げっ歯類の脳サンプルの単一のセットで脳卒中後脳浮腫、梗塞ゾーンおよび血液脳関門破壊を測定する
1Department of Anesthesiology and Critical Care, Soroka Medical Center,Ben-Gurion University of the Negev, 2Department of Anesthesiology,Yale University School of Medicine, 3Department of Neurosurgery, Soroka University Medical Center and the Faculty of Health Sciences,Ben-Gurion University of the Negev, 4Department of Physiology, Faculty of Biology, Ecology and Medicine,Dnepropetrovsk State University
Summary
このプロトコルは、げっ歯類の脳サンプルの同じセット上の虚血性脳損傷の3つの最も重要なパラメータを測定する新しい技術を記述する。1つの脳サンプルのみを使用することは、倫理的および経済的コストの面で非常に有利である。
Abstract
世界的に罹患率と死亡率の最も一般的な原因の1つは虚血性脳卒中である。歴史的に、虚血性脳卒中を刺激するために使用される動物モデルは、中大脳動脈閉塞(MCAO)を含む。梗塞領域、脳浮腫および血液脳関門(BBB)の内訳は、MCAO後の脳損傷の程度を反映するパラメータとして測定される。この方法の重要な制限は、これらの測定は通常、異なるラットの脳サンプルで得られ、適切なサンプルサイズのために安楽死させられる必要がある多数のラットのために倫理的および財政的負担を引き起こします。ここでは、同じラット脳の中で梗塞領域、脳浮腫およびBBB透過性を測定することによってMCAOに続く脳損傷を正確に評価する方法を提示する。この新しい技術は、脳卒中の病態生理を評価するより効率的な方法を提供する。
Introduction
世界的に罹患率と死亡率の最も一般的な原因の1つは脳卒中です。世界的に、虚血性脳卒中は全脳卒中症例の68%を占め、米国では虚血性脳卒中が脳卒中症例1,2の87%を占める。脳卒中の経済的負担は、米国では240億ドル、欧州連合(EU)では450億ユーロに達すると推定されています。脳卒中の動物モデルは、その病態生理学を研究し、評価のための新しい方法を開発し、新しい治療オプションを提案するために必要です4.
虚血性脳卒中は、大脳動脈の閉塞で起こり、通常は中大脳動脈またはその枝の1つである5。したがって、虚血性脳卒中のモデルは、歴史的に中大脳動脈閉塞(MCAO)6、7、8、9、10、11、12を含む。MCAOに続いて、 神経損傷は、2,3,5トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)染色法13、脳浮腫(BE)を乾燥または半球量14、15、16、および血液脳関門(BBB)透過性を、エバンスブルー17を用いた透過性を測定することによって最も一般的に評価される。
従来のMCAO法は、3つの脳の測定のそれぞれのために別々の脳のセットを使用しています。サンプルサイズが大きい場合、これは、倫理的および財政的な考慮事項を追加して、安楽死させた動物のかなりの数になります。これらのコストを軽減する別の方法は、MCAO後げっ歯類の脳の単一のセットで3つのパラメータすべての測定を含むであろう。
以前の試みは、同じ脳サンプル内のパラメータの組み合わせを測定するために行われています.同時免疫蛍光染色法20 は、他の分子及び生化学的分析21 と同様に、同じ脳試料中でTTC染色後に記載されている。我々は以前に脳浮腫を評価するために脳半球の体積を計算し、同じ脳セット15で梗塞領域を計算するためにTTC染色を行った。
本プロトコルでは、同じ齧歯類脳の中でIZ、BE、BBB透過性を判定することで虚血性脳損傷を測定する改変MCAO技術を提示する。IZはTTC染色法により測定され、BEは半球体積を算出して求められ、BBB透過性は分光法19により得られる。このプロトコルでは、内部頸動脈(ICA)へのモノフィラメントカテーテルの直接挿入および固定に基づく改変MCAOモデルを用いた、および中大脳動脈(MCA)22への血流のさらなる遮断を用いた。この修飾方法は、従来のMCAO法16,22と比較して死亡率および罹患率の低下率を示す。
この新しいアプローチは、MCAO後の神経損傷を測定するための財政的に健全で倫理的なモデルを提供します。虚血性脳損傷の主なパラメータのこの評価は、その病態生理学を包括的に調査するのに役立ちます。
Protocol
以下の手順は、ヘルシンキ宣言及び東京宣言及び欧州共同体の実験動物使用に関するガイドラインに従って行われた。実験はまた、ネゲブのベングリオン大学で動物ケア委員会によって承認されました. 実験手順のための1.ラットの準備 成人オスのスプレイグ・ドーリーラットを、あから過ぎの病理を伴わず、それぞれ300〜350gの重さを選択する。 実験前に…
Representative Results
梗塞ゾーン測定 独立サンプルt-テストでは、永久的MCAOを受けた19匹のラットが、3.57ラット対シャム=0.31%± ±1.9、t(28.49)=7.56、p<0.01(図2)と比較して脳梗塞容積が有意に増加したことを示した(図2A)。データは、SDの反側半球±平均パーセントとして表されます。 脳浮腫測定 ?…
Discussion
本プロトコルの主な目標は、虚血性損傷の3つの主要なパラメータの一貫した測定を実証することであった:IZ、BEおよびBBB透過性。この分野の以前の研究は、同じサンプルでこれらのパラメータの1つまたは2つを一緒に実行する可能性を実証しました。この3部構成の方法が提供するコスト削減に加えて、手術とその後の安楽死化しなければならない動物の数を制限するより望ましい生物倫理モ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
マリナ・クシェリアヴァ、マクシム・クリヴォノソフ、ダリーナ・ヤクメンコ、エフゲニア・ゴンチャリク生物学・生態学・医学部、オレス・ホンチャリク、ドニプロ大学、ドニプロ、ウクライナの皆様のご支援、そして私たちの議論への貢献に感謝します。得られたデータは、ルスラン・クッツ博士課程の一部です。
Materials
| 2 mL Syringe | Braun | 4606027V | |
| 2% chlorhexidine in 70% alcohol solution | Sigma-Aldrich | 500 cc | Provides general antisepsis of the skin in the operatory field |
| 27 G Needle with Syringe | Braun | 305620 | |
| 3-0 Silk sutures | Henry Schein | 1007842 | |
| 4-0 Nylon suture | 4-00 | ||
| Brain & Tissue Matrices | Sigma-Aldrich | 15013 | |
| Cannula Venflon 22 G | KD-FIX | 183603985447 | |
| Centrifuge Sigma 2-16P | Sigma-Aldrich | Sigma 2-16P | |
| Compact Analytical Balances | Sigma-Aldrich | HR-AZ/HR-A | |
| Digital weighing scale | Sigma-Aldrich | Rs 4,000 | |
| Dissecting scissors | Sigma-Aldrich | Z265969 | |
| Eppendorf pipette | Sigma-Aldrich | Z683884 | |
| Eppendorf tube | Sigma-Aldrich | EP0030119460 | |
| Fluorescence detector | Tecan, Männedorf Switzerland | Model: Infinite 200 PRO multimode reader | Optional. |
| Fluorescence detector | Molecular Devices LLC | VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument | Optional. |
| Gauze sponges | Fisher | 22-362-178 | |
| Heater with thermometer | Heatingpad-1 | Model: HEATINGPAD-1/2 | |
| Hemostatic microclips | Sigma-Aldrich | ||
| Horizon-XL | Mennen Medical Ltd | ||
| Infusion cuff | ABN | IC-500 | |
| Micro forceps | Sigma-Aldrich | ||
| Micro scissors | Sigma-Aldrich | ||
| Multiset | Teva Medical | 998702 | |
| Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
| Operating forceps | Sigma-Aldrich | ||
| Operating scissors | Sigma-Aldrich | ||
| Optical scanner | Canon | Cano Scan 4200F | Resolution 3200 x 6400 dpi |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5606 | |
| Purina Chow | Purina | 5001 | Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment. |
| Rat cages | Techniplast | 2000P | Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment |
| Scalpel blades #11 | Sigma-Aldrich | S2771 | |
| Software | |||
| Adobe Photoshop CS2 for Windows | Adobe | ||
| ImageJ 1.37v | NIH | The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA | |
| Office 365 ProPlus | Microsoft | – | Microsoft Office Excel |
| Windows 10 | Microsoft | ||
| Reagents | |||
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Sigma-Aldrich | 298-96-4 | |
| 50% trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 76-03-9 | |
| Ethanol 96 % | Romical | Flammable liquid | |
| Evans blue 2% | Sigma-Aldrich | 314-13-6 | |
| Isoflurane, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | NDC 66794-017 |
Referencias
- Krishnamurthi, R. V., et al. Global and regional burden of first-ever ischaemic and haemorrhagic stroke during 1990-2010: findings from the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet Global Health. 1, 259-281 (2013).
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, 146 (2017).
- Wilkins, E., et al. . European cardiovascular disease statistics 2017. , (2017).
- Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
- Lloyd-Jones, D., et al. Heart disease and stroke statistics–2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 119, 480-486 (2009).
- Shigeno, T., McCulloch, J., Graham, D. I., Mendelow, A. D., Teasdale, G. M. Pure cortical ischemia versus striatal ischemia. Circulatory, metabolic, and neuropathologic consequences. Surgical Neurology. 24, 47-51 (1985).
- Albanese, V., Tommasino, C., Spadaro, A., Tomasello, F. A transbasisphenoidal approach for selective occlusion of the middle cerebral artery in rats. Experientia. 36, 1302-1304 (1980).
- Hudgins, W. R., Garcia, J. H. Transorbital approach to the middle cerebral artery of the squirrel monkey: a technique for experimental cerebral infarction applicable to ultrastructural studies. Stroke. 1, 107-111 (1970).
- Waltz, A. G., Sundt, T. M., Owen, C. A. Effect of middle cerebral artery occlusion on cortical blood flow in animals. Neurology. 16, 1185-1190 (1966).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1, 53-60 (1981).
- Aspey, B. S., Cohen, S., Patel, Y., Terruli, M., Harrison, M. J. Middle cerebral artery occlusion in the rat: consistent protocol for a model of stroke. Neuropathology and Applied Neurobiology. 24, 487-497 (1998).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
- O’Brien, M. D., Jordan, M. M., Waltz, A. G. Ischemic cerebral edema and the blood-brain barrier. Distributions of pertechnetate, albumin, sodium, and antipyrine in brains of cats after occlusion of the middle cerebral artery. Archives of Neurology. 30, 461-465 (1974).
- Chen, C. H., Toung, T. J., Sapirstein, A., Bhardwaj, A. Effect of duration of osmotherapy on blood-brain barrier disruption and regional cerebral edema after experimental stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 26, 951-958 (2006).
- Boyko, M., et al. Establishment of Novel Technical Methods for Evaluating Brain Edema and Lesion Volume in Stroked Rats: a Standardization of Measurement Procedures. Brain Research. , (2019).
- Boyko, M., et al. An experimental model of focal ischemia using an internal carotid artery approach. Journal of Neuroscience Methods. 193, 246-253 (2010).
- Sifat, A. E., Vaidya, B., Abbruscato, T. J. Blood-Brain Barrier Protection as a Therapeutic Strategy for Acute Ischemic Stroke. AAPS Journal. 19, 957-972 (2017).
- Jiang, X., et al. Blood-brain barrier dysfunction and recovery after ischemic stroke. Progress in Neurobiology. 163-164, 144-171 (2018).
- Belayev, L., Busto, R., Zhao, W., Ginsberg, M. D. Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Research. 739, 88-96 (1996).
- Li, L., Yu, Q., Liang, W. Use of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride-stained brain tissues for immunofluorescence analyses after focal cerebral ischemia in rats. Pathology – Research and Practice. 214, 174-179 (2018).
- Kramer, M., et al. TTC staining of damaged brain areas after MCA occlusion in the rat does not constrict quantitative gene and protein analyses. Journal of Neuroscience Methods. 187, 84-89 (2010).
- Kuts, R., et al. A middle cerebral artery occlusion technique for inducing post-stroke depression in rats. Journal of Visualized Experiments. , e58875 (2019).
- Kuts, R., et al. A Novel Method for Assessing Cerebral Edema, Infarcted Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Post-stroke Rodent Brain. Frontiers in Neuroscience. 13, 1105 (2019).
- McGarry, B. L., Jokivarsi, K. T., Knight, M. J., Grohn, O. H. J., Kauppinen, R. A. A Magnetic Resonance Imaging Protocol for Stroke Onset Time Estimation in Permanent Cerebral Ischemia. Journal of Visualized Experiments. , e55277 (2017).
- Uluc, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Akture, E., Baskaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. Journal of Visualized Experiments. , e1978 (2011).
- Boyko, M., et al. The effect of blood glutamate scavengers oxaloacetate and pyruvate on neurological outcome in a rat model of subarachnoid hemorrhage. Neurotherapeutics. 9, 649-657 (2012).
- Kuts, R., et al. A Middle Cerebral Artery Occlusion Technique for Inducing Post-stroke Depression in Rats. Journal of Visualized Experiments. , e58875 (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. , e3564 (2012).
- Poinsatte, K., et al. Quantification of neurovascular protection following repetitive hypoxic preconditioning and transient middle cerebral artery occlusion in mice. Journal of Visualized Experiments. , e52675 (2015).
- . ImageJ, U. S. National Institutes of Health Available from: https://imagej.nih.gov/ij (2018)
- Boyko, M., et al. Pyruvate’s blood glutamate scavenging activity contributes to the spectrum of its neuroprotective mechanisms in a rat model of stroke. European Journal of Neuroscience. 34, 1432-1441 (2011).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- . ImageJ, U. S. National Institutes of Health Available from: https://imagej.nih.gov/ij (1997)
- Kaplan, B., et al. Temporal thresholds for neocortical infarction in rats subjected to reversible focal cerebral ischemia. Stroke. 22, 1032-1039 (1991).
- Kumai, Y., et al. Postischemic gene transfer of soluble Flt-1 protects against brain ischemia with marked attenuation of blood-brain barrier permeability. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 27, 1152-1160 (2007).
- Schuleri, K. H., et al. Characterization of peri-infarct zone heterogeneity by contrast-enhanced multidetector computed tomography: a comparison with magnetic resonance imaging. Journal of the American College of Cardiology. 53, 1699-1707 (2009).
- Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative Stress: A Key Modulator in Neurodegenerative Diseases. Molecules. 24, (2019).
- Di Napoli, M. Caplan’s Stroke: A Clinical Approach. Journal of the American Medical Association. 302, 2600-2601 (2009).
- Deb, P., Sharma, S., Hassan, K. M. Pathophysiologic mechanisms of acute ischemic stroke: An overview with emphasis on therapeutic significance beyond thrombolysis. Pathophysiology. 17, 197-218 (2010).
- Simard, J. M., Kent, T. A., Chen, M., Tarasov, K. V., Gerzanich, V. Brain oedema in focal ischaemia: molecular pathophysiology and theoretical implications. Lancet Neurology. 6, 258-268 (2007).
- Klatzo, I. Pathophysiological aspects of brain edema. Acta Neuropathology. 72, 236-239 (1987).
- Yang, Y., Rosenberg, G. A. Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease. Stroke. 42, 3323-3328 (2011).
- Lin, T. N., He, Y. Y., Wu, G., Khan, M., Hsu, C. Y. Effect of brain edema on infarct volume in a focal cerebral ischemia model in rats. Stroke. 24, 117-121 (1993).
- Liu, C., et al. Increased blood-brain barrier permeability in contralateral hemisphere predicts worse outcome in acute ischemic stroke after reperfusion therapy. Journal of NeuroInterventional Surgery. 10, 937-941 (2018).
- Boyko, M., et al. Establishment of novel technical methods for evaluating brain edema and lesion volume in stroked rats: A standardization of measurement procedures. Brain Research. 1718, 12-21 (2019).
Citar este artículo
Frank, D., Gruenbaum, B. F., Grinshpun, J., Melamed, I., Severynovska, O., Kuts, R., Semyonov, M., Brotfain, E., Zlotnik, A., Boyko, M. Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples. J. Vis. Exp. (164), e61309, doi:10.3791/61309 (2020).