JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurociencias

قياس الوذمة الدماغية بعد السكتة الدماغية، منطقة إنفاركت وانهيار حاجز الدم والدماغ في مجموعة واحدة من عينات الدماغ القوارض

Published: October 23, 2020
doi:
10.3791/61309
, , , , , , , , ,
1Department of Anesthesiology and Critical Care, Soroka Medical Center,Ben-Gurion University of the Negev, 2Department of Anesthesiology,Yale University School of Medicine, 3Department of Neurosurgery, Soroka University Medical Center and the Faculty of Health Sciences,Ben-Gurion University of the Negev, 4Department of Physiology, Faculty of Biology, Ecology and Medicine,Dnepropetrovsk State University

Summary

يصف هذا البروتوكول تقنية جديدة لقياس أهم ثلاثة معلمات لإصابة الدماغ الإقفاري على نفس المجموعة من عينات دماغ القوارض. استخدام عينة واحدة فقط الدماغ مفيد للغاية من حيث التكاليف الأخلاقية والاقتصادية.

Abstract

واحد من الأسباب الأكثر شيوعا من الاعتلال والوفيات في جميع أنحاء العالم هو السكتة الدماغية. تاريخيا، نموذج حيواني يستخدم لتحفيز السكتة الدماغية ينطوي على انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAO). يتم قياس منطقة الحفارة وذمة الدماغ وانهيار حاجز الدم في الدماغ (BBB) كمعلمات تعكس مدى إصابة الدماغ بعد MCAO. ومن القيود الهامة على هذه الطريقة أن هذه القياسات يتم الحصول عليها عادة في عينات مختلفة من مخ الفئران، مما يؤدي إلى أعباء أخلاقية ومالية بسبب العدد الكبير من الجرذان التي تحتاج إلى القتل الرحيم لحجم العينة المناسب. هنا نقدم طريقة لتقييم إصابات الدماغ بدقة بعد MCAO عن طريق قياس منطقة الفاركت ، وذمة الدماغ ونفاذية BBB في نفس المجموعة من أدمغة الفئران. هذه التقنية الجديدة يوفر وسيلة أكثر كفاءة لتقييم الفيزيولوجيا المرضية من السكتة الدماغية.

Introduction

أحد الأسباب الأكثر شيوعاً للمراضة والوفيات في جميع أنحاء العالم هو السكتة الدماغية. على الصعيد العالمي، يمثل السكتة الدماغية 68٪ من جميع حالات السكتة الدماغية، في حين أن السكتة الدماغية في الولايات المتحدة تمثل 87٪ من حالات السكتة الدماغية1،2. ويقدر أن العبء الاقتصادي للسكتة الدماغية يصل إلى 34 مليار دولار في الولايات المتحدة2 و 45 مليار يورو في الاتحاد الأوروبي3. النماذج الحيوانية من السكتة الدماغية ضرورية لدراسة الفيزيولوجيا المرضية، وتطوير أساليب جديدة للتقييم، واقتراح خيارات علاجية جديدة4.

السكتة الدماغية يحدث مع انسداد الشريان الدماغي الرئيسي، وعادة ما الشريان الدماغي الأوسط أو أحد فروعه5. وهكذا، قد شملت نماذج من السكتة الدماغية تاريخيا انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAO)6،7،8،9،10،11،12. بعد MCAO، يتم تقييم الإصابة العصبية الأكثر شيوعًا عن طريق قياس منطقة الفاركت (IZ) باستخدام 2,3,5-ثلاثية الفينيل تيترازوليوم (TTC) طريقة تلطيخ13, وذمة الدماغ (BE) باستخدام تجفيف أو حساب وحدات التخزين نصف الكرة14،15،16، ونفاذية الدم في الدماغ (BBB) بواسطة تقنية القياس الطيفي باستخدام ايفانز الأزرق تلطيخ17،18،19.

تستخدم طريقة MCAO التقليدية مجموعات منفصلة من الأدمغة لكل من قياسات الدماغ الثلاثة. بالنسبة لحجم العينة الكبيرة ، يؤدي هذا إلى عدد كبير من الحيوانات الرحيمة ، مع اعتبارات أخلاقية ومالية إضافية. وهناك طريقة بديلة لتخفيف هذه التكاليف تتضمن قياسات للبارامترات الثلاثة في مجموعة واحدة من أدمغة القوارض بعد MCAO.

وقد بذلت محاولات سابقة لقياس مجموعات من المعلمات في نفس عينة الدماغ. في وقت واحد immunofluorescent أساليب تلوين20 فضلا عن غيرها من التحليلات الجزيئية والبيوكيميائية21 وقد وصفت بعد تلطيخ TTC في نفس عينة الدماغ. لدينا سابقا حسابات أحجام نصف الكرة الدماغ لتقييم وذمة الدماغ وأداء تلطيخ TTC لحساب منطقة في المزارع في نفس مجموعة الدماغ15.

في هذا البروتوكول، نقدم تقنية MCAO المعدلة التي تقيس إصابة الدماغ الإقفارية من خلال تحديد النفاذية IZ و BE و BBB في نفس المجموعة من أدمغة القوارض. يتم قياس IZ بواسطة تلطيخ TTC ، يتم تحديد BE عن طريق حساب حجم نصف الكرة ، ويتم الحصول على نفاذية BBB بواسطة أساليب القياس الطيفي19. في هذا البروتوكول، استخدمنا نموذج MCAO المعدلة، استنادا إلى الإدراج المباشر والثابة من القسطرة أحادية في الشريان السباتي الداخلي (ICA) ومزيد من سد تدفق الدم إلى الشريان الدماغي الأوسط (MCA)22. هذه الطريقة المعدلة تظهر انخفاض معدل الوفيات والاعتلال مقارنة مع الطريقة التقليدية MCAO16،22.

يوفر هذا النهج الجديد نموذجًا أخلاقيًا وسليمًا ماليًا لقياس الإصابات العصبية بعد MCAO. هذا التقييم للبارامترات الرئيسية للإصابة الدماغية الإقفارية سيساعد على التحقيق الشامل في الفيزيولوجيا المرضية.

Protocol

10- وقد أجريت الإجراءات التالية وفقاً لتوصيات إعلان هلسنكي وطوكيو والمبادئ التوجيهية للجماعة الأوروبية بشأن استخدام الحيوانات التجريبية. كما وافقت لجنة رعاية الحيوان في جامعة بن غوريون في النقب على هذه التجارب. 1. إعداد الفئران لإجراء تجريبي حدد فئران Sprague-Dawley الذكور ا…

Representative Results

قياس منطقة infarct وأشار اختبار T عينة مستقلة أن 19 الفئران التي خضعت MCAO دائمة أظهرت زيادة كبيرة في حجم المزارع في الدماغ مقارنة مع الفئران 16 التي تعمل بالتشكيل (MCAO = 7.49٪ ± 3.57 مقابل. الشام = 0.31٪ ± 1.9، ر(28.49) = 7.56، p < 0.01 (انظر الشكل 2A)). ويعبر عن البيانات…

Discussion

وكان الهدف الرئيسي لهذا البروتوكول هو إظهار قياسات متسقة لثلاثة بارامترات رئيسية للإصابة باقفزي: IZ، و BE، و BBB النفاذية. وقد أظهرت الدراسات السابقة في هذا المجال إمكانية تنفيذ واحد أو اثنين من هذه المعلمات معا في نفس العينة. وإلى جانب تخفيض التكلفة الذي توفره هذه الطريقة من ثلاثة أجزاء، فإن…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر كل من ماريانا كوشيريافا، ماكسيم كريفونوسوف، دارينا ياكومينكو، ويفجينيا جونتشاريك من قسم علم وظائف الأعضاء، كلية علم الأحياء، علم البيئة والطب، أوليز هونشار، جامعة دنيبرو، دنيبرو، أوكرانيا على دعمهم ومساهماتهم المفيدة في مناقشاتنا. البيانات التي تم الحصول عليها هي جزء من أطروحة الدكتوراه التي كتبها رسلان كوتس.

Materials

2 mL Syringe Braun 4606027V
2% chlorhexidine in 70% alcohol solution Sigma-Aldrich 500 cc Provides general antisepsis of the skin in the operatory field
27 G Needle with Syringe Braun 305620
3-0 Silk sutures Henry Schein 1007842
4-0 Nylon suture 4-00
Brain & Tissue Matrices Sigma-Aldrich 15013
Cannula Venflon 22 G KD-FIX 183603985447
Centrifuge Sigma 2-16P Sigma-Aldrich Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances Sigma-Aldrich HR-AZ/HR-A
Digital weighing scale Sigma-Aldrich Rs 4,000
Dissecting scissors Sigma-Aldrich Z265969
Eppendorf pipette Sigma-Aldrich Z683884
Eppendorf tube Sigma-Aldrich EP0030119460
Fluorescence detector Tecan, Männedorf Switzerland Model: Infinite 200 PRO multimode reader Optional.
Fluorescence detector Molecular Devices LLC VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument Optional.
Gauze sponges Fisher 22-362-178
Heater with thermometer Heatingpad-1 Model: HEATINGPAD-1/2
Hemostatic microclips Sigma-Aldrich
Horizon-XL Mennen Medical Ltd
Infusion cuff ABN IC-500
Micro forceps Sigma-Aldrich
Micro scissors Sigma-Aldrich
Multiset Teva Medical 998702
Olympus BX 40 microscope Olympus
Operating forceps Sigma-Aldrich
Operating scissors Sigma-Aldrich
Optical scanner Canon Cano Scan 4200F Resolution 3200 x 6400 dpi
Petri dishes Sigma-Aldrich P5606
Purina Chow Purina 5001 Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment.
Rat cages Techniplast 2000P Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment
Scalpel blades #11 Sigma-Aldrich S2771
Software
Adobe Photoshop CS2 for Windows Adobe
ImageJ 1.37v NIH The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA
Office 365 ProPlus Microsoft – Microsoft Office Excel
Windows 10 Microsoft
Reagents
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride Sigma-Aldrich 298-96-4
50% trichloroacetic acid Sigma-Aldrich 76-03-9
Ethanol 96 % Romical Flammable liquid
Evans blue 2% Sigma-Aldrich 314-13-6
Isoflurane, USP 100% Piramamal Critical Care, Inc NDC 66794-017
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Krishnamurthi, R. V., et al. Global and regional burden of first-ever ischaemic and haemorrhagic stroke during 1990-2010: findings from the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet Global Health. 1, 259-281 (2013).
  2. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, 146 (2017).
  3. Wilkins, E., et al. . European cardiovascular disease statistics 2017. , (2017).
  4. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
  5. Lloyd-Jones, D., et al. Heart disease and stroke statistics–2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 119, 480-486 (2009).
  6. Shigeno, T., McCulloch, J., Graham, D. I., Mendelow, A. D., Teasdale, G. M. Pure cortical ischemia versus striatal ischemia. Circulatory, metabolic, and neuropathologic consequences. Surgical Neurology. 24, 47-51 (1985).
  7. Albanese, V., Tommasino, C., Spadaro, A., Tomasello, F. A transbasisphenoidal approach for selective occlusion of the middle cerebral artery in rats. Experientia. 36, 1302-1304 (1980).
  8. Hudgins, W. R., Garcia, J. H. Transorbital approach to the middle cerebral artery of the squirrel monkey: a technique for experimental cerebral infarction applicable to ultrastructural studies. Stroke. 1, 107-111 (1970).
  9. Waltz, A. G., Sundt, T. M., Owen, C. A. Effect of middle cerebral artery occlusion on cortical blood flow in animals. Neurology. 16, 1185-1190 (1966).
  10. Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1, 53-60 (1981).
  11. Aspey, B. S., Cohen, S., Patel, Y., Terruli, M., Harrison, M. J. Middle cerebral artery occlusion in the rat: consistent protocol for a model of stroke. Neuropathology and Applied Neurobiology. 24, 487-497 (1998).
  12. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
  13. O’Brien, M. D., Jordan, M. M., Waltz, A. G. Ischemic cerebral edema and the blood-brain barrier. Distributions of pertechnetate, albumin, sodium, and antipyrine in brains of cats after occlusion of the middle cerebral artery. Archives of Neurology. 30, 461-465 (1974).
  14. Chen, C. H., Toung, T. J., Sapirstein, A., Bhardwaj, A. Effect of duration of osmotherapy on blood-brain barrier disruption and regional cerebral edema after experimental stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 26, 951-958 (2006).
  15. Boyko, M., et al. Establishment of Novel Technical Methods for Evaluating Brain Edema and Lesion Volume in Stroked Rats: a Standardization of Measurement Procedures. Brain Research. , (2019).
  16. Boyko, M., et al. An experimental model of focal ischemia using an internal carotid artery approach. Journal of Neuroscience Methods. 193, 246-253 (2010).
  17. Sifat, A. E., Vaidya, B., Abbruscato, T. J. Blood-Brain Barrier Protection as a Therapeutic Strategy for Acute Ischemic Stroke. AAPS Journal. 19, 957-972 (2017).
  18. Jiang, X., et al. Blood-brain barrier dysfunction and recovery after ischemic stroke. Progress in Neurobiology. 163-164, 144-171 (2018).
  19. Belayev, L., Busto, R., Zhao, W., Ginsberg, M. D. Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Research. 739, 88-96 (1996).
  20. Li, L., Yu, Q., Liang, W. Use of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride-stained brain tissues for immunofluorescence analyses after focal cerebral ischemia in rats. Pathology – Research and Practice. 214, 174-179 (2018).
  21. Kramer, M., et al. TTC staining of damaged brain areas after MCA occlusion in the rat does not constrict quantitative gene and protein analyses. Journal of Neuroscience Methods. 187, 84-89 (2010).
  22. Kuts, R., et al. A middle cerebral artery occlusion technique for inducing post-stroke depression in rats. Journal of Visualized Experiments. , e58875 (2019).
  23. Kuts, R., et al. A Novel Method for Assessing Cerebral Edema, Infarcted Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Post-stroke Rodent Brain. Frontiers in Neuroscience. 13, 1105 (2019).
  24. McGarry, B. L., Jokivarsi, K. T., Knight, M. J., Grohn, O. H. J., Kauppinen, R. A. A Magnetic Resonance Imaging Protocol for Stroke Onset Time Estimation in Permanent Cerebral Ischemia. Journal of Visualized Experiments. , e55277 (2017).
  25. Uluc, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Akture, E., Baskaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. Journal of Visualized Experiments. , e1978 (2011).
  26. Boyko, M., et al. The effect of blood glutamate scavengers oxaloacetate and pyruvate on neurological outcome in a rat model of subarachnoid hemorrhage. Neurotherapeutics. 9, 649-657 (2012).
  27. Kuts, R., et al. A Middle Cerebral Artery Occlusion Technique for Inducing Post-stroke Depression in Rats. Journal of Visualized Experiments. , e58875 (2019).
  28. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. , e3564 (2012).
  29. Poinsatte, K., et al. Quantification of neurovascular protection following repetitive hypoxic preconditioning and transient middle cerebral artery occlusion in mice. Journal of Visualized Experiments. , e52675 (2015).
  30. . ImageJ, U. S. National Institutes of Health Available from: https://imagej.nih.gov/ij (2018)
  31. Boyko, M., et al. Pyruvate’s blood glutamate scavenging activity contributes to the spectrum of its neuroprotective mechanisms in a rat model of stroke. European Journal of Neuroscience. 34, 1432-1441 (2011).
  32. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
  33. . ImageJ, U. S. National Institutes of Health Available from: https://imagej.nih.gov/ij (1997)
  34. Kaplan, B., et al. Temporal thresholds for neocortical infarction in rats subjected to reversible focal cerebral ischemia. Stroke. 22, 1032-1039 (1991).
  35. Kumai, Y., et al. Postischemic gene transfer of soluble Flt-1 protects against brain ischemia with marked attenuation of blood-brain barrier permeability. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 27, 1152-1160 (2007).
  36. Schuleri, K. H., et al. Characterization of peri-infarct zone heterogeneity by contrast-enhanced multidetector computed tomography: a comparison with magnetic resonance imaging. Journal of the American College of Cardiology. 53, 1699-1707 (2009).
  37. Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative Stress: A Key Modulator in Neurodegenerative Diseases. Molecules. 24, (2019).
  38. Di Napoli, M. Caplan’s Stroke: A Clinical Approach. Journal of the American Medical Association. 302, 2600-2601 (2009).
  39. Deb, P., Sharma, S., Hassan, K. M. Pathophysiologic mechanisms of acute ischemic stroke: An overview with emphasis on therapeutic significance beyond thrombolysis. Pathophysiology. 17, 197-218 (2010).
  40. Simard, J. M., Kent, T. A., Chen, M., Tarasov, K. V., Gerzanich, V. Brain oedema in focal ischaemia: molecular pathophysiology and theoretical implications. Lancet Neurology. 6, 258-268 (2007).
  41. Klatzo, I. Pathophysiological aspects of brain edema. Acta Neuropathology. 72, 236-239 (1987).
  42. Yang, Y., Rosenberg, G. A. Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease. Stroke. 42, 3323-3328 (2011).
  43. Lin, T. N., He, Y. Y., Wu, G., Khan, M., Hsu, C. Y. Effect of brain edema on infarct volume in a focal cerebral ischemia model in rats. Stroke. 24, 117-121 (1993).
  44. Liu, C., et al. Increased blood-brain barrier permeability in contralateral hemisphere predicts worse outcome in acute ischemic stroke after reperfusion therapy. Journal of NeuroInterventional Surgery. 10, 937-941 (2018).
  45. Boyko, M., et al. Establishment of novel technical methods for evaluating brain edema and lesion volume in stroked rats: A standardization of measurement procedures. Brain Research. 1718, 12-21 (2019).

Tags

StrokeCerebral EdemaInfarct ZoneBlood-brain BarrierBBB PermeabilityMiddle Cerebral Artery OcclusionIschemic Brain InjuryTTC StainingImageJInfarct VolumeBrain EdemaTrichloroacetic AcidLuminescence Spectrophotometry

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Frank, D., Gruenbaum, B. F., Grinshpun, J., Melamed, I., Severynovska, O., Kuts, R., Semyonov, M., Brotfain, E., Zlotnik, A., Boyko, M. Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples. J. Vis. Exp. (164), e61309, doi:10.3791/61309 (2020).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image