; 300 nL/min, 120 min. Ejecute la adquisición de datos para el espectrómetro de masas mientras se ejecuta el método de separación analítica. Utilice los siguientes parámetros para la exploración de la encuesta MS: 375-1,500 m/z, resolución 120.000, tiempo de ciclo 3 s (velocidad máxima), control automático de ganancia (AGC) objetivo 4.0e5, tiempo máximo de inyección 50 ms. Utilice los siguientes parámetros para CID-MS/MS con trampa iónica: escaneos de adquisición dependiente de datos (DDA) por resultado, ancho de aislamiento de 2 m/z, 35% de energía de colisión normalizada (NCE), 0,25 activación q, tiempo de activación de 10 ms, 1,0e4 AGC, tiempo máximo de inyección de 100 ms. Utilice los siguientes parámetros para HCD–MS3 SPS 10: Rango de escaneado 100-400 m/z, número de escaneos dependientes 10, AGC 5.0e4, tiempo máximo de inyección 118 ms, energía de colisión HCD 55%, ventana de aislamiento MS2. 9. Análisis de datos Buscar archivos RAW generados para la lista de proteínas y péptidos utilizando un software de análisis de proteínas contra una base de datos adecuada.NOTA: Los archivos RAW generados en este estudio se buscaron en una base de datos Uniprot del ratón. Dado que hay etiquetado ligero y pesado en un archivo RAW, busque en cada archivo con dos flujos de trabajo péptidos dimetilados ligeros y pesados. Buscar los archivos RAW contra la base de datos Uniprot del ratón (07/13/2019) con la secuencia 53035 con los siguientes parámetros: escisión de tripps de tripps de tripps con dos escotes perdidos, péptido con longitud mínima de 6 aminoácidos, tolerancia a la masa de 15 ppm padre, 1 Tolerancia a la fragmentación Da Modificaciones estáticas: dimetilación ligera (+28.031, péptido N-terminus) o dimetilación pesada (+36.076 Da, péptido N-terminus), carbamidometil (+57.021 Da, C), Modificaciones dinámicas: oxidación (+15.995 Da, M), etiqueta isobárica 11-plex (229.163 Da, K), 1% FDR, cuantificación iónica del reportero con tolerancia de integración de pico de 30 ppm, centroide más seguro para el método de integración.NOTA: El pico dimetilado pesado también incluye otra modificación que es 7 Da (+35.069 Da, péptido N-terminus) del pico dimetilado ligero y por lo tanto se debe incorporar otro nodo de búsqueda para incluir esta modificación también. No se realizó la cuantificación de iones de reportero basada en la intensidad, la coincidencia de masa SPS del 65%, la relación media S/N 10, la corrección isotópica, la normalización y la escala.NOTA: La normalización y el escalado se pueden realizar en función de la cantidad total de péptidos o de una proteína específica añadida a la muestra. Las muestras de control de calidad también se pueden incluir en los canales para la normalización entre lotes o dentro del lote basada en una escala de referencia interna de dos colas18. Las contaminaciones isotópicas de diferentes canales TMT no se proporcionaron a la búsqueda, se aconseja a los usuarios añadir la contaminación isótopo de diferentes iones de reportero.

Representative Results

La Figura 2 muestra los datos representativos de la MS de un péptido identificado en los 22 canales iónicos de reportero de un experimento cPILOT de 22 plex, incluidas las réplicas del flujo de trabajo. La Figura 2 (superior) representa un par de picos doblemente cargado separado por un espaciado de 4 Da m/z que indica un único grupo dimetil incorporado en el péptido. Los pares de picos dimetilados ligeros y pesados fueron aislados y fragmentados independientemente para producir la secuencia del péptido. La secuencia del péptido es G(dimetil)AAELMQQK(TMT-11plex) y corresponde a la proteína Betaína-homocisteína S-metiltransferasa. Los iones de fragmento más intensos para los picos dimetilados ligeros y pesados(no mostrados)se aislaron aún más para la fragmentación de la MS 3 y losiones del reportero (m/z 126-131) se muestran en la Figura 2 (abajo). Las intensidades de iones del reportero son directamente proporcionales a la abundancia de péptidos en la muestra. La abundancia de péptidos de las muestras implica que la capacidad de pipeteo de la plataforma robótica es bastante uniforme en las 22 muestras. En general, este experimento cPILOT de 22 plexos dio como resultado 1326 (1209-light/1181-heavy) identificaciones de péptidos(Tabla 4). La Figura 3 muestra la gráfica de caja de abundancia log10 frente a las intensidades totales de iones de reportero en todos los 22 canales que muestran una menor variabilidad entre pozos/entre muestras. La evaluación de la automatización total se realizó examinando el error en la abundancia de iones de reportero en cada proteína en las 22 muestras. La Figura 4 muestra que el procesamiento de muestras con la plataforma robótica dio lugar a valores de CV muy bajos. Concretamente, en los 3098 los péptidos identificaron que el CV medio en abundancia de iones de reportero era del 12,36 % y del 15,03 % para los péptidos dimetilados ligeros y pesados, respectivamente. Entre estos péptidos 2032 de estos péptidos tenía señal de iones reportero por encima del umbral mínimo y se consideraron cuantificables. Figura 1. Flujo de trabajo experimental para procesar 22 muestras en paralelo con un protocolo cPILOT automatizado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2. Cuantificación de péptidos en 22 muestras. Ejemplo de MS (arriba) y MS3 (abajo) espectros del péptido G(dimetil)AAELMQQK(TMT-11plex) cuantificados en 22-plex experimento automatizado cPILOT para picos dimetilados ligeros (abajo a la izquierda) y dimetilados pesados (abajo a la derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3. Gráfica de caja de intensidades de iones de reportero totales frente a abundancia de log10 de 22 muestras utilizando el descubridor de proteome 2.3. El archivo RAW se buscó dos veces para péptidos ligeros y pesados, los PÉPTIDOs de proteínas por separado con TMT como modificación dinámica, la luz (+28.031 Da) y la pesada (+36.076 y +35.069 Da) dimetilación en el péptido N-termini como modificación estática. Una búsqueda combinada con todas las modificaciones anteriores se ejecutó utilizando Proteome Discover 2.3 para obtener el Registro 10 Abundancia de Intensidads de péptidos en todos los canales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4. Gráficas de violín de coeficiente de variación de la abundancia de péptidos de intensidades de iones de reportero sumadas a través de canales 126-131 m/z. El péptido se cuantificó con un valor medio de CV de 12,36 y 15,03 para péptidos cuantificables ligeros (2373) y pesados (2533). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura complementaria 1. Ilustración del cPILOT con un solo péptido. Mostrando el etiquetado isotópico de dos muestras diferentes y el etiquetado isobárico con TMT126,la mezcla resultante se inyectó a MS para LC-MS3. Haga clic aquí para descargar este archivo. Nombre de la variable Valor Descripción DesaltSamp1 1065 Volumen que se utilizará para desalto paso 1 DesaltSamp2 392 Volumen que se utilizará para desalto paso 2 DesaltSamp3 100 Volumen que se utilizará para el paso 3 de desalto Devmode Falso False reducirá los tiempos de incubación a 30 segundos- True seguirá el tiempo de incubación en el protocolo. DTTVol 3 Volumen de TDT FilterPlate Targa Placa utilizada para la desaladuración FilterPlateVol 600 Volumen para desalar HAWaterWashes Falso Número de lavados de agua en la placa SPE IAMVol 2 Volumen de iodoacetamida PeptideTMTVol 12.5 Volumen de péptido para etiquetado TMT Presión 100 presión mbar en PPA TempOffSet 1 Cambio de temperatura TMTVol 10 Volumen de etiquetas isobáricas que se añadirán TrisVol 800 Volumen para diluir la muestra antes de la digestión TrypsinVol 2 Volumen de la trippsina UsePopTimer Verdad True muestra las opciones para aplicar presión sobre la placa si es necesario Tabla 1. Lista de variables utilizadas en el protocolo automatizado cPILOT. DilSource DilWell Dest DestWell DilVolume StockSource Stockwell SampleVol SampleID 8M_Urea 1 Muestras A1 90 Stock_Samples A1 10 1 8M_Urea 1 Muestras A2 90 Stock_Samples A1 10 2 8M_Urea 1 Muestras A3 90 Stock_Samples A1 10 3 8M_Urea 1 Muestras A4 90 Stock_Samples A1 10 4 8M_Urea 1 Muestras A5 90 Stock_Samples A1 10 5 8M_Urea 1 Muestras A6 90 Stock_Samples A1 10 6 8M_Urea 1 Muestras A7 90 Stock_Samples A1 10 7 8M_Urea 1 Muestras A8 90 Stock_Samples A1 10 8 8M_Urea 1 Muestras A9 90 Stock_Samples A1 10 9 8M_Urea 1 Muestras A10 90 Stock_Samples A1 10 10 8M_Urea 1 Muestras A11 90 Stock_Samples A1 10 11 8M_Urea 1 Muestras A12 90 Stock_Samples A1 10 12 8M_Urea 1 Muestras B1 90 Stock_Samples A1 10 13 8M_Urea 1 Muestras B2 90 Stock_Samples A1 10 14 8M_Urea 1 Muestras B3 90 Stock_Samples A1 10 15 8M_Urea 1 Muestras B4 90 Stock_Samples A1 10 16 8M_Urea 1 Muestras B5 90 Stock_Samples A1 10 17 8M_Urea 1 Muestras B6 90 Stock_Samples A1 10 18 8M_Urea 1 Muestras B7 90 Stock_Samples A1 10 19 8M_Urea 1 Muestras B8 90 Stock_Samples A1 10 20 8M_Urea 1 Muestras B9 90 Stock_Samples A1 10 21 8M_Urea 1 Muestras B10 90 Stock_Samples A1 10 22 8M_Urea 1 Muestras B11 90 Stock_Samples A1 10 23 8M_Urea 1 Muestras B12 90 Stock_Samples A1 10 24 Cuadro 2. Volumen de homogenerato de hígado de ratón y 8 M de urea. SourceWell SourceWell2 Reportero Ion DestWell1 DestWell2 Volumen SampleID A1 C1 126 A1 E1 10 1 A3 C3 127N A2 E2 10 2 A5 C5 127C A3 E3 10 3 A7 C7 128N A4 E4 10 4 A9 C9 128C A5 E5 10 5 A11 C11 129N A6 E6 10 6 B2 D2 129C A7 E7 10 7 B4 D4 130N A8 E8 10 8 B6 D6 130C A9 E9 10 9 B8 D8 131N A10 E10 10 10 B10 D10 131C A11 E11 10 11 Cuadro 3. Número total de péptidos, proteínas y coincidencias espectrales de péptidos (PMP). cPILOT automatizado Luz Pesado Proteínas 1209 1181 Péptidos 6137 5872 PSM 14948 16762 Cuadro 4. Barras de barras las etiquetas isobáricas con las muestras etiquetadas ligeras y pesadas.

Discussion

cPILOT es una estrategia de multiplexación mejorada que puede analizar hasta 24 muestras en un solo experimento. La capacidad de multiplexación depende del número de combinaciones de etiquetado isotópica e isobárica disponibles. La introducción del TMTpro^7,que es capaz de etiquetar 16 muestras en un solo experimento, puede empujar los límites de cPILOT a 32-plex. cPILOT consta de múltiples pasos de pipeteo y requiere un cuidado extenso y habilidades del usuario para realizar la preparación de la muestra. Incluso con un usuario experto, los errores manuales son inevitables, lo que invita al uso de plataformas robóticas para procesar muestras en la estrategia cPILOT. Dado que cPILOT utiliza el etiquetado dependiente del pH de los péptidos, el pH debe mantenerse para la luz y el conjunto pesado dimetilado de muestras. El pH levemente ácido-básico puede resultar en dimetilización de residuos de N-termini y lisina. Una ventaja de cPILOT es que requiere sólo la mitad de las etiquetas isobáricas ya que el péptido N-termini está ocupado con los grupos dimetilos. Esto permite etiquetar un mayor número de muestras a la mitad del costo. El manejo de números de muestra más grandes requiere que los tiempos de exposición de los reactivos sean similares para la primera y la última muestra de un lote. Un dispensador de pipetas que puede acomodar hasta 32 muestras en paralelo se puede lograr mejor con el uso de dispositivos robóticos de manipulación de líquidos.

Con el fin de procesar varias muestras por cPILOT, el flujo de trabajo manual se modificó para incorporar la automatización. El manipulador de líquidos robótico utilizado en este estudio tiene dos vainas con capacidades de pipeteo de 96 canales y 8 canales, con una pinza para colocar las placas en las 28 ubicaciones disponibles de la cubierta. El manipulador de líquidos está integrado con un aparato de presión positiva, agitador orbital y un dispositivo para calentar/enfriar muestras en la placa de 96 pozos. El aparato de presión positiva ayuda a realizar intercambios de búferes en las placas SPE durante la limpieza, mientras que el agitador orbital ayuda a vórtice/mezcla las muestras. La plataforma robótica fue programada para aspirar y dispensar tampones y muestras a placas de 96 pozos, incubación, muestras de vórtice y placas de transferencia. Los líquidos con diferentes viscosidades, como el acetonitrilo y el agua, requieren consideraciones específicas de pipeteo que también se pueden programar en el método.

El flujo de trabajo de cPILOT, desde la cuantificación de proteínas por BCA hasta el etiquetado de los péptidos con etiquetas isobáricas (es decir, TMT), se realizó en el sistema de manipulador de líquidos. El protocolo completo se a escala para utilizar 96 placas de pozos profundos que pueden contener 2 ml por pozo. Los buffers se prepararon antes del inicio del experimento y se agregaron a la placa de 96 pozos para permitir el procesamiento paralelo de la muestra. En el presente estudio, se añadieron 22 réplicas de flujo de trabajo de homogeneización hepática de ratón a las placas de pozos profundos y se llevaron a través del protocolo cPILOT. Finalmente, se inyectó una sola muestra compuesta por los péptidos etiquetados con ratón equimolar 22-plex etiquetados al espectrómetro de masas. Las intensidades de iones del reportero correspondientes a las abundancias de péptidos en las muestras demostraron que las muestras procesadas con el manipulador de líquidos tienen CV más bajos que el protocolo manual(datos no mostrados). La plataforma robótica también mejoró en gran medida la reproducibilidad del procesamiento de muestras. La reproducibilidad y la robustez son factores muy importantes durante el procesamiento de un gran número de muestras. Los errores de pipeteo pueden conducir a una interpretación errónea completa de los datos y aquí la plataforma robótica proporcionó una baja variación entre muestras. También el uso de la plataforma robótica para cPILOT redujo el tiempo necesario para preparar muestras. Por ejemplo, después de desarrollar el método automatizado, requirió 2,5 h para procesar 22 muestras en comparación con 7,5 h para cPILOT manual. Los experimentos están en marcha en nuestro laboratorio para evaluar aún más las comparaciones de los flujos de trabajo manuales y automatizados de cPILOT. Basándose en informes anteriores de nuestro laboratorio, el CV% de las intensidades de iones de reportero de proteínas en el manual cPILOT fueron en promedio 20% con algunos valores atípicos que superan este valor¹².

cPILOT es una estrategia de derivación química a nivel de péptido, que se puede utilizar para cualquier tipo de muestra como células, tejidos y fluidos corporales. cPILOT ofrece multiplexación de muestras mejorada y con la incorporación de automatización puede facilitar la multiplexación de muestras de alto rendimiento en proteómica. Este rendimiento es necesario para avanzar aún más en la comprensión de la enfermedad y la comprensión biológica y el descubrimiento de biomarcadores.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores reconocen los Fondos de Puesta en marcha de la Universidad Vanderbilt y el premio NIH (R01GM117191) a RASR.

Materials

0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk	Fisher Scientific	04-408-120	Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient
0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units	EMD Millipore	UFC30DV00
1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk	Fisher Scientific	05-408-129	Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient
2 ml black deep well plate	Analytical Sales and Services, Inc.	59623-23BKGC	Any brand of black 96-well plate is sufficient
2 ml clear deep well plate	VWR	75870-796
Acetic Acid	J.T. Baker	9508-01
Acetonitrile – MS Grade	Fisher Scientific	A955-4	4 L quantity is not necessary
Agilent 500µL plate	Agilent	203942-100	Reagent plate for adding buffers
Ammonium formate	Acros Organics	208-753-9
Ammonium hydroxide solution (28 – 30%)	Sigma Aldrich	320145-500ML
Analytical balance	Mettler Toledo	AL54
BCA protein assay kit	Pierce Thermo Fisher Scientific	23227
Biomek i7 hybrid	Beckmann		Any liquid handling device with ability to use positive pressure, heating/cooling and Vortex the samples.
C18 packing material (2.5 µm, 100 Å)	Bruker		This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient
Centrifuge with plate rotor	Thermo Scientific	69720
Micro 21R Centrifuge	Sorval	5437
Dionex 3000 UHPLC	Thermo Scientific		This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.
Dithiothreiotol (DTT)	Fisher Scientific	BP172-5
Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C	Sigma Aldrich, Chemistry	596388-1G
Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 – 38% in H2O	Sigma Aldrich, Life Science	F8775-25ML
Formic Acid	Fluka Analytical	94318-250ML-F
Fusion Lumos Mass Spectrometer	Thermo Scientific		This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.
Hydroxylamine hydrochloride	Sigma Aldrich, Chemistry	255580-100G
Iodoacetamide (IAM)	Acros Organics	144-48-9
Isobaric Tagging Kit (TMT 11-plex)	Thermo Fisher Scientific	90061
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas	Sigma Aldrich, Life Science	T1426-100MG
L-Cysteine	Sigma Aldrich, Chemistry	168149-25G
Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G)	MP Biomedicals	116005500
pH 10 buffer	Fisher Scientific	06-664-261	Any brand of pH buffer 10 is sufficient
pH 7 buffer	Fisher Scientific	06-664-260	Any brand pH buffer 7 is sufficient
pH meter (Tris compatiable)	Fisher Scientific (Accumet)	13-620-183	Any brand of a pH meter is sufficient
Protein software (e.g. Proteome Discoverer)	Thermo Scientific
Reservior plate 200ml	Agilent	204017-100
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP	Sigma Aldrich, Chemistry	190020-1G
Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95%	Sigma Aldrich	156159-10G
Speed-vac	Thermo Scientific	SPD1010	any brand of speed vac that can accommodate a deep well plate is sufficient
Stir plate	VWR	12365-382	Any brand of stir plates are sufficient
Targa 20 mg SPE plates	Nest Group, Inc.	HNS S18V	These are C18 cartridges
Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer	Sigma Aldrich, Life Science	T7408-100ML
Tris	Biorad	161-0716
Biomek 24-Place Tube Rack Holder	Beckmann	373661
Urea	Biorad	161-0731
Water – MS Grade	Fisher Scientific	W6-4	4 L quantity is not necessary

Referencias

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Citar este artículo

Arul, A. B., Robinson, R. A. Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT). J. Vis. Exp. (166), e61342, doi:10.3791/61342 (2020).