Morfolojik ve Proteomik Analiz için Embriyonik Superior Servikal Ganglia'dan Sıçan Sempatik Nöronlarının Culturing
Summary
Bu yazı, embriyonik sıçan sempatik nöronların superior servikal gangliyondan izole ve kültürlenmesini açıklamaktadır. Ayrıca immünositokimyasal boyama ve kütle spektrometrik analizi için nöronal özler hazırlamak için ayrıntılı protokoller sağlar.
Abstract
Embriyonik sıçan üstün servikal gangliyonunsempatik nöronlar (SCG) aksonal büyüme, aksonal kaçakçılık, sinaptogenez, dendritik büyüme, dendritik plastitik plastisite ve eş-kültür sistemlerinde sinir hedef etkileşimleri incelemek için periferik nöronlar için bir in vitro model sistemi olarak kullanılmıştır. Bu protokol, E21 sıçan embriyolarının üstün servikal ganglinden nöronların izolasyonunu ve ayrıştırMalarını, ardından serumsuz ortamda saf nöronal kültürlerin hazırlanması nı ve bakımını açıklar. Nöronlar kaplamasız plastik yapışmaz olduğundan, nöronlar ya 12 mm cam kapakları veya poli-D-lizin ile kaplı 6-iyi plakalar kültürlü olacaktır. Bir antimitotik ajan (Ara-C, sitozin β-D-arabinofuranoside) ile yapılan tedavinin ardından, bu protokol% 5’ten az nöronal olmayan hücrelerile sağlıklı nöronal kültürler oluşturur, hangi in vitro bir ay boyunca muhafaza edilebilir. Embriyonik sıçan SCG nöronlar in vivo 5-8 dendritler ile multipolar olmasına rağmen; serumsuz koşullar altında, bu nöronlar kültürde sadece tek bir akson genişletmek ve kültür süresince tek kutuplu olmaya devam. Ancak, bu nöronlar bazal membran ekstresi varlığında dendritler uzatmak için indüklenebilir, kemik morfogenetik proteinler (BP), veya 10% fetal buzağı serum. Bu homojen nöronal kültürler immünositokimyasal boyama ve biyokimyasal çalışmalar için kullanılabilir. Bu yazıda ayrıca bu nöronlarda mikrotübül ilişkili protein-2 (MAP-2) için immünositokimyasal boyama ve kütle spektrometresi için nöronal ekstrelerin hazırlanması için optimize edilmiş protokol açıklanmaktadır.
Introduction
Embriyonik superior servikal gangliyondan (SCG) elde edilen sempatik nöronlar, büyüme faktörü bağımlılığı da dahil olmak üzere nöronal gelişimin birçok yönünü incelemek için yaygın olarak birincil nöronal kültür sistemi olarak kullanılmaktadır. nöron hedef etkileşimleri, nörotransmitter sinyalizasyon, aksonal büyüme, dendrite gelişimi ve plastisite, sinaptogenez ve sinir-hedef /nöron-glia etkileşimleri altında yatan sinyal mekanizmaları1,2,3,4,5,6,7,8,9. Onların küçük boyutuna rağmen (yaklaşık 10000 nöronlar / ganglia), gelişimi ve bu kültür sisteminin yaygın kullanımı için üç ana nedeni vardır i) sempatik zincirinde ilk ganglia olmak, onlar daha büyük, ve bu nedenle izole etmek daha kolay, sempatik ganglia geri kalanından daha10; ii) merkezi nöronlar aksine, SCG nöronlar oldukça nöral ibik türetilen tüm nöronlar ile homojen, benzer bir boyuta sahip, sinir büyüme faktörü bağımlılığı ve ne adrenerjik olmak. Bu onları morfolojik ve genomik çalışmalar için değerli bir model yapar10,11 ve iii) Bu nöronlar bir ay boyunca sinir büyüme faktörü içeren tanımlanmış bir serum içermeyen ortamda muhafaza edilebilir10,12. Perinatal SCG nöronlar yoğun olarak dendritlerin başlatılması ve bakımı altında yatan mekanizmaları incelemek için kullanılmıştır2. Bunun başlıca nedeni, SCG nöronlar in vivo geniş bir dendritik arbor olmasına rağmen, onlar serum yokluğunda in vitro dendritler uzatmak yok ama kemik morfogenetik proteinler 2 gibi bazı büyüme faktörlerinin varlığında dendritler büyümeye indüklenebilir2,12,13.
Bu yazıda embriyonik sıçan SCG nöronların izole ve culturing için protokol açıklanmaktadır. Son 50 yıl içinde, SCG birincil nöronal kültürler ağırlıklı olarak büyük ölçekli genomik veya proteomik değişiklikleri inceleyen çalışmalar sınırlı sayıda morfolojik çalışmalar için kullanılmıştır. Bunun başlıca nedeni düşük miktarda DNA veya proteinin izole edilmesiyle sonuçlanan küçük doku boyutudur, bu da bu nöronlar üzerinde genomik ve proteomik analizlerin gerçekleştirilmesini zorlaştırır. Ancak, son yıllarda, artan algılama duyarlılığı dendritik büyüme gelişimi sırasında SCG nöronlarda genom, miRNom ve proteom incelemek için yöntemlerin geliştirilmesini sağlamıştır14,15,16,17. Bu yazı da immünositokimya ve kütle spektrometrik analizi için nöronal protein özleri elde etmek için bir protokol kullanarak bu nöronların morfolojik analizi için yöntem açıklayacağız.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazı, embriyonik sıçan yavrularının üstün servikal gangliyonundan sempatik nöronların kültürlendirilmesi için protokolleri açıklamaktadır. Bu model sistemi kullanmanın avantajları, büyüme faktörlerine benzer bir yanıt veren nöronların homojen bir popülasyon elde etmek mümkün olmasıdır, ve bu nöronlar için büyüme faktörü gereksinimleri iyi karakterize olduğundan, serumsuz koşullar altında, tanımlanmış ortamda vitro bu nöronlar büyümek mümkündür10. Pr…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Saint Mary’s College of California’daki Fakülte Geliştirme Fonu ve Yaz Araştırma Programı hibesi tarafından desteklenmiştir. Yazarlar ayrıca Davis California Üniversitesi’nden Dr. Pamela Lein’e ve UC Berkeley Kütle spektrometresi tesisinden Dr. Anthony Iavarone’ye bu protokollerin geliştirilmesi sırasında ki tavsiyeleri için teşekkür etmek isterler. Yazarlar ayrıca Video prodüksiyonu ve kurgusu ndaki yardımları için Saint Mary’s College of California’daki College Communications OfisindeHaley Nelson’a teşekkür etmek istiyor.
Materials
| 2D nanoACQUITY | Waters Corporation | ||
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| BMP-7 | R&D Systems | 354-BP | |
| Bovine Serum Alumin | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| Cell scraper | Corning | CLS-3010 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | 4176 | |
| Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates | Fisher Scientific | 07-200, 140675, 142475 | |
| Cytosine- β- D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free) | ATCC | 30-2200 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 15230 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| DMEM – Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11885 | |
| Fatty Acid Free BSA | Calbiochem | 126609 | 20 mg/mL stock in low glucose DMEM |
| Fine forceps Dumont no.4 and no.5 | Ted Pella Inc | 5621, 5622 | |
| Forceps and Scissors for Dissection | Ted Pella Inc | 1328, 1329, 5002 | |
| Glass coverlips – 12mm | Neuvitro Corporation | GG-12 | |
| Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated | Thermo Fisher Scientific | A32723 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765 | |
| Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free) | Thermo Fisher Scientific | 14185 | |
| Insulin-Selenium-Transferrin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | |
| Leibovitz L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Mounting media for glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | P36931, P36934 | |
| Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52) | BioLegend | SMI 52 | |
| Nerve growth factor | Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts) | BT5017 | Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM |
| Paraformaldehye | Spectrum Chemicals | P1010 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Prionex | Millipore | 529600 | 10% solution, 100 mL |
| RapiGest SF | Waters Corporation | 186001861 | 5 X 1 mg |
| Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry | Waters Corporation | ||
| Trifluoro acetic acid – Sequencing grade | Thermo Fisher Scientific | 28904 | 10 X 1 mL |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin | Promega or NEB | V511A, P8101S | 100 μg or 5 X 20 mg |
| Waters Total recovery vials | Waters Corporation | 186000385c |
Referencias
- Rees, R. P., Bunge, M. B., Bunge, R. P. Morphological Changes in the neuritic growth cone and target neuron during synaptic junction development in culture. Journal of Cell Biology. 9, (1976).
- Chandrasekaran, V., Lein, P. J. Regulation of Dendritogenesis in Sympathetic Neurons. Autonomic Nervous System. , (2018).
- Higgins, D., Burack, M., Lein, P., Banker, G. Mechanisms of neuronal polarity. Current Opinion in Neurobiology. 7 (5), 599-604 (1997).
- Lein, P., Guo, X., Hedges, A. M., Rueger, D., Johnson, M., Higgins, D. The effects of Extracellular Matrix And Osteogenic Protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. International Journal of Developmental Neuroscience. 14 (3), 203-215 (1996).
- Kobayashi, M., Fujii, M., Kurihara, K., Matsuoka, I. Bone morphogenetic protein-2 and retinoic acid induce neurotrophin-3 responsiveness in developing rat sympathetic neurons. Molecular Brain Research. 53 (1-2), 206-217 (1998).
- Burnham, P., Louis, J. C., Magal, E., Varon, S. Effects of ciliary neurotrophic factor on the survival and response to nerve growth factor of cultured rat sympathetic neurons. Biología del desarrollo. 161 (1), 96-106 (1994).
- Hou, X. E., Li, J. Y., Dahlström, A. Clathrin light chain and synaptotagmin I in rat sympathetic neurons. Journal of the Autonomic Nervous System. 62 (1-2), 13-26 (1997).
- Harris, G. M., et al. Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix. Matrix Biology. , 176-189 (2017).
- Wingerd, K. L., et al. α4 integrins and vascular cell adhesion molecule-1 play a role in sympathetic innervation of the heart. Journal of Neuroscience. 22 (24), 10772-10780 (2002).
- Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D. J., Johnson, M., Banker, G., Goslin, K. Tissue culture of autonomic neurons. Culturing Nerve Cells. , 177-205 (1991).
- Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15 (3), 597-605 (1995).
- Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. Biología del desarrollo. 128 (2), 337-348 (1988).
- Voyvodic, J. T. Development and regulation of dendrites in the rat superior cervical ganglion. The Journal of Neuroscience. 7 (3), 904-912 (1987).
- Garred, M. M., Wang, M. M., Guo, X., Harrington, C. A., Lein, P. J. Transcriptional Responses of Cultured Rat Sympathetic Neurons during BMP-7-Induced Dendritic Growth. PLoS ONE. 6 (7), 21754 (2011).
- Pravoverov, K., et al. MicroRNAs are Necessary for BMP-7-induced Dendritic Growth in Cultured Rat Sympathetic Neurons. Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 917-934 (2019).
- Natera-Naranjo, O., Aschrafi, A., Gioio, A. E., Kaplan, B. B. Identification and quantitative analyses of microRNAs located in the distal axons of sympathetic neurons. RNA (New York, N.Y.). 16 (8), 1516-1529 (2010).
- Aschrafi, A., et al. Angiotensin II mediates the axonal trafficking of tyrosine hydroxylase and dopamine β-hydroxylase mRNAs and enhances norepinephrine synthesis in primary sympathetic neurons. Journal of Neurochemistry. 150 (6), 666-677 (2019).
- Ghogha, A., Bruun, D. a., Lein, P. J. Inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons. Journal of Visualized Experiments. (61), 4-8 (2012).
- Caceres, A., Banker, G., Steward, O., Binder, L., Payne, M. MAP2 is localized to the dendrites of hippocampal neurons which develop in culture. Brain Research. 315 (2), 314-318 (1984).
- Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neuroscience Letters. 245 (3), 131-134 (1998).
- Mi, H., et al. PANTHER version 11: Expanded annotation data from Gene Ontology and Reactome pathways, and data analysis tool enhancements. Nucleic Acids Research. 45, 183-189 (2017).
- Chandrasekaran, V., et al. Retinoic acid regulates the morphological development of sympathetic neurons. Journal of Neurobiology. 42 (4), (2000).
- Courter, L. A., et al. BMP7-induced dendritic growth in sympathetic neurons requires p75 NTR signaling. Developmental Neurobiology. 76 (9), 1003-1013 (2016).
- Lein, P. J., Fryer, A. D., Higgins, D. Cell Culture: Autonomic and Enteric Neurons. Encyclopedia of Neuroscience. , 625-632 (2009).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9 (1), 82 (2016).
- Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), e3200 (2011).
- Takeuchi, A., et al. Microfabricated device for co-culture of sympathetic neuron and iPS-derived cardiomyocytes. Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. 2013, 3817-3820 (2013).
- Takeuchi, A., et al. Development of semi-separated co-culture system of sympathetic neuron and cardiomyocyte. Proceedings of the 31st Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society: Engineering the Future of Biomedicine, EMBC 2009. , 1832-1835 (2009).
- Chandrasekaran, V., Lea, C., Sosa, J. C., Higgins, D., Lein, P. J. Reactive oxygen species are involved in BMP-induced dendritic growth in cultured rat sympathetic neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 67, (2015).
- Kim, W. Y., et al. Statins decrease dendritic arborization in rat sympathetic neurons by blocking RhoA activation. Journal of Neurochemistry. 108 (4), 1057-1071 (2009).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: Primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
- Szpara, M. L., et al. Analysis of gene expression during neurite outgrowth and regeneration. BMC Neuroscience. 8 (1), 100 (2007).
- Pop, C., Mogosan, C., Loghin, F. Evaluation of rapigest efficacy for the digestion of proteins from cell cultures and heart tissue. Clujul Medical. 87 (4), 5 (2014).
- Vit, O., Petrak, J. Integral membrane proteins in proteomics. How to break open the black box. Journal of Proteomics. 153, 8-20 (2017).
