JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurociencias

Tek Bir Kemirgen Beyin Örneklerinde İnme Sonrası Serebral Ödem, Enfarktüs Bölgesi ve Kan-Beyin Bariyeri Kırılımının Ölçülmesi

Published: October 23, 2020
doi:
10.3791/61309
, , , , , , , , ,
1Department of Anesthesiology and Critical Care, Soroka Medical Center,Ben-Gurion University of the Negev, 2Department of Anesthesiology,Yale University School of Medicine, 3Department of Neurosurgery, Soroka University Medical Center and the Faculty of Health Sciences,Ben-Gurion University of the Negev, 4Department of Physiology, Faculty of Biology, Ecology and Medicine,Dnepropetrovsk State University

Summary

Bu protokol, aynı kemirgen beyin örnekleri kümesinde iskemik beyin hasarının en önemli üç parametresini ölçmenin yeni bir tekniğini açıklar. Sadece bir beyin örneği kullanmak etik ve ekonomik maliyetler açısından oldukça avantajlıdır.

Abstract

Dünya genelinde morbidite ve mortalitenin en sık nedenlerinden biri iskemik inmedir. Tarihsel olarak, iskemik inmeyi uyarmak için kullanılan bir hayvan modeli orta serebral arter tıkanıklığını (MCAO) içerir. Enfarktüs bölgesi, beyin ödemi ve kan-beyin bariyeri (BBB) bozulması MCAO sonrası beyin hasarının boyutunu yansıtan parametreler olarak ölçülür. Bu yöntemin önemli bir sınırlaması, bu ölçümlerin normalde farklı sıçan beyin örneklerinde elde edilmesi ve uygun bir örnek boyutu için ötenazi yapılması gereken çok sayıda sıçan nedeniyle etik ve finansal yüklere yol açtır. Burada, aynı sıçan beyin kümesinde enfarktüs bölgesini, beyin ödemini ve BBB geçirgenliğini ölçerek MCAO’yu takiben beyin hasarının doğru bir şekilde değerlendirilmesi için bir yöntem sunuyoruz. Bu yeni teknik, inmenin patofizyolojisini değerlendirmek için daha verimli bir yol sağlar.

Introduction

Dünya genelinde morbidite ve mortalitenin en sık nedenlerinden biri inmedir. Küresel olarak, iskemik inme tüm inme vakalarının% 68’ini temsil ederken, Amerika Birleşik Devletleri’nde iskemik inme, inme vakalarının% 87’sini oluşturur1,2. İnmenin ekonomik yükünün Amerika Birleşik Devletleri’nde2 ve Avrupa Birliği’nde 45 milyar Euro’ya ulaştığı tahmin edilmektedir3. İnmenin hayvan modelleri patofizyolojisini incelemek, değerlendirme için yeni yöntemler geliştirmek ve yeni terapötik seçenekler önermek için gereklidir4.

İskemik inme, genellikle orta serebral arter veya dallarından biri olan majör bir serebral arterin tıkanması ile ortaya çıkar5. Bu nedenle, iskemik inme modelleri tarihsel olarak orta serebral arter tıkanıklığını (MCAO)6, 7,8,9,10,11,12‘yikapsamıştır. MCAO’yu takip ederek, nörolojik yaralanma en sık 2,3,5-triphenyltetrazolium klorür (TTC) boyama yöntemi13, beyin ödemi (BE) kullanılarak enfarktüs bölgesi (IZ) ölçülerek değerlendirilir. ) Evans mavi boyama17 , 18,19kullanarak bir spektrometre tekniği ile kurutma veya hesaplama hemisferik hacimleri 14 , 15,16vekan beyin bariyeri (BBB) geçirgenliği kullanarak.

Geleneksel MCAO yöntemi, üç beyin ölçümünün her biri için ayrı beyin kümeleri kullanır. Büyük bir örneklem boyutu için, bu, ek etik ve finansal hususlarla birlikte önemli sayıda ötenaziye tabi hayvanla sonuçlanır. Bu maliyetleri hafifletmek için alternatif bir yöntem, MCAO sonrası kemirgen beyinlerinin tek bir kümesindeki üç parametrenin de ölçümünü içerecektir.

Aynı beyin örneğindeki parametrelerin kombinasyonlarını ölçmek için önceki girişimler yapılmıştır. Aynı beyin örneğinde TTC lekelemeden sonra eşzamanlı immünoresan boyama yöntemleri20 ve diğer moleküler ve biyokimyasal analizler21 tanımlanmıştır. Daha önce beyin ödemini değerlendirmek için beyin yarımküre hacimlerini hesapladık ve aynı beyin setinde enfarktüs bölgesini hesaplamak için TTC boyama yaptık15.

Mevcut protokolde, aynı kemirgen beyin kümesinde IZ, BE ve BBB geçirgenliğini belirleyerek iskemik beyin hasarını ölçen değiştirilmiş bir MCAO tekniği sunuyoruz. IZ TTC boyama ile ölçülür, BE yarım küre hacmi hesaplanarak belirlenir ve BBB geçirgenliği spektrometre yöntemleri ile elde edilir19. Bu protokolde, monofilament kateterin iç karotid artere (ICA) doğrudan yerleştirilmesine ve sabitlenmesine ve orta serebral artere (MCA) kan akışının daha fazla engellenmesine dayanan modifiye bir MCAO modeli kullandık22. Bu değiştirilmiş yöntem, geleneksel MCAO yöntemi16,22’yekıyasla ölüm ve morbidite oranının azaldığını göstermektedir.

Bu yeni yaklaşım, MCAO’dan sonra nörolojik hasarı ölçmek için finansal açıdan sağlam ve etik bir model sunmaktadır. İskemik beyin hasarının ana parametrelerinin bu değerlendirmesi, patofizyolojisinin kapsamlı bir şekilde araştırılmasına yardımcı olacaktır.

Protocol

Aşağıdaki prosedürler Helsinki ve Tokyo Bildirgesi’nin önerilerine ve Avrupa Topluluğu Deney Hayvanlarının Kullanımına İlişkin Yönergelere göre gerçek yapılmıştır. Deneyler, Negev Ben-Gurion Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından da onaylandı. 1. Sıçanların deneysel prosedüre hazırlanması Her biri 300 ila 350 g ağırlığında, açık patolojisi olmayan yetişkin erkek Sprague-Dawley sıçanlarını seçin. Deneyden önce 12 saatlik aç?…

Representative Results

Enfarktüs bölgesi ölçümü Bağımsız örneklemli bir t-testi, kalıcı MCAO uygulanan 19 sıçanın, 16 sahte fareye kıyasla beyin enfarktüs hacminde önemli bir artış gösterdiğini göstermiştir (MCAO=% 7.49 ± 3.57 vs. Sham = %0,31 ± 1,9, t(28,49) = 7,56, p < 0,01 (bkz. Şekil 2A)). Veriler, SD’± kontrallateral yarımkürenin ortalama bir yüzdesi olarak ifade edilir. Beyin öde…

Discussion

Mevcut protokolün temel amacı, iskemik yaralanmanın üç ana parametresinin tutarlı ölçümlerini göstermekti: IZ, BE ve BBB geçirgenliği. Bu alanda daha önce yapılan çalışmalar, bu parametrelerden bir veya ikisinin aynı örnekte birlikte gerçekleştirilme olasılığını ortaya koymuştur. Bu üç parçalı yöntemin sunduğu maliyet azaltmanın yanı sıra, ameliyat edilmesi ve daha sonra ötenazi yapılması gereken hayvan sayısını sınırlayan daha arzu edilen bir biyoetik model de sağlar. Tüm hi…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Maryna Kuscheriava, Maksym Kryvonosov, Daryna Yakumenko ve Fizyoloji Bölümü, Biyoloji, Ekoloji ve Tıp Fakültesi Evgenia Goncharyk, Oles Honchar, Dnipro Üniversitesi, Dnipro, Ukrayna’ya görüşmelerimize destekleri ve yararlı katkıları için teşekkür ederiz. Elde edilen veriler Ruslan Kuts’un doktora tezinin bir parçasıdır.

Materials

2 mL Syringe Braun 4606027V
2% chlorhexidine in 70% alcohol solution Sigma-Aldrich 500 cc Provides general antisepsis of the skin in the operatory field
27 G Needle with Syringe Braun 305620
3-0 Silk sutures Henry Schein 1007842
4-0 Nylon suture 4-00
Brain & Tissue Matrices Sigma-Aldrich 15013
Cannula Venflon 22 G KD-FIX 183603985447
Centrifuge Sigma 2-16P Sigma-Aldrich Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances Sigma-Aldrich HR-AZ/HR-A
Digital weighing scale Sigma-Aldrich Rs 4,000
Dissecting scissors Sigma-Aldrich Z265969
Eppendorf pipette Sigma-Aldrich Z683884
Eppendorf tube Sigma-Aldrich EP0030119460
Fluorescence detector Tecan, Männedorf Switzerland Model: Infinite 200 PRO multimode reader Optional.
Fluorescence detector Molecular Devices LLC VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument Optional.
Gauze sponges Fisher 22-362-178
Heater with thermometer Heatingpad-1 Model: HEATINGPAD-1/2
Hemostatic microclips Sigma-Aldrich
Horizon-XL Mennen Medical Ltd
Infusion cuff ABN IC-500
Micro forceps Sigma-Aldrich
Micro scissors Sigma-Aldrich
Multiset Teva Medical 998702
Olympus BX 40 microscope Olympus
Operating forceps Sigma-Aldrich
Operating scissors Sigma-Aldrich
Optical scanner Canon Cano Scan 4200F Resolution 3200 x 6400 dpi
Petri dishes Sigma-Aldrich P5606
Purina Chow Purina 5001 Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment.
Rat cages Techniplast 2000P Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment
Scalpel blades #11 Sigma-Aldrich S2771
Software
Adobe Photoshop CS2 for Windows Adobe
ImageJ 1.37v NIH The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA
Office 365 ProPlus Microsoft – Microsoft Office Excel
Windows 10 Microsoft
Reagents
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride Sigma-Aldrich 298-96-4
50% trichloroacetic acid Sigma-Aldrich 76-03-9
Ethanol 96 % Romical Flammable liquid
Evans blue 2% Sigma-Aldrich 314-13-6
Isoflurane, USP 100% Piramamal Critical Care, Inc NDC 66794-017
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Krishnamurthi, R. V., et al. Global and regional burden of first-ever ischaemic and haemorrhagic stroke during 1990-2010: findings from the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet Global Health. 1, 259-281 (2013).
  2. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, 146 (2017).
  3. Wilkins, E., et al. . European cardiovascular disease statistics 2017. , (2017).
  4. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
  5. Lloyd-Jones, D., et al. Heart disease and stroke statistics–2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 119, 480-486 (2009).
  6. Shigeno, T., McCulloch, J., Graham, D. I., Mendelow, A. D., Teasdale, G. M. Pure cortical ischemia versus striatal ischemia. Circulatory, metabolic, and neuropathologic consequences. Surgical Neurology. 24, 47-51 (1985).
  7. Albanese, V., Tommasino, C., Spadaro, A., Tomasello, F. A transbasisphenoidal approach for selective occlusion of the middle cerebral artery in rats. Experientia. 36, 1302-1304 (1980).
  8. Hudgins, W. R., Garcia, J. H. Transorbital approach to the middle cerebral artery of the squirrel monkey: a technique for experimental cerebral infarction applicable to ultrastructural studies. Stroke. 1, 107-111 (1970).
  9. Waltz, A. G., Sundt, T. M., Owen, C. A. Effect of middle cerebral artery occlusion on cortical blood flow in animals. Neurology. 16, 1185-1190 (1966).
  10. Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1, 53-60 (1981).
  11. Aspey, B. S., Cohen, S., Patel, Y., Terruli, M., Harrison, M. J. Middle cerebral artery occlusion in the rat: consistent protocol for a model of stroke. Neuropathology and Applied Neurobiology. 24, 487-497 (1998).
  12. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
  13. O’Brien, M. D., Jordan, M. M., Waltz, A. G. Ischemic cerebral edema and the blood-brain barrier. Distributions of pertechnetate, albumin, sodium, and antipyrine in brains of cats after occlusion of the middle cerebral artery. Archives of Neurology. 30, 461-465 (1974).
  14. Chen, C. H., Toung, T. J., Sapirstein, A., Bhardwaj, A. Effect of duration of osmotherapy on blood-brain barrier disruption and regional cerebral edema after experimental stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 26, 951-958 (2006).
  15. Boyko, M., et al. Establishment of Novel Technical Methods for Evaluating Brain Edema and Lesion Volume in Stroked Rats: a Standardization of Measurement Procedures. Brain Research. , (2019).
  16. Boyko, M., et al. An experimental model of focal ischemia using an internal carotid artery approach. Journal of Neuroscience Methods. 193, 246-253 (2010).
  17. Sifat, A. E., Vaidya, B., Abbruscato, T. J. Blood-Brain Barrier Protection as a Therapeutic Strategy for Acute Ischemic Stroke. AAPS Journal. 19, 957-972 (2017).
  18. Jiang, X., et al. Blood-brain barrier dysfunction and recovery after ischemic stroke. Progress in Neurobiology. 163-164, 144-171 (2018).
  19. Belayev, L., Busto, R., Zhao, W., Ginsberg, M. D. Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Research. 739, 88-96 (1996).
  20. Li, L., Yu, Q., Liang, W. Use of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride-stained brain tissues for immunofluorescence analyses after focal cerebral ischemia in rats. Pathology – Research and Practice. 214, 174-179 (2018).
  21. Kramer, M., et al. TTC staining of damaged brain areas after MCA occlusion in the rat does not constrict quantitative gene and protein analyses. Journal of Neuroscience Methods. 187, 84-89 (2010).
  22. Kuts, R., et al. A middle cerebral artery occlusion technique for inducing post-stroke depression in rats. Journal of Visualized Experiments. , e58875 (2019).
  23. Kuts, R., et al. A Novel Method for Assessing Cerebral Edema, Infarcted Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Post-stroke Rodent Brain. Frontiers in Neuroscience. 13, 1105 (2019).
  24. McGarry, B. L., Jokivarsi, K. T., Knight, M. J., Grohn, O. H. J., Kauppinen, R. A. A Magnetic Resonance Imaging Protocol for Stroke Onset Time Estimation in Permanent Cerebral Ischemia. Journal of Visualized Experiments. , e55277 (2017).
  25. Uluc, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Akture, E., Baskaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. Journal of Visualized Experiments. , e1978 (2011).
  26. Boyko, M., et al. The effect of blood glutamate scavengers oxaloacetate and pyruvate on neurological outcome in a rat model of subarachnoid hemorrhage. Neurotherapeutics. 9, 649-657 (2012).
  27. Kuts, R., et al. A Middle Cerebral Artery Occlusion Technique for Inducing Post-stroke Depression in Rats. Journal of Visualized Experiments. , e58875 (2019).
  28. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. , e3564 (2012).
  29. Poinsatte, K., et al. Quantification of neurovascular protection following repetitive hypoxic preconditioning and transient middle cerebral artery occlusion in mice. Journal of Visualized Experiments. , e52675 (2015).
  30. . ImageJ, U. S. National Institutes of Health Available from: https://imagej.nih.gov/ij (2018)
  31. Boyko, M., et al. Pyruvate’s blood glutamate scavenging activity contributes to the spectrum of its neuroprotective mechanisms in a rat model of stroke. European Journal of Neuroscience. 34, 1432-1441 (2011).
  32. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
  33. . ImageJ, U. S. National Institutes of Health Available from: https://imagej.nih.gov/ij (1997)
  34. Kaplan, B., et al. Temporal thresholds for neocortical infarction in rats subjected to reversible focal cerebral ischemia. Stroke. 22, 1032-1039 (1991).
  35. Kumai, Y., et al. Postischemic gene transfer of soluble Flt-1 protects against brain ischemia with marked attenuation of blood-brain barrier permeability. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 27, 1152-1160 (2007).
  36. Schuleri, K. H., et al. Characterization of peri-infarct zone heterogeneity by contrast-enhanced multidetector computed tomography: a comparison with magnetic resonance imaging. Journal of the American College of Cardiology. 53, 1699-1707 (2009).
  37. Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative Stress: A Key Modulator in Neurodegenerative Diseases. Molecules. 24, (2019).
  38. Di Napoli, M. Caplan’s Stroke: A Clinical Approach. Journal of the American Medical Association. 302, 2600-2601 (2009).
  39. Deb, P., Sharma, S., Hassan, K. M. Pathophysiologic mechanisms of acute ischemic stroke: An overview with emphasis on therapeutic significance beyond thrombolysis. Pathophysiology. 17, 197-218 (2010).
  40. Simard, J. M., Kent, T. A., Chen, M., Tarasov, K. V., Gerzanich, V. Brain oedema in focal ischaemia: molecular pathophysiology and theoretical implications. Lancet Neurology. 6, 258-268 (2007).
  41. Klatzo, I. Pathophysiological aspects of brain edema. Acta Neuropathology. 72, 236-239 (1987).
  42. Yang, Y., Rosenberg, G. A. Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease. Stroke. 42, 3323-3328 (2011).
  43. Lin, T. N., He, Y. Y., Wu, G., Khan, M., Hsu, C. Y. Effect of brain edema on infarct volume in a focal cerebral ischemia model in rats. Stroke. 24, 117-121 (1993).
  44. Liu, C., et al. Increased blood-brain barrier permeability in contralateral hemisphere predicts worse outcome in acute ischemic stroke after reperfusion therapy. Journal of NeuroInterventional Surgery. 10, 937-941 (2018).
  45. Boyko, M., et al. Establishment of novel technical methods for evaluating brain edema and lesion volume in stroked rats: A standardization of measurement procedures. Brain Research. 1718, 12-21 (2019).

Tags

StrokeCerebral EdemaInfarct ZoneBlood-brain BarrierBBB PermeabilityMiddle Cerebral Artery OcclusionIschemic Brain InjuryTTC StainingImageJInfarct VolumeBrain EdemaTrichloroacetic AcidLuminescence Spectrophotometry

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Frank, D., Gruenbaum, B. F., Grinshpun, J., Melamed, I., Severynovska, O., Kuts, R., Semyonov, M., Brotfain, E., Zlotnik, A., Boyko, M. Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples. J. Vis. Exp. (164), e61309, doi:10.3791/61309 (2020).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image