Sistema de nanopartículas de membrana celular nativa para análise de interação proteína-proteína de membrana

As interações proteína-proteína (PPI) desempenham papéis fundamentais ao longo da biologia, desde a manutenção da estrutura e função das proteínas até a regulação de sistemas inteiros. Os PPIs vêm de muitas formas diferentes e podem ser categorizados com base em que tipos de interações formam. Uma dessas categorizações é homooligomerica ou heterooligomerica, baseada em se as interações são entre subunidades idênticas ou proteínas diferentes agindo como subunidades. Outra categorização baseia-se na força da interação se as interações levarem à formação de complexos estáveis ou estados complexos transitórios. Informações estruturais sobre os PPIs entre proteínas são cruciais na compreensão do mecanismo pelo qual as proteínas exercem sua função. Estima-se que mais de 80% das proteínas dependem de formação complexa para exercer suas funções funcionais¹. Dado que a porcentagem de proteínas observadas para depender de PPIs para o bom funcionamento inato seu significado na biologia é facilmente aparente, mas ser capaz de investigar adequadamente as proteínas que se envolvem nessas interações tem permanecido desafiador devido a limitações nas técnicas disponíveis para observar experimentalmente quando as proteínas estão formando PPIs.

Há um alto grau de discordância entre os resultados de muitos PPIs experimentalmente determinados devido à alta quantidade de ruídos, falsos positivos e falsos negativos que são derivados de muitas das técnicas de determinação do PPI atualmente disponíveis. Isto é particularmente para o sistema de leveduras dois híbridos (Y2H), espectrometria tandem affinity purificação-massa (TAP-MS) e transferência de energia de ressonância fluorescência (FRET), que representam três dos métodos mais utilizados para a determinação do PPI^2,3,4,5,6,7. Em comparação, técnicas de biologia estrutural proteica, como ressonância magnética nuclear (RMN), cristalografia de raios-X e microscopia eletrônica (EM), podem ser usadas para obter informações estruturais de alta resolução sobre interações proteína-proteína até o nível atômico e permitir a confirmação visual direta das interações ocorridas para uma proteína alvo de interesse. Todas as técnicas de pesquisa de determinação de PPI não estruturadas atualmente disponíveis (por exemplo, Y2H, TAP-MS e FRET) não têm essa capacidade e, além disso, sofrem com dificuldade em identificar interações fracas e transitórias entre as proteínas⁵. Essas deficiências são ainda mais aprimoradas ao estudar proteínas de membrana devido à complexidade adicional trazida pela variável adicional do ambiente lipídico que influencia a formação de estrutura quaternária adequada e montagem complexa heteromica.

As proteínas da membrana compõem uma grande parte do proteome e são conhecidas por desempenhar muitos papéis cruciais no bom funcionamento celular dentro de todos os organismos vivos. Apesar de as proteínas de membrana serem estimadas em 27% do genoma humano e constituir ~60% de todos os alvos atuais de medicamentos, há uma anomalia importante no número de modelos resolvidos para proteínas de membrana que compõem apenas ~2,2% de todas as estruturas proteicas publicadas^8,9,10. A principal causa da discrepância na disponibilidade de informações estruturais está nas propriedades intrínsecas das próprias proteínas de membrana. Devido à sua baixa solubilidade, dependência de interações com um ambiente lipídico para manter a estrutura e a função nativas, e várias propriedades físico-químicas da própria membrana lipídica, as proteínas da membrana continuam a representar um problema substancial ao implementar técnicas de biologia estrutural para estudá-las. Dessas propriedades intrínsecas, a mais importante para obter informações estruturais precisas é a exigência de ter interações com seu ambiente lipídico natural para que eles mantenham sua estrutura e função nativas. O ambiente lipídico é uma parte tão integral da estrutura e função das proteínas de membrana que o conceito de memteina (uma combinação das palavras membrana e proteína) tem sido proposto como a unidade fundamental da estrutura e função membrana-proteína¹¹. Apesar da importância das interações lipídica-proteínas, as técnicas de determinação do PPI atualmente disponíveis na estrutura exigem que as proteínas que estão sendo estudadas sejam solúveis ou solubilizadas com detergentes. A exposição a detergentes severos pode desnaturar as proteínas ou causar falsos positivos e negativos devido à delipidação, que pode induzir agregação, desnaturação de proteínas, dissociação de interações não covalentes e formação de estados oligomeóricos artificiais. Devido à necessidade de manter um ambiente lipídico natural para determinação precisa do estado oligomerico nativo das proteínas da membrana, desenvolvemos um sistema de nanopartículas de membrana celular nativa (NCMNs)¹² com base no método Styrene Maleic Acid Lipid Particles (SMALP)^13.

O SMALP usa copolímero de ácido estireno macho como polímero ativo de membrana para extrair e solubilizar proteínas de membrana. Poly (Styrene-co-Maleic Acid) (SMA) é um polímero anfílico único devido à sua moiety hidrofóbica e diametralmente oposta moiety ácido hidrofílico masculino. Ele forma nanopartículas por adsorviar, desestabilizar e interromper a membrana celular em um mecanismo dependente de pH¹⁴. Esta atividade funcional de SMA é o que permite que ela seja utilizada como um sistema livre de detergente para extração e solubilização de proteínas de membrana. O sistema NCMN é distinto do sistema SMALP em vários aspectos. A característica mais única do sistema NCMN é que ele possui uma biblioteca de polímeros ativos de membrana com uma infinidade de polímeros que têm propriedades únicas que os tornam adequados para o isolamento de muitas proteínas de membrana diferentes que requerem condições diferentes para estabilidade e funcionamento nativo. O sistema NCMN também tem protocolos diferentes em comparação com o método SMALP quando se trata de preparar as nanopartículas. Um exemplo é que os NCMNs utilizam uma purificação de coluna de afinidade de níquel de um passo único para determinação da estrutura de alta resolução; o efeito desses diferentes protocolos pode ser observado ao comparar o protocolo NCMNs, que gerou estruturas AcrB 3.2 e 3.0 Å crio-EM, com estudo semelhante utilizando o método SMALP, que resultou em uma estrutura crio-EM AcrB em uma resolução^12,15. Essas características únicas do sistema NCMN são as melhorias feitas no método SMALP previamente estabelecido e o tornam um candidato ideal para o estudo de PPIs.

O transporte multidroug efflux AcrB existe como homotrimer funcional em E. coli¹². Uma análise mutagênica sugeriu que uma única mutação de ponto P223G, localizada em um loop responsável pela estabilidade do aparador AcrB, desestabiliza o estado do aparador e produz um monômero AcrB quando preparado com o detergente DDM, que poderia ser detectado com eletroforese de gel azul nativo¹⁶. No entanto, a análise FRET do mutante AcrB-P223G sugeriu que quando no ambiente de bicamadas lipídicas da membrana celular nativa, a maioria dos mutantes AcrB-P223G ainda existiam como um aparador e que os níveis de expressão tanto para o tipo selvagem AcrB quanto para AcrB-P223G são semelhantes. No entanto, apesar dos resultados da análise do FRET, um ensaio de atividade para o transportador mutante mostrou que a atividade diminuiu drasticamente quando comparada com o tipo selvagem¹⁶. Embora a tecnologia FRET tenha sido popularmente utilizada para a análise de interações proteína-proteína, pesquisas têm mostrado que ela pode frequentemente dar falsos positivos^17,18,19,20.

Recentemente, foram determinadas estruturas crio-EM de alta resolução do aparador AcrB que mostraram a interação da AcrB com sua bicamada lipídica de membrana celular nativa associada através do uso das NCMNs¹². Em princípio, os NCMNs podem ser facilmente utilizados para a análise de interações proteína-proteína encontradas na membrana celular nativa. Em um teste deste sistema, foram realizados experimentos para observar diretamente o estado oligomerico de AcrB-P223G com o uso de nanopartículas de membrana celular nativa e microscopia eletrônica de coloração negativa. Para comparar com as nanopartículas AcrB do tipo selvagem, utilizamos a mesma membrana polímera ativa (SMA2000 fabricada em nosso laboratório, que é indexada como NCMNP1-1 na biblioteca NCMN) usada para determinação de estrutura crio-EM de alta resolução de AcrB e polímeros alternativos encontrados na biblioteca NCMNs¹². Com base nos resultados relatados anteriormente, esperava-se que a maioria do mutante AcrB-P223G existisse na forma de nanopartículas de membrana celular nativa trimeric²¹. No entanto, não foram encontrados aparadores AcrB presentes na amostra, como os observados com o tipo selvagem AcrB. Isso sugere que a maioria do AcrB-P223G não forma aparadores na membrana celular nativa como sugerido anteriormente.

Aqui relatamos uma análise detalhada do mutante E. coli AcrB-P223G em comparação com o tipo selvagem E. coli AcrB usando as NCMNs. Este estudo de caso da AcrB sugere que as NCMNs são um bom sistema para análise de interação proteína-proteína.