Membran Protein-Protein Etkileşim Analizi için Yerli Hücreli Membran Nanopartiküller Sistemi

Protein-protein etkileşimleri (ÜFE), proteinlerin yapısının ve işlevinin korunmasından tüm sistemlerin düzenlenmesine kadar biyoloji boyunca önemli roller oynar. PPI’lar birçok farklı biçimde gelir ve ne tür etkileşimler oluşturduklarına göre kategorize edilebilir. Bu kategorilerden biri homooligomerik veya heterooligomeriktir, etkileşimlerin özdeş alt biralar veya alt bira olarak hareket eden farklı proteinler arasında olup olmadığına dayanır. Başka bir kategori, etkileşimler istikrarlı komplekslerin veya geçici karmaşık durumların oluşumuna yol açıyorsa, etkileşimin gücüne dayanır. Proteinler arasındaki PPI’lar hakkında yapısal bilgiler, proteinlerin işlevlerini yerine getirme mekanizmasını anlamada çok önemlidir. Proteinlerin% 80’inden fazlasının fonksiyonel rollerini yerine getirmek için karmaşık oluşuma güvendiği tahmin edilmiştir¹. Doğru doğuştan gelen işleyiş için PPI’lara bağımlı olduğu gözlenen proteinlerin yüzdesinin biyolojideki önemi kolayca belirgindir, ancak bu etkileşimlere giren proteinleri düzgün bir şekilde araştırabilmek, proteinlerin PPI’ları oluştururken deneysel olarak gözlemlemek için mevcut tekniklerdeki sınırlamalar nedeniyle zor olmaya devam etmektedir.

Şu anda mevcut PPI belirleme tekniklerinin çoğundan elde edilen yüksek gürültü, yanlış pozitifler ve yanlış negatifler nedeniyle deneysel olarak belirlenen birçok PPI için sonuçlar arasında yüksek derecede anlaşmazlık vardır. Bu özellikle maya iki melez (Y2H) sistemi, tandem benzeşim saflaştırma-kütle spektrometresi (TAP-MS) ve ÜFE belirleme 2 ,³,⁴,^5,6,7için en sık kullanılan yöntemlerden üçünü temsil eden floresan rezonans enerji transferi (FRET) için böyledir. Buna karşılık, nükleer manyetik rezonans (NMR), X-ışını kristalografisi ve elektron mikroskopisi (EM) gibi protein yapısal biyoloji teknikleri, atom seviyesine kadar protein-protein etkileşimleri hakkında yüksek çözünürlüklü yapısal bilgiler elde etmek ve ilgi çekici bir hedef protein için meydana gelen etkileşimlerin doğrudan görsel olarak onaylanmasını sağlamak için kullanılabilir. Şu anda mevcut olan tüm yapı tabanlı olmayan ÜFE belirleme araştırma teknikleri (örneğin, Y2H, TAP-MS ve FRET) bu yetenekten yoksundur ve ayrıca proteinler arasındaki zayıf ve geçici etkileşimleri tanımlamakta zorlanmaktan muzdariptir⁵. Bu eksiklikler, uygun kuaterner yapı ve heteromerik kompleks montajın oluşumunu etkileyen lipid ortamının ek değişkeninin getirdiği ek karmaşıklık nedeniyle membran proteinleri incelerken daha da artmaktadır.

Membran proteinleri proteomun büyük bir kısmını oluşturan ve tüm canlı organizmalarda uygun hücre işleyişinde birçok önemli rol oynadığı bilinmektedir. Membran proteinlerinin insan genomunun% 27’sini oluşturduğu ve mevcut tüm ilaç hedeflerinin ~ % 60’ını oluşturduğu tahmin etmesine rağmen, yayınlanan tüm protein yapılarının sadece ~ 2.2’sini oluşturan membran proteinleri için çözülmüş modellerin sayısında büyük bir anormallik vardır^8,9,10. Yapısal bilgilerin mevcudiyetinde tutarsızlığın birincil nedeni, membran proteinlerinin içsel özelliklerinde yatmaktadır. Zayıf çözünürlükleri, yerel yapıyı ve işlevi korumak için lipid ortamı ile etkileşimlerine güvenmeleri ve lipid zarının kendisinin çeşitli fizikokimyasal özellikleri nedeniyle, membran proteinleri bunları incelemek için yapısal biyoloji tekniklerini uygularken önemli bir sorunu temsil etmeye devam eder. Bu içsel özelliklerden doğru yapısal bilgi elde etmek için en önemlisi, doğal lipit ortamlarıyla etkileşime sahip olmalarının doğal yapılarını ve işlevlerini korumaları gereksinimidir. Lipid ortamı, membran proteinlerinin yapısının ve işlevinin ayrılmaz bir parçasıdır, membin kavramı (membran ve protein kelimelerinin bir kombinasyonu) membran-protein yapısının ve işlevinin temel birimi olarak önerilmiştir¹¹. Lipid-protein etkileşimlerinin önemine rağmen, şu anda mevcut olan yapı tabanlı PPI belirleme teknikleri genellikle çalışılan proteinlerin çözünür olmasını veya deterjanlarla çözünür olmasını gerektirir. Sert deterjanlara maruz kalmak proteinleri denatüre edebilir veya toplama, proteinin denatürasyonu, yaygın olmayan etkileşimlerin ayrışması ve yapay oligomerik durumların oluşumuna neden olabilen delipidasyon nedeniyle yanlış pozitif ve negatiflere neden olabilir. Membran proteinlerinin doğal oligomerik durumunun doğru tespiti için doğal bir lipit ortamının korunmasının gerekliliği nedeniyle, daha önce bildirilen Stiren Maleik Asit Lipid Parçacıkları (SMALP)¹³ yöntemine dayanan bir Native Cell Membrane Nanopartiküls sistemi (NCMNs)¹² geliştirdik.

SMALP, membran proteinlerini ayıklamak ve çözündürmek için membran aktif polimer olarak stiren maleik asit kopolölçer kullanır. Poli(Stiren-ko-Maleik Asit) (SMA), hidrofobik stiren moiety ve diyametrik olarak hidrofilik maleik asit moiety’ye karşı olması nedeniyle benzersiz bir amfifilik polimerdir. pH’a bağımlı bir mekanizmada hücre zarını adsorbe ederek, istikrarsızlaştırarak ve bozarak nanopartiküller oluşturur¹⁴. SMA’nın bu fonksiyonel aktivitesi, membran protein ekstraksiyonu ve çözünürleştirme için deterjansız bir sistem olarak kullanılmasına izin veren şeydir. NCMN sistemi çeşitli yönlerden SMALP sisteminden farklıdır. NCMN sisteminin en benzersiz özelliği, stabilite ve doğal işleyiş için farklı koşullar gerektiren birçok farklı membran proteininin izolasyonuna uygun hale getiren benzersiz özelliklere sahip çok sayıda polimere sahip bir membran aktif polimer kütüphanesine sahip olmasıdır. NCMN sistemi, nanopartiküllerin hazırlanması söz konusu olduğunda SMALP yöntemine kıyasla farklı protokollere de sahiptir. Bu örneklerden biri, NCMN’lerin yüksek çözünürlüklü yapı belirleme için tek adımlı nikel benzeşim sütunu saflaştırması kullanmasıdır; Bu farklı protokollerin etkisi, 3.2 ve 3.0 şcryo-EM AcrB yapıları oluşturan NCMNs protokolü ile SMALP yöntemini kullanan benzer bir çalışma karşılaştırıldığında gözlenebilir, bu da 8.8 şçözünürlük^12,15‘te bir cryo-EM AcrB yapısı ile sonuçlandı. NCMN sisteminin bu benzersiz özellikleri, daha önce kurulan SMALP yönteminde yapılan iyileştirmelerdir ve PPI’lerin incelenmesi için ideal bir aday haline getirmektedir.

Multidrug efflux transporter AcrB, E. coli^12’defonksiyonel homotrimer olarak mevcuttur. Bir mutajenik analiz, AcrB trimerinin stabilitesinden sorumlu bir döngü üzerinde bulunan tek bir P223G nokta mutasyonunun, trimer durumunu istikrarsızlaştırdığını ve yerel mavi jel elektroforezi¹⁶ile tespit edilebilen deterjan DDM ile hazırlandığında bir AcrB monomer verdiğini öne sürdü. Bununla birlikte, AcrB-P223G mutantının FRET analizi, yerel hücre zarı lipid bilayer ortamındayken, mutant AcrB-P223G’nin çoğunluğunun hala bir trimer olarak var olduğunu ve hem vahşi tip AcrB hem de AcrB-P223G için ifade seviyelerinin benzer olduğunu öne sürdü. Yine de FRET analiz sonuçlarına rağmen, mutant taşıyıcı için bir aktivite tahlili, vahşi tip¹⁶ile karşılaştırıldığında aktivitenin önemli ölçüde azaldığını gösterdi. FRET teknolojisi protein-protein etkileşimlerinin analizi için popüler olarak kullanılmış olsa da, araştırmalar sıklıkla yanlış pozitifler verebileceğini göstermiştir^17,18,19,20.

Son zamanlarda, AcrB trimerinin yüksek çözünürlüklü kriyo-EM yapıları, NCMNs¹²kullanılarak AcrB’nin ilişkili doğal hücre zarı lipid bilayer ile etkileşimini gösteren belirlendi. Prensip olarak, NCMN’ler doğal hücre zarında bulunan protein-protein etkileşimlerinin analizi için kolayca kullanılabilir. Bu sistemin bir testinde, yerel hücre zarı nanopartikülleri ve negatif boyama elektron mikroskopisi kullanılarak AcrB-P223G’nin oligomerik durumunu doğrudan gözlemlemek için deneyler yapıldı. Vahşi tip AcrB nanopartikülleri ile karşılaştırmak için, NCMNs kütüphanesinde bulunan AcrB ve alternatif polimerlerin yüksek çözünürlüklü kriyo-EM yapısının belirlenmesi için kullanılan aynı membran aktif polimerini (NCMN kütüphanesinde NCMNP1-1 olarak indekslenen laboratuvarımızda yapılan SMA2000)^kullandık. Daha önce bildirilen sonuçlara dayanarak, AcrB-P223G mutantının çoğunluğunun trimerik yerel hücre zarı nanopartikülleri²¹şeklinde var olması bekleniyordu. Bununla birlikte, vahşi tip AcrB ile gözlenenler gibi örnekte hiçbir AcrB trimer bulunamadı. Bu, AcrB-P223G’nin çoğunluğunun daha önce önerildiği gibi yerel hücre zarında trimer oluşturmadığını göstermektedir.

Burada, NCMN’leri kullanan vahşi E. coli AcrB tipi ile karşılaştırıldığında mutant E. coli AcrB-P223G’nin ayrıntılı bir analizini rapor ediyoruz. AcrB’nin bu vaka çalışması, NCMN’lerin protein-protein etkileşim analizi için iyi bir sistem olduğunu göstermektedir.